本發(fā)明涉及一種crispr/cas12a介導的級聯(lián)凝血酶信號放大檢測方法，屬于生物分析化學與傳感。

背景技術：

1、凝血酶是一種能將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的多功能絲氨酸蛋白酶，在凝血級聯(lián)反應中起重要作用。它是凝血障礙和多種病理過程重要標志物。凝血酶在生理過程中的作用取決于其濃度。在正常凝血過程中，血液中凝血酶的濃度通常范圍在納摩爾（nm）到低微摩爾（μm）水平。然而，在患有凝血障礙的患者中，這一濃度可能低至皮摩爾（pm）水平。其濃度的失衡可能導致多種疾病，包括血栓、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化和肝病等。因此，開發(fā)出高靈敏度、高選擇性的凝血酶檢測方法至關重要。傳統(tǒng)的免疫分析方法，如酶活性法和酶聯(lián)免疫吸附法，存在抗原和樣本量大、反應時間長、成本高等局限性。

2、核酸適配體是一種有效的功能核酸探針，能夠高特異性地識別凝血酶等目標分子。它們具備體積小、易于修飾、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，常用于生物傳感器中。apt15和apt29是常用的適配體，可與凝血酶的不同位點結合。近年來，基于適配體的三明治型測定法（如sers、熒光、比色等）已廣泛應用于凝血酶檢測，但這些方法通常面臨檢測限差、測量時間長、樣品制備復雜等問題。

3、crispr/cas系統(tǒng)是一種細菌和古細菌的適應性免疫系統(tǒng)，能特異性切割靶標核酸。特別是lbcas12a在與靶dna結合后表現(xiàn)出的“反式切割”活性，使其成為信號放大中一種強大的工具。例如zhu等人將apt29適配體鏈接了一段cas12a的激活dna序列（apt29-acdna），apt15適配體被修飾在基板上，凝血酶誘導apt29-acdna?-凝血酶-apt15三明治結構的形成，因此在洗滌后加入cripsr/cas12a體系后，三明治結構中的acdna會激活cas12a的反式切割活性，進而對底物進行切割，實現(xiàn)凝血酶的信號放大和輸出【analytical?chimica?acta2024,?1287,?342106】。然而在上述實驗中，一個凝血酶只能形成一個三明治結構，鏈接一個acdna，致使信號放大受限。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術的不足而提供一種crispr/cas12a介導的級聯(lián)凝血酶信號放大檢測方法，通過將crispr/cas12a激活dna（acdna）和凝血酶適配體apt15共同修飾于金納米粒子表面，一個金顆粒表面可以修飾上百個acdna，實現(xiàn)了凝血酶的一級信號放大，之后acdna激活crispr/cas12a體系中cas12a的酶活性，切割fq-dna，使其熒光基團和淬滅基團分離，熒光信號增強，從而實現(xiàn)二級信號放大。

2、本發(fā)明提供一種crispr/cas12a介導的級聯(lián)信號放大適配體傳感器用于凝血酶靈敏檢測的方法，包括以下步驟：

3、步驟1、球形核酸探針的制備，將適配體apt15與acdna共同修飾于金納米粒子（aunps）上，制備球形核酸探針aunps-apt15/acdna；

4、步驟2、功能化磁性微粒的制備，將適配體apt29修飾到磁性微粒上，制備獲得磁性微粒-apt29；

5、步驟3、凝血酶檢測，將修飾了核酸適配體apt29的磁性微粒與不同濃度凝血酶混合孵育，實現(xiàn)目標蛋白凝血酶的捕捉，之后加入aunps-apt15/acdna球形核酸探針并進行孵育，形成磁性微粒/凝血酶/金納米顆粒的三明治夾心結構；

6、步驟4、配制cripsr/cas12a體系，將特定acdna對應的crrna、cas12a蛋白于緩沖溶液中混合，配制成cripsr/cas12a體系；

7、步驟5、凝血酶信號輸出與二級信號放大，向步驟3的檢測溶液中加入步驟4的cripsr/cas12a體系以及熒光基團和淬滅基團雙標記的報告探針fq-ssdna，進行靶標識別以及信號轉化；

8、步驟6、采集步驟5溶液的熒光信號，建立熒光發(fā)光強度與凝血酶濃度之間的線性關系。

9、本發(fā)明提供一種利用crispr/cas12a實現(xiàn)信號級聯(lián)放大的凝血酶檢測方法，將crispr/cas12a激活dna（acdna）和凝血酶適配體apt15共同修飾于金納米粒子表面，同時將凝血酶適配體apt29修飾于磁性微粒表面。凝血酶存在時，金顆粒和磁性微粒由于適配體的識別作用會形成三明治結構，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明一個金顆粒表面可以修飾上百個acdna，從而實現(xiàn)了一級信號放大；在后續(xù)加入crispr/cas12a體系后，這些acdna會激活cas12a的酶活性，進而可以對fq-dna進行切割，使得f和q基團分離，致使熒光信號增強，從而實現(xiàn)二級信號的放大。同時，本發(fā)明使用磁性微粒作為支撐材料，由于反應發(fā)生在溶液中，克服了適配體和凝血酶在固體底物上引起的擴散限制動力學而導致的反應緩慢的問題。

