本發(fā)明涉及骨科類器官，特別涉及一種骨類器官模型及其構建方法與應用。

背景技術：

1、骨缺損特別是大段骨缺損是目前臨床的一個重大難題。骨缺損可由腫瘤、創(chuàng)傷、感染等引起，是臨床常見的一種創(chuàng)傷。現(xiàn)有的大型骨缺損修復方法存在明顯缺陷，需要更有效的方法來增強骨再生，并加速愈合。同時，椎體壓縮骨折等嚴重骨折也需要更有效的臨床方案，以減輕病人的痛苦，避免骨水泥硬化帶來的后遺癥。

2、近年來，利用成體干細胞或多能干細胞進行體外三維培養(yǎng)，形成了具備一定空間結構的組織類似物，即類器官。類器官技術已在腸道、腦、肝、腎、胰等領域取得了成功，并被《自然·方法》雜志評為“年度方法”。骨類器官是以由干細胞(如骨干細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞等)或祖細胞定向分化而成的具有骨骼仿生空間特征的3d自組織和自我更新的微骨組織(含成骨細胞，骨細胞，破骨細胞或造血細胞單元等)，同時具有骨骼基本單元結構和功能的類器官，骨類器官也是新興的研究骨相關疾病的重要工具。骨骼類器官構建過程中一個關鍵挑戰(zhàn)是在3d組織結構中實現(xiàn)可相互作用的包含不同細胞類型的組織結構體系。其中有很多的難題尚未解決，比如：在體外，基于成骨細胞的細胞系分化為骨細胞的模型尚未產(chǎn)生可完全發(fā)育的礦化膠原基質(zhì)；人類骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(hbmsc)分化為骨細胞(占骨組織細胞部分的90-95％)尚未在體外可控實現(xiàn)等，目前這些問題仍然是體外誘導骨骼類器官形成的關鍵制約步驟。mc3t3-e1細胞是小鼠顱骨胚胎成骨細胞前體細胞，具有良好的成骨分化潛能和礦化潛能，廣泛用于成骨分化和礦化沉積研究。骨類器官可由祖細胞定向分化而成，其是具有3d空間特征的自組織和自我更新的組織，具有骨骼相關的基本結構和功能。因此,mc3t3-e1細胞可用于構建骨骼類器官，而且這種成骨細胞前體細胞在構建成骨分化過程中，分化步驟較少，成骨分化方向比較明確，在構建骨骼類器官臨床應用方面具有顯著優(yōu)勢，是用于設計骨骼類器官的理想細胞。

3、因此，針對現(xiàn)有骨科領域骨缺損填充材料不足，效果不佳，同種異體骨資源有限，排異反應，感染難題，骨組織器官不足，滅活骨組織成骨不佳，臨床用于骨相關疾病研究模型不足，骨缺損尤其是大段骨缺損治療手段局限等難題，有必要開發(fā)一種骨類器官模型。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是提供一種骨類器官模型及其構建方法與應用，可實現(xiàn)結構可控地，高通量，構建形態(tài)穩(wěn)定的骨類器官，并可原位觀察骨類器官分化發(fā)育全過程，并用于骨相關疾病研究工具與臨床骨缺損相關疾病治療等。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

3、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于構建骨類器官模型的培養(yǎng)基，所述用于構建骨類器官模型的培養(yǎng)基包括：

4、成骨細胞成熟培養(yǎng)基：為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：40-60μg/ml?asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm?dex。

5、進一步地，所述用于構建骨類器官模型的培養(yǎng)基適用的起始細胞包括以下中的一種：

6、胚胎干細胞、誘導多能干細胞(ipscs)；

7、骨髓間充質(zhì)干細胞,各級成骨前體細胞，成骨樣細胞，mc3t3-e1細胞；

8、成骨細胞，骨細胞；

9、其中，所述骨髓間充質(zhì)干細胞,各級成骨前體細胞，成骨樣細胞，mc3t3-e1細胞作為起始細胞用于構建骨類器官模型的培養(yǎng)基還包括：

10、成骨分化培養(yǎng)基：為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：40-60μg/mlasap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm?dex、0.8-1.2μm?sag、0.8-1.2μm?th；

11、其中，所述胚胎干細胞、誘導多能干細胞(ipscs)作為起始細胞用于構建骨類器官模型的培養(yǎng)基還包括：

12、ipscs培養(yǎng)基：為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：800-1200單位/mllif-白血病抑制因子、0.8-1.2μm?pd0325901、2-4μm?chir99021；

13、中胚層誘導培養(yǎng)基：為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：20-40μmchir和3-7μm?cyc；

14、外胚層和內(nèi)胚層誘導培養(yǎng)基：所述外胚層和內(nèi)胚層誘導培養(yǎng)基為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：3-7μm?retinoic?acid；

15、成骨分化培養(yǎng)基：為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：40-60μg/mlasap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm?dex、0.8-1.2μm?sag、0.8-1.2μm?th。

16、進一步地，所述基礎培養(yǎng)基選自dmem/f-12高糖基礎培養(yǎng)基(11330-032,gibco)中加入神經(jīng)基礎培養(yǎng)液(21103-049,gibco)，加入n2添加劑(17502-048,gibco),加入b27添加劑(17504044,gibco)，牛血清白蛋白v(a3059,sigma-aldrich),雙抗青霉素-鏈霉素溶液(p4458,sigma-aldrich)配制而成。

