本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及靶向敲除hla-g異構體基因的基因編輯系統(tǒng)和應用。

背景技術：

1、人類白細胞抗原-g(human?leukocyte?antigen-g，hla-g)屬于非經典的hla?i類分子，該基因位于第6號染色體6p21.3區(qū)，全長約6.0kb。hla-g初始轉錄物經選擇性剪接后至少產生7種信使rna(messengerrna,mrna)，分別編碼如圖1所示的至少7種蛋白質異構體分子，包括4種膜結合型hla-g1～-g4和3種可溶性hla-g5～-g7，以及新型的hla-g異構體等。

2、在圖1所示的蛋白質翻譯過程中，hla-g?mrna第1外顯子編碼信號肽(signalpeptides,sp)，第2、3和第4外顯子分別編碼細胞外區(qū)的α1、α2和α3結構域，第5位外顯子編碼跨膜區(qū)(transmembrane?region,tm)；第6外顯子編碼僅含6個氨基酸殘基的hla-g分子胞內段；由于外顯子6內含有終止密碼子(tga)，第7、第8外顯子對應于hla-g基因的非翻譯區(qū)(3′-untranslatedregion,3′utr)。

3、hla-g1是由全長hla-g?mrna編碼，結構上類似于hlai類抗原，包含α1、α2、α3結構域。hla-g2缺乏α2結構域。hla-g3缺乏α2和α3結構域。hla-g4缺乏α3結構域。hla-g5及hla-g6胞外區(qū)結構域分別與hla-g1及hla-g2相同，但它們由含有內含子4的hla-g?mrna編碼，因內含子4中含有終止密碼子(taa)，所編碼的蛋白分子缺乏由外顯子5所編碼的跨膜區(qū)，形成可溶性hla-g分子。編碼hla-g7的mrna由于內含子2中含有終止密碼子(taa)，胞外區(qū)僅含α1結構域及由內含子2所編碼的2個氨基酸殘基相連。hla-g1～-g7等異構體的分子量約為39kd、31kd、23kd、30kd、37kd、27kd及17kd等。

4、相對于經典的hlai類分子，hla-g具有獨特的啟動子區(qū)域、基因多態(tài)性有限、嚴格的組織分布以及提呈抗原種類單一等特點。生理條件下，hla-g分子限制性分布于免疫豁免組織，如母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細胞、胸腺、角膜、胰島等。臨床上，發(fā)現(xiàn)hla-g在病理組織中如腫瘤、器官移植、自身免疫疾病、炎癥、病毒感染等特異性表達上調；且hla-g表達量高低與腫瘤患者的臨床分期、預后、生存時間等密切相關。功能上，hla-g是機體內一種重要的免疫耐受分子，可通過抑制免疫細胞功能或誘導調節(jié)性細胞的產生，使腫瘤細胞逃逸宿主的免疫監(jiān)視，進而導致腫瘤發(fā)生。

5、近幾年，hla-g逐漸被認為是一種新型的免疫檢查點分子，推斷hla-g檢查點抑制劑與化療、放療或其他免疫靶點藥物的聯(lián)合治療將會給復發(fā)轉移性腫瘤患者帶來更好的療效。目前，針對hla-g開發(fā)的抗體或car-t藥物等尚處于早期的研究階段。而針對hla-g功能，大多數(shù)的研究主要集中在全長的膜結合型分子hla-g1及其可溶性分子hla-g5，有關其他幾種hla-g異構體分子的研究甚少，卻與腫瘤進展密切相關，如腎癌、胃癌等。根據(jù)不同的研究，hla-g異構體在腫瘤發(fā)生中的作用仍存在爭議。再加上，在不同腫瘤組織細胞中，發(fā)現(xiàn)不同的hla-g異構體表達存在廣泛的異質性。因此，不同的hla-g異構體可能具有特定的生物學功能及其臨床意義，使得研究除hla-g1、-g5之外的hla-g異構體分子功能迫在眉睫。

6、目前除了hla-g1、-g5異構體分子的生物學功能有被報道之外，hla-g2、-g3、-g4、-g6、-g7異構體分子，包括新型hla-g異構體分子的功能及意義仍未闡明。但是，目前尚未見通過何種技術成功對不同的hla-g異構體基因實現(xiàn)精準敲除的報道。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了靶向敲除hla-g異構體基因的基因編輯系統(tǒng)和應用，可以精準敲除不同的hla-g異構體基因或者完整性敲除整個hla-g基因，達到精準敲除hla-g特定基因區(qū)域的目的。