10、作為本發(fā)明進一步優(yōu)化的技術方案如下：

11、所述步驟1中，金納米粒子aunps的粒徑為13nm，由檸檬酸修飾，其制備方法參考文獻【liu?j,?lu?y.?nature?protocols,?2006,?1(1):?246-252.】；準備acdna和apt15兩條dna鏈，固定aunps和修飾dna的總量（acdna+apt15）為1:500不變，改變acdna和apt15的相對量，參照文獻【hao?y,?li?y,?song?l,?et?al.?jacs,?2021,?143(8):?3065-3069.】制備基于aunps的覆蓋有不同acdna和apt15量的球形核酸，具體地球形核酸探針中apt15與acdna的摩爾比為1:0.5～1:3。

12、所述步驟2中，洗滌磁性微粒，將磁性微粒重懸，之后磁分離2min，移去上清，用100ul?25mm?mes(ph=5)清洗磁性微粒，并在充分混合的情況下培養(yǎng)10min，重復3次；

13、加入適配體apt29于洗滌過的磁性微粒，混合均勻，在室溫下孵育30?min；加入30ul?100?mg/ml?edc，混合均勻；加入10?ul的25?mm?（ph=5）?mes溶液，最終體積為100?ul，在室溫下培養(yǎng)5h；通過羧基-氨基相互作用將apt29凝血酶適配體固定在磁性微粒表面。磁分離，去上清，重懸于100?ul?pbst(含0.05%吐溫20)緩沖液中，加入5?ul?superblock?(pbs)緩沖液進行封閉處理30?min；用100?ul?pbst緩沖液洗滌4次，最后重懸于400?ul?pbst緩沖液中，于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

14、所述步驟2中，每毫克磁性微粒上修飾0.07?pm～700?pm?apt29。

15、所述步驟3中，向修飾核酸適配體apt29的磁性微粒中加入不同濃度的目標蛋白凝血酶進行孵育，磁分離、除上清，再將獲得的沉淀與步驟1中制備的具有不同apt15與acdna摩爾比的球形核酸探針進行孵育，形成磁性微粒/凝血酶/aunps-apt15/acdna三明治夾心結構。

16、所述步驟4中，配制cripsr/cas12a體系，cas12a蛋白購買于蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，緩沖溶液為10×neb?buffer??r2.1，購自new?england?biolabs（美國）；crrna與cas12a蛋白的摩爾比15:10。

17、所述步驟5中，向形成磁性顆粒/凝血酶/aunps-apt15/acdna三明治夾心結構的溶液中加入cripsr/cas12a體系以及熒光基團f和淬滅基團q雙標記的dna（fq-dna）進行切割，孵育60min，進行靶標識別以及信號輸出。

18、所述步驟6中，通過熒光分光光度計測定熒光信號的強度變化實現(xiàn)凝血酶的檢測，所用熒光分光光度計型號為fl-?8500購于美國的perkinelmer。

19、優(yōu)選地，所述acdna的序列為sh-aat?atg?tca?tta?tgt?gct?gcc?ata?tct?acttca?gaa?act。

20、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明采用acdna和apt15共同修飾的金納米粒子與apt29修飾的磁性微粒、凝血酶共同作用形成三明治夾心結構，使得金納米粒子表面能夠修飾上百個acdna，不受一個凝血酶只能鏈接一個acrna的限制，實現(xiàn)信號一級放大，上百個acdna激活crispr/cas12a體系中cas12a蛋白的酶活性，分割熒光基團和淬滅基團，增強熒光信號的強度，進一步放大凝血酶信號。

21、與以前的方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點是在納米顆粒表面共修飾大量檢測適配體和crispr/cas12a體系的激活acdna，實現(xiàn)了靶標信號的高效放大，無需擴增和額外酶，提高了檢測穩(wěn)定性，簡化了操作，降低了實驗成本。值得注意的是，本發(fā)明還利用了cas12a的順式活性，識別目標后，共修飾的活性dna通過順式切割過程從納米顆粒表面部分釋放，增加了剩余活性dna的反應空間，使釋放的活性dna/crrna/cas12a復合物能夠更有效地切割溶液中的報告dna。