17、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于構建胚胎干細胞和ipsc來源的骨類器官模型的成套添加產(chǎn)品，包括以下中的至少一種：

18、a、用于構建胚胎干細胞和ipsc來源的骨類器官模型的成套添加產(chǎn)品：

19、所述用于配制ipscs培養(yǎng)基的誘導分子：800-1200單位/ml?lif-白血病抑制因子、0.8-1.2μm?pd0325901、2-4μm?chir99021；

20、所述用于配制中胚層誘導培養(yǎng)基的誘導分子：20-40μm?chir和3-7μm?cyc；

21、所述用于配制外胚層和內(nèi)胚層誘導培養(yǎng)基：3-7μm?retinoic?acid；

22、所述用于配制成骨分化培養(yǎng)基的誘導分子：40-60μg/ml?asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm?dex；

23、所述用于配制成骨細胞成熟培養(yǎng)基的誘導分子：40-60μg/ml?asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm?dex；

24、b、用于骨髓間充質(zhì)干細胞,各級成骨前體細胞，成骨樣細胞，mc3t3-e1來源的骨類器官模型的成套添加產(chǎn)品，包括：

25、所述的成骨分化培養(yǎng)基：為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：40-60μg/ml?asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm?dex、0.8-1.2μm?sag、0.8-1.2μm?th；

26、所述的成骨細胞成熟培養(yǎng)基：為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：40-60μg/ml?asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm?dex；

27、c、用于成骨細胞，骨細胞來源骨類器官的成套添加產(chǎn)品，包括：

28、所述的成骨細胞成熟培養(yǎng)基：為在基礎培養(yǎng)基中加入如下終濃度的誘導分子：40-60μg/ml?asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm?dex。

29、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種骨類器官模型的構建方法，所述方法包括：

30、將具有微孔陣列的生物材料設于所述細胞培養(yǎng)板內(nèi)，獲得骨類器官芯片；

31、將初始干細胞懸浮在培養(yǎng)基中，通過細胞聚集或使用非粘附性的培養(yǎng)表面來促使細胞形成球狀結構，獲得細胞球；

32、將所述細胞球于所述骨類器官芯片中采用所述的用于構建骨類器官模型的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，獲得骨類器官模型。

33、在本發(fā)明的第四方面，提供了采用所述方法制備得到的骨類器官模型。

34、在本發(fā)明的第五方面，提供了所述的骨類器官模型在制備用于治療骨折、大段骨缺損、類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎產(chǎn)品中的應用。

35、本發(fā)明實施例中的一個或多個技術方案，至少具有如下技術效果或優(yōu)點：

36、1、本發(fā)明成功完成了體外誘導ipscs和mc3t3-e1細胞的礦化過程：通過利用含誘導劑(β-gp和抗壞血酸)的培養(yǎng)基和無誘導劑培養(yǎng)基分別培養(yǎng)mc3t3-e1細胞，觀察到實驗組細胞在第21天時出現(xiàn)明顯的礦化結節(jié)，而對照組無礦化結節(jié)形成。這表明本發(fā)明的方法能夠成功誘導mc3t3-e1細胞的礦化過程。同時通過利用含誘導劑(lif-白血病抑制因子、pd0325901、chir99021)的培養(yǎng)基和無誘導劑的培養(yǎng)基進行ipscs培養(yǎng)，利用含誘導劑(chir、cyc)的培養(yǎng)基和無誘導劑培養(yǎng)基分進行中胚層誘導，然后利用含誘導劑(asap、β-gp、dex、sag、th)和不含誘導劑的培養(yǎng)基進行成骨分化培養(yǎng)，最后利用含有誘導劑(asap、β-gp、dex)和不含誘導劑的培養(yǎng)基進行成骨細胞成熟培養(yǎng)，觀察到實驗組細胞從第5天開始出現(xiàn)中胚層相關基因標記t，mixl1表達增加，從第19天開始出現(xiàn)成骨相關基因標記runx2，cola1表達增加，在這表明本發(fā)明的方法能夠成功誘導ipscs細胞進行骨類器官的分化成熟過程。

37、2.為骨組織工程提供科學依據(jù)：本研究通過三維培養(yǎng)模擬人體內(nèi)部骨骼環(huán)境，探究誘導因子和動態(tài)載荷對ipscs和mc3t3-e1成骨樣細胞生物學效應的影響，為骨組織工程提供了新思路和科學依據(jù)。

38、3.深入認識人體內(nèi)部骨骼環(huán)境對ipscs和mc3t3-e1樣細胞生物學效應的調(diào)節(jié)機制：研究成果有望深入認識人體內(nèi)部骨骼環(huán)境對ipscs和mc3t3-e1樣細胞生物學效應的調(diào)節(jié)機制，有助于制定更加科學的人工骨骼模型和治療方案，從而提高其治療效果和臨床應用價值。

39、4.探究了不同誘導因子，培養(yǎng)基組成以及力學強度對細胞分化的影響：通過探討三維培養(yǎng)條件下細胞對不同因子強度的生物學響應，本發(fā)明為優(yōu)化骨組織工程的培養(yǎng)策略和生物材料的設計提供了理論依據(jù)。

40、5.為其他成骨樣細胞及細胞培養(yǎng)領域提供參考和借鑒：本研究不僅為骨組織工程提供了新的思路和科學依據(jù)，還可為其他成骨樣細胞及細胞培養(yǎng)領域提供參考和借鑒。