2、本發(fā)明提供了敲除hla-g異構體基因的sgrna組合，包括分別針對hla-g異構體基因的基因結構設計的靶標序列和互補序列；

3、所述基因結構包括外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、內含子4和內含子2。

4、優(yōu)選的，所述靶標序列和互補序列的核苷酸序列依次如seq?id?no.1～seq?idno.14所示。

5、本發(fā)明提供了靶向敲除hla-g異構體基因的crispr/cas9載體組合，包括由上述sgrna組合中針對各基因結構設計的靶標序列和互補序列退火后形成的雙鏈序列與基因編輯載體連接構建得到的crispr/cas9載體。

6、優(yōu)選的，所述基因編輯載體包括plenticrisprv2基因重組質粒。

7、本發(fā)明提供了一種敲除hla-g異構體基因的試劑盒，包括上述sgrna組合，或上述crispr/cas9載體組合。

8、優(yōu)選的，利用所述試劑盒敲除整個hla-g基因時，所述crispr/cas9載體組合包括：plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4、plenticrisprv2-e5、plenticrisprv2-i2和plenticrisprv2-i4；

9、其中，plenticrisprv2-e1為將針對外顯子1設計的靶標序列和互補序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構建得到；

10、plenticrisprv2-e2為將針對外顯子2設計的靶標序列和互補序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構建得到；

11、plenticrisprv2-e3為將針對外顯子3設計的靶標序列和互補序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構建得到；

12、plenticrisprv2-e4為將針對外顯子4設計的靶標序列和互補序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構建得到；

13、plenticrisprv2-e5為將針對外顯子5設計的靶標序列和互補序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構建得到；

14、plenticrisprv2-i2為將針對內含子2設計的靶標序列和互補序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構建得到；

15、plenticrisprv2-i4為將針對內含子4設計的靶標序列和互補序列退火后形成的雙鏈序列與plenticrisprv2載體連接后構建得到。

16、優(yōu)選的，利用所述試劑盒敲除膜結合型hla-g1基因的載體組合包括：plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

17、利用所述試劑盒敲除膜結合型hla-g2基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

18、利用所述試劑盒敲除膜結合型hla-g3基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2和plenticrisprv2-e5；

19、利用所述試劑盒敲除膜結合型hla-g4基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3和plenticrisprv2-e5；

20、利用所述試劑盒敲除可溶性hla-g5基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-i4；

21、利用所述試劑盒敲除可溶性hla-g6基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-i4；

22、利用所述試劑盒敲除可溶性hla-g7基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2和plenticrisprv2-i2。

23、優(yōu)選的，利用所述試劑盒敲除缺失α1的hla-g基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

24、利用所述試劑盒敲除缺失α1和α2的hla-g基因的載體組合包括:plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5。

25、本發(fā)明還提供了靶向敲除hla-g異構體基因的crispr/cas9慢病毒試劑盒，包括靶向敲除不同hla-g異構體基因的crispr/cas9慢病毒系統(tǒng)；

26、所述crispr/cas9慢病毒系統(tǒng)的制備方法，包括分別使用慢病毒包裝質粒對上述crispr/cas9載體組合中的每個crispr/cas9載體進行包裝，轉染人源細胞后，得到靶向敲除不同hla-g異構體基因的crispr/cas9慢病毒系統(tǒng)。

27、本發(fā)明還提供了上述sgrna組合、上述crispr/cas9載體組合、上述試劑盒或上述crispr/cas9慢病毒試劑盒在制備以hla-g為治療靶點的藥物中的應用。

28、有益效果：本發(fā)明依據(jù)人的hla-g基因序列設計得到可精準靶向hla-g基因的第1外顯子(sp)、第2外顯子(α1)、第3外顯子(α2)、第4外顯子(α3)、第5外顯子(tm)、第2內含子以及第4內含子的一段引導rna(small?guide?rna,sgrna)。

29、本發(fā)明通過針對hla-g基因的各結構的靶序列和互補序列經退火后形成雙鏈片段，將所述雙鏈片段插入到基因編輯載體中，構建得到針對整體hla-g基因、膜結合型hla-g1～-g4基因、可溶性hla-g5～-g7基因以及新型hla-g基因的crispr/cas9基因編輯載體組合。

30、本發(fā)明結合慢病毒載體的高效轉染特性和crispr/cas9技術的高效基因編輯特征，利用慢病毒對所述crispr/cas9基因編輯載體組合分別進行包裝，可實現(xiàn)精準敲除不同的hla-g異構體基因或者完整性敲除hla-g基因，包括新型異構體，本發(fā)明為今后探索不同hla-g異構體分子的功能，和推動hla-g免疫抑制劑的研發(fā)及其在免疫治療效果評價中均具有非常重要的意義。