本發(fā)明涉及一種s-腺苷蛋氨酸合成酶突變體及其應(yīng)用，屬于生物酶工程。

背景技術(shù)：

1、s-腺苷蛋氨酸(s-adenosyl-l-methionine，sam)是一種重要的代謝中間體，存在于所有已知生物體中，是生物正常進(jìn)行生理活動(dòng)所必需的。sam在細(xì)胞中的重要性主要體現(xiàn)在其參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)、轉(zhuǎn)硫基反應(yīng)和轉(zhuǎn)氨丙基反應(yīng)，它不僅是生物體內(nèi)甲基的主要供體，同樣也是多胺生物合成中使用的氨基、丙基的前體。所以，在各種sam作為輔因子的反應(yīng)中，它的重要性可能僅次于atp。在臨床研究中，sam已被廣泛應(yīng)用于肝臟疾病、抑郁癥、骨關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和其他疾病的治療。隨著sam市場(chǎng)需求的不斷擴(kuò)大，為工業(yè)生產(chǎn)提供一種低成本、高效的sam制造技術(shù)是必要的。

2、sam的生產(chǎn)可以通過(guò)化學(xué)合成、生物酶催化和微生物發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于純?cè)趪?yán)格的反應(yīng)條件、低生產(chǎn)率、環(huán)境污染嚴(yán)重和純化困難等問(wèn)題，目前化學(xué)合成的方法生產(chǎn)sam已被放棄。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)sam因其條件易控、產(chǎn)量高、底物廉價(jià)、便于放大等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。釀酒酵母具有高活性的s-腺苷甲硫氨酸合成酶(mat，ec2.5.1.6)，具有獨(dú)特的液泡sam存儲(chǔ)機(jī)制，因此廣泛應(yīng)用于sam生產(chǎn)，但該方法同時(shí)也存在著分離純化成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。與前兩種方法相比，生物酶催化法具有環(huán)境污染小、產(chǎn)品純度高、純化簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)。此外，酶工程和固定化酶的發(fā)展也使得酶法生產(chǎn)sam得到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，酶促合成sam的主要挑戰(zhàn)仍然是atp的昂貴以及mat的低催化效率。近年來(lái)，全細(xì)胞催化引起了廣泛關(guān)注。與固定化酶相比，全細(xì)胞催化不需要酶的分離純化，回收率高，降低了下游分離純化成本，且細(xì)胞可以重復(fù)利用，有利于提高工業(yè)化生產(chǎn)sam的強(qiáng)度。但是全細(xì)胞催化法同時(shí)也需要高催化活性的s-腺苷蛋氨酸合成酶，所以目前有許多研究集中在嘗試通過(guò)提高sam合成酶活性來(lái)工業(yè)生產(chǎn)sam。sam合成酶廣泛存在于生物體中，包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物等。近年來(lái)，來(lái)自大腸桿菌和釀酒酵母的sam合成酶已經(jīng)得到了很好的工業(yè)應(yīng)用特性。

3、甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(methionine?adenosyltransferase，簡(jiǎn)稱mat或者adomat，ec?2.5.1.6)是一種可以通過(guò)反應(yīng)催化atp和l-甲硫氨酸合成s-腺苷甲硫氨酸的酶，是sam生物合成過(guò)程中的限速酶。目前，大腸桿菌和釀酒酵母來(lái)源的mat研究較多。通過(guò)酶學(xué)特性比較，大腸桿菌的mat具有較高的比活性和較好的可溶性表達(dá)。并且，從大腸桿菌中提取的mat的晶體結(jié)構(gòu)和與amppnp和l-蛋氨酸絡(luò)合的mat的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被報(bào)道，這使得基于其結(jié)構(gòu)的理性或半理性重新設(shè)計(jì)獲得高效的mat突變體成為可能。但是該酶的主要缺點(diǎn)是底物與產(chǎn)物的抑制嚴(yán)重限制了sam的合成。為了克服產(chǎn)物的抑制作用，需要在反應(yīng)體系中加入高濃度的對(duì)甲苯磺酸鈉，但是這也進(jìn)一步增加了成本，且sam對(duì)甲苯磺酸鹽作為藥物的生物利用度較低。釀酒酵母中有兩種mat，分別由sam1和sam2獨(dú)立編碼，并且他們的序列具有較高的同源性。但是和兩種酶的結(jié)構(gòu)與調(diào)控方式有所不同，sam合成酶1具有底物抑制性，在l-met過(guò)量時(shí)，細(xì)胞會(huì)下調(diào)sam1基因的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)sam2基因的表達(dá)。sam2編碼的sam合成酶2不受底物的抑制，并且大多數(shù)來(lái)源的sam合成酶均存在sam負(fù)反饋?zhàn)饔茫磗am積累會(huì)抑制sam合成酶的酶活性，導(dǎo)致sam積累量不高，而釀酒酵母sam2編碼的蛋白沒(méi)有sam負(fù)反饋?zhàn)饔?，因此常被用?lái)進(jìn)行sam積累。相關(guān)研究中指出，sam2合成酶基因的過(guò)表達(dá)在畢赤酵母、釀酒酵母和大腸桿菌中具有積極作用，但mat的活性極大的限制了sam的合成。因此，增加sam的產(chǎn)量需要提高mat的活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)目前工業(yè)生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸存在合成酶催化效率低，穩(wěn)定性差的問(wèn)題，為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種s-腺苷蛋氨酸合成酶活性提高的突變體，并提高其全細(xì)胞催化法合成s-腺苷蛋氨酸的產(chǎn)量，對(duì)于促進(jìn)s-腺苷蛋氨酸的合成具有普遍的意義。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、克隆了釀酒酵母來(lái)源的sam2基因編碼的s-腺苷蛋氨酸合成酶mat，采用swiss-model建立蛋白模型，分析其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，將蛋白質(zhì)與底物進(jìn)行分子對(duì)接，選擇位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，對(duì)突變后帶的酶進(jìn)行活性測(cè)定，確定對(duì)酶活性有重要影響的位點(diǎn)，然后進(jìn)行組合突變，迭加突變優(yōu)勢(shì)，獲得相比野生型活性及穩(wěn)定性提高的突變體。

