本發(fā)明涉及植物基因及其編碼蛋白與應用，特別是涉及一種甜瓜葉形控制基因cmsl及其編碼蛋白與應用。與該基因或編碼蛋白相關的生物材料可用于創(chuàng)制葉形變異的甜瓜材料。

背景技術：

1、甜瓜(cucumis?melo?l.)是一種重要的園藝經(jīng)濟作物。葉片是甜瓜的重要功能器官，不同的甜瓜品種其葉片形狀多種多樣，常見的有圓形、心形、腎形以及葉緣缺刻深淺不同而形成的裂葉類型。葉片形態(tài)是甜瓜株型的重要構成因素，不同葉片大小、形狀直接影響甜瓜的種植密度，影響甜瓜的品質和產(chǎn)量。克隆甜瓜的葉形控制基因對于培育理想株型甜瓜，進而提高甜瓜的品質和產(chǎn)量具有重要意義。

2、國外從20世紀90年代開始開展葉片發(fā)育的機制研究，在擬南芥、番茄和水稻等模式植物中揭示了大量與葉片形態(tài)建成相關的基因。在葫蘆科作物中，wei等人利用商品西瓜雜交種構建裂葉和非裂葉分離群體進行遺傳分析，并定位了一個西瓜裂葉基因clll1，推測一個未知功能蛋白和一個同源框-亮氨酸拉鏈蛋白是最可能的候選基因(wei?et?al.,2017)。jiang等利用基因編輯技術敲除了gras家族的lateral?suppressor的同源基因clls獲得了圓葉西瓜突變體(jiang?et?al.,2023)。zhang等從黃瓜自交系ccmc的ems突變體庫中，鑒定了兩份圓葉等位突變體c356和c949，基因定位表明一個編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的cspid基因為目的基因(zhang?etal.,2018)。gao等以掌狀裂葉自然突變體bm7為材料對甜瓜掌狀裂葉基因pll進行了精細定位，推測一個注釋為ant轉錄因子的基因為最佳候選基因(gao?et?al.,2014)?；谝陨戏治?，甜瓜中尚無葉形相關基因功能研究的報道，制約了葉形相關基因在甜瓜中的應用。

3、yabby家族是一類植物特異性轉錄因子家族,其成員在植物生長、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中起著至關重要的作用。yabby基因家族歸屬于鋅指蛋白超家族的亞家族，家族包c2h2鋅指蛋白與yabby結構域，分別位于c鏈n端與c端，兩者之間具有極強的保守性。在西紅柿、擬南芥等植物中，yabby基因家族包含5個亞族，分別為crc、fil/yab3、ino、yab2與yab5。其中，fil、yab2和yab3在地上側生器官原基中表達，特異性地決定側生器官遠軸端細胞的命運，fil、yab2、yab3和yab5在擬南芥葉發(fā)育過程中表現(xiàn)出功能冗余，主要在營養(yǎng)組織中特異表達；而crc和ino在花器官中特異表達，crc基因主要調控擬南芥的心皮和蜜腺的發(fā)育，ino基因在擬南芥胚珠發(fā)育過程中發(fā)揮重要的功能。而甜瓜中yabby家族基因功能并未完全闡明，急需對相關基因開展相關功能鑒定，以更好的在育種中利用這些基因。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種甜瓜葉形控制基因cmsl及其編碼蛋白與應用。本發(fā)明具體實例中利用crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)對甜瓜材料基因組中的基因cmsl進行編輯，進而使所述cmsl基因功能喪失，得到葉形變異的甜瓜材料。從而證明基因cmsl發(fā)生突變后可產(chǎn)生葉形變異的甜瓜新品種。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

3、本發(fā)明第一方面提供了控制甜瓜葉形的蛋白質cmsl，具有如下(1)至(3)任一項所述的氨基酸序列：

4、(1)如序列表中序列4所示氨基酸序列；

5、(2)序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸的添加、取代或缺失而衍生的氨基酸序列，且衍生的氨基酸序列具有調控甜瓜葉形的功能；

6、(3)來源于甜瓜、與(1)或(2)的氨基酸序列至少具有90％以上(比如91％、93％、95％、97％、98％或99％)同源性且具有控制甜瓜葉形的功能的氨基酸序列；

7、所述控制甜瓜葉形包括控制甜瓜的葉緣無缺刻。也就是說，蛋白質cmsl調控甜瓜葉形比如調控甜瓜的葉緣形狀，當甜瓜中含有蛋白質cmsl時，甜瓜的葉緣無缺刻，該蛋白質由245個氨基酸殘基組成。

8、所述葉緣無缺刻是指成熟葉片的葉緣沒有深淺不一的凹凸形態(tài)，比如葉緣為全緣和/或有均勻的細鋸齒，鋸齒深度優(yōu)選不超過0.5cm。

9、進一步地，所述控制甜瓜葉形還可以包括控制成熟甜瓜葉片的長寬比，葉片的長寬比(長度最大值與寬度最大值的比)優(yōu)選為0.79～0.83或者表示為(0.81±0.02)。