4、本發(fā)明提供一種s-腺苷蛋氨酸合成酶突變體，在seq?id?no.1所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上，具有189位、200位、234位、371位的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)突變。

5、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變包括以下至少一種：

6、(1)將第189位異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸；

7、(2)將第234位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０罚?/p>

8、(3)將第266位纈氨酸突變?yōu)榻M氨酸；

9、(4)將第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼?、組氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或賴氨酸。

10、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變包括以下任一種：

11、(1)將第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼?n371r)；

12、(2)將第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼?，并將?00位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?n371r/d200e)；

13、(3)將第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼?，并將?34位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?n371r/q234n)；

14、(4)將第189位異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第266位纈氨酸突變?yōu)榻M氨酸，第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼幔⒌?34位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?i189v/v266h/n371r/q234n)。

15、本發(fā)明還提供了編碼所述突變體的基因。

16、本發(fā)明還提供了攜帶所述基因的表達(dá)載體。

17、本發(fā)明還提供了表達(dá)所述突變體，或攜帶所述表達(dá)載體的微生物細(xì)胞。

18、本發(fā)明還提供了一種重組大腸桿菌，以pet28a為載體，表達(dá)所述突變體。

19、本發(fā)明還提供了生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的方法，以所述突變體或所述微生物細(xì)胞，或所述重組大腸桿菌為催化劑進(jìn)行反應(yīng)。

20、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將所述微生物細(xì)胞，或所述重組大腸桿菌在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至od600為0.6～0.8，加入誘導(dǎo)劑25℃誘導(dǎo)12-24h，收集菌體；將菌體添加至含有底物的反應(yīng)體系中反應(yīng)2h。

21、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將重組微生物細(xì)胞接種到含有卡那的10ml?lb液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm培養(yǎng)10-12h，再將2％的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接新的含卡那的50ml?lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)約2-3h使od＝0.6-0.8，加入過(guò)濾除菌的誘導(dǎo)劑iptg到終濃度為0.1mm，然后25℃220rpm培養(yǎng)12-24h，離心收集菌體。

22、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述底物包括l-蛋氨酸(20～60mm)、腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽(20～60mm)、氯化鉀(20～60mm)、氯化鎂(20～60mm)、谷胱甘肽(5-8mm)，控制菌株od600＝(3.2)±0.2，在ph8±1、37～60℃下反應(yīng)。

23、本發(fā)明還提供了所述突變體或所述微生物細(xì)胞在制備s-腺苷蛋氨酸或含s-腺苷蛋氨酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

24、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述產(chǎn)品包括食品、藥品或日化用品。

25、有益效果：

26、(1)對(duì)s-腺苷蛋氨酸合成酶mat的189位、200位、234位、371位的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)突變，得到了酶活提高的一系列突變體，將第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼?n371r)，其比酶活較親本分別提高了391.81％；將第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼?，并將?00位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?n371r/d200e)，其比酶活較親本分別提高了239.90％；將第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼?，并將?34位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?n371r/q234n)，其比酶活較親本分別提高了401.05％；將第189位異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第266位纈氨酸突變?yōu)榻M氨酸，第371位天冬酰胺突變?yōu)榫彼?，并?34位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?i189v/v266h/n371r/q234n)，其比酶活較親本分別提高了294.57％，且189位、200位、234位、371位的單點(diǎn)突變其比酶活較親本都有不同程度的提高，說(shuō)明該突變體的酶活得到大大提升。

27、(2)通過(guò)全細(xì)胞催化比較催化性能，在催化2h，e.coli?bl21-pet28a-sam2-n371r催化合成s-腺苷蛋氨酸的濃度為415.36mg/l，e.coli?bl21-pet28a-sam2-n371r/d200e催化合成s-腺苷蛋氨酸的濃度為582.68mg/l，e.coli?bl21-pet28a-sam2-n371r/q234n催化合成s-腺苷蛋氨酸的濃度為465.54mg/l，e.coli?bl21-pet28a-sam2-i189v/v266h/n371r/q234n催化合成s-腺苷蛋氨酸的濃度為1749.40mg/l，而野生型e.coli?bl21-pet28a-sam2在催化2h，合成sam濃度為276.32mg/l。