10、本發(fā)明第二方面提供了甜瓜葉形控制基因cmsl，其cdna的核苷酸序列為如下(a1)至(a3)中的任意一種：

11、(a1)編碼本發(fā)明第一方面的所述氨基酸序列的dna序列；

12、(a2)如序列表中序列3所示的dna序列；

13、(a3)在嚴格條件下與(a1)所述的dna序列雜交且編碼控制甜瓜葉形功能的蛋白質分子的dna序列；

14、所述控制甜瓜葉形包括控制甜瓜的葉形為葉緣無缺刻。

15、所述的葉緣無缺刻是指成熟葉片的葉緣沒有深淺不一的凹凸形態(tài)，比如葉緣為全緣和/或僅有均勻的細鋸齒，鋸齒深度優(yōu)選不超過0.5cm。

16、進一步地，所述控制甜瓜葉形還可以包括控制成熟甜瓜葉片的長寬比，葉片的長寬比優(yōu)選為0.79～0.83或者表示為(0.81±0.02)。

17、本發(fā)明第三方面提供與本發(fā)明第一方面所述的蛋白質或與本發(fā)明第二方面所述的基因相關的生物材料，所述生物材料選自如下(a)或(b)：

18、(a)用于沉默、抑制或敲除本發(fā)明第一方面所述蛋白質cmsl的編碼基因或本發(fā)明第二方面所述基因的物質；

19、(b)用于降低或抑制甜瓜中本發(fā)明第一方面所述蛋白質cmsl的活性和/或含量的物質。

20、本發(fā)明第三方面的生物材料可以是實現(xiàn)(a)或(b)所述功能的任意材料，從效率和操作上來考慮，所述生物材料優(yōu)選為甜瓜crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)，包括：重組表達載體，所述重組表達載體包括cas9表達盒、sgrna表達盒，所述cas9表達盒表達cas9，sgrna表達盒表達sgrna，所述sgrna的靶標基因為甜瓜中蛋白質cmsl的編碼基因；

21、進一步地，所述sgrna的靶標序列為序列表中序列5所示的dna分子，或者所述sgrna的靶標序列為序列表中序列5所示序列的反向互補序列。

22、所述生物材料還可以是含有上述重組表達載體的轉基因細胞系、含有上述重組表達載體的宿主菌等可用于基因編輯的產(chǎn)品。另外，從基因編輯系統(tǒng)轉化后得到的甜瓜材料中篩選出發(fā)生預期基因突變材料所使用的用于擴增cmsl基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護范圍。

23、在本發(fā)明的具體實施方式中，含有上述重組表達載體的宿主菌為含有重組表達載體pbse401::cmsl的農(nóng)桿菌eha105。

24、本發(fā)明第四方面提供了本發(fā)明第三方面所述生物材料在創(chuàng)制葉形變異的甜瓜材料或甜瓜育種中的應用，所述葉形變異的甜瓜材料為葉緣有缺刻的葉形變異的甜瓜材料。

25、本發(fā)明中所述的葉緣有缺刻是指葉緣存在深淺不一的凹凸形態(tài)，缺刻明顯。

26、本發(fā)明第五方面提供了一種改變甜瓜葉形的方法，所述方法包括：利用本發(fā)明第三方面所述生物材料使所述cmsl功能喪失，從而得到葉形變異的甜瓜材料。

27、優(yōu)選地，所述方法包括，利用上述甜瓜crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)對待改變葉形的甜瓜材料基因組中的基因cmsl進行編輯，進而使所述cmsl功能喪失，得到葉形變異的甜瓜材料。

28、進一步地，所述葉形改變的甜瓜材料為葉緣有缺刻的甜瓜材料。

29、在本發(fā)明第五方面的方法中，作為一種優(yōu)選方式，所述方法具體包括：

30、s1：向所述待改變葉形的甜瓜材料中導入上述甜瓜crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)，通過篩選得到轉化成功的植株；

31、s2：通過鑒定從所述轉化成功的植株中獲得基因cmsl突變株系；

32、所述鑒定為以轉化成功的植株的基因組作為模板進行基因cmsl片段的pcr擴增，然后通過凝膠電泳或者測序的方法檢測以得到基因cmsl突變的株系。

33、進一步地，所述pcr擴增采用的引物對如序列表中序列10和序列11。

34、在本發(fā)明第五方面中，所述待改變葉形的甜瓜材料是基因組中含有基因cmsl的甜瓜材料，比如甜瓜材料m6。

35、借由上述技術方案，本發(fā)明至少具有如下明顯的有益效果：

36、(1)本發(fā)明提供了一個甜瓜基因(開放閱讀框核苷酸序列如序列3中第136位至第873位核苷酸序列所示)及其編碼的蛋白(氨基酸序列如序列4所示)。經(jīng)過基因編輯技術確定該基因可以控制或調控甜瓜葉形，比如調控甜瓜葉緣和/或葉片長寬比，在控制葉緣的形狀方面，該基因的突變將導致全緣葉形或葉緣為均勻細鋸齒狀的無缺刻葉形變?yōu)槿~緣有明顯缺刻的葉形。在葉片長寬比方面，該基因的突變將導致葉片長寬比顯著變小。

37、(2)利用基因編輯技術，通過對甜瓜中cmsl基因進行編輯，可導致甜瓜葉形的改變。因而該基因有控制葉形的作用?；谠摶虻淖饔?，可以直接通過基因編輯技術使相應甜瓜品種中的基因cmsl發(fā)生突變，然后通過與純合的基因cmsl突變植株進行常規(guī)雜交，并通過分子標記輔助選擇獲得葉形變異甜瓜的優(yōu)良品種；或者通過基因工程將該基因cmsl轉入特定甜瓜內，進而對該基因進行編輯，造成該基因突變來獲得葉形改變的甜瓜材料，然后利用基因突變后的材料進行有性雜交從后代群體中分離出葉形改變的甜瓜材料。，利用cmsl基因可對甜瓜的葉形進行改良，具有重要的理論和應用價值。

38、總之，本發(fā)明的基因編輯方法可以快速、有效地將甜瓜葉緣無缺刻的葉形材料轉變?yōu)槿~緣有缺刻的葉形變異的甜瓜材料，為創(chuàng)制葉形多樣的甜瓜材料提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑，在甜瓜新品種培育中具有重要的應用價值和市場前景。