本發(fā)明屬于生物工程和合成生物學領域，涉及類胡蘿卜素環(huán)合酶及其編碼的蛋白和應用，具體涉及在合成異海綿烯(isorenieratene)巴斯德畢赤酵母工程菌株中的應用。

背景技術：

1、巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)酵母，具有很強的呼吸代謝能力，因此能在簡單培養(yǎng)基中生長到非常高的細胞密度，也可以很容易地從搖瓶擴大到大規(guī)模生物反應器。巴斯德酵母的綜合特性使該菌株在生產(chǎn)類胡蘿卜素等化合物方面具有巨大的潛力。最近的研究已經(jīng)證明，巴斯德氏菌適合于生產(chǎn)透明質(zhì)酸、類胡蘿卜素和倍半萜(+)-諾卡酮等天然產(chǎn)物。與其他微生物相比，巴斯德畢赤酵母安全可靠，可用于食品、醫(yī)藥等眾多行業(yè)；菌株生長速度快，抗逆性強，培養(yǎng)簡單，適合工業(yè)化；分子操作平臺成熟且遺傳工具完善，發(fā)展前景廣闊。

2、異海綿烯是一種含苯環(huán)端基的稀有類胡蘿卜素，其兩端的芳香環(huán)能夠與對稱的異戊二烯碳鏈形成共軛大π鍵，該結(jié)構(gòu)賦予其更強的穩(wěn)定性，并且在具有高抗氧化能力的同時，異海綿烯還可以有效吸收紫外輻射，因此具有細胞光保護作用。作為一種結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、功能更優(yōu)的類胡蘿卜素，異海綿烯在功能食品以及醫(yī)藥等領域展示出巨大的應用潛力。異海綿烯的生物合成主要是通過類胡蘿卜素環(huán)合酶(crtu)，由β胡蘿卜素催化而來。目前，異海綿烯目前只在少部分光合細菌、亞麻短桿菌、鏈霉菌和紅球菌中檢測到并且產(chǎn)量較低，所以亟需構(gòu)建一種能夠高效合成異海綿烯的工程菌株。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種類胡蘿卜素環(huán)合酶基因及其編碼蛋白；

2、本發(fā)明的另一目的是將類胡蘿卜素環(huán)合酶應用于異海綿烯的合成；

3、本發(fā)明的再一目的在于合成異海綿烯工程畢赤酵母的構(gòu)建方法；

4、本發(fā)明的再一目的是提供一種異海綿烯的鑒定方法；

5、為實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

6、類胡蘿卜素環(huán)合酶，其氨基酸序列如seq?id?no.6所示。

7、編碼類胡蘿卜素環(huán)合酶的基因序列。

8、編碼類胡蘿卜素環(huán)合酶的基因其核苷酸序列為seq?id?no.5所示，該基因(從起始密碼子到終止密碼子)全長1566bp，編碼521個氨基酸。

9、類胡蘿卜素環(huán)合酶基因的獲得：

10、通過基因組比對分析的方法來尋找目的基因，首先對食醚紅球菌(rhodococcusaetherivorans)的基因組進行ncbi注釋，尋找注釋為假定的類胡蘿卜素環(huán)合酶基因的基因，從食醚紅球菌中克隆該基因，本發(fā)明通過功能驗證確定其具有類胡蘿卜素環(huán)合酶，將具有類胡蘿卜素環(huán)合酶功能的基因用于后續(xù)合成異海綿烯畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建。

11、所述類胡蘿卜素環(huán)合酶在異海綿烯合成中的應用。

12、將所述類胡蘿卜素環(huán)合酶基因?qū)氲剿拗骶?，發(fā)酵生產(chǎn)異海綿烯。

13、一株生產(chǎn)異海綿烯的菌株，向巴斯德畢赤酵母中導入香葉基香葉基二磷酸合酶crte、八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶crtyb、八氫番茄紅素去飽和酶crti、3-羥基-3-甲基戊二酰coa還原酶thmgr和類胡蘿卜素環(huán)合酶crtu的表達盒得到；所述crte的編碼基因序列如seq?id?no.1所示；所述crtyb的編碼基因序列如seq?id?no.2所示；所述crti的編碼基因序列如seq?id?no.3所示；所述thmgr的編碼基因序列如seq?id?no.4所示；所述crtu的編碼基因序列如seq?id?no.5所示。

14、本發(fā)明中，所述香葉基香葉基二磷酸合酶crte、八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶crtyb、八氫番茄紅素去飽和酶crti的基因來源于紅法夫酵母(xanthophyllomycesdenrorhous)；所述3-羥基-3-甲基戊二酰coa還原酶的基因來源于釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)；所述類胡蘿卜素環(huán)合酶基因crtu來源于食醚紅球菌(rhodococcus?aetherivorans)。

15、所述巴斯德畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母gs115。

16、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述表達盒的啟動子為巴斯德畢赤酵母的pgpm1啟動子、ppdc1啟動子、pmdh3啟動子、padh2啟動子或pgap啟動子；所述終止子為巴斯德畢赤酵母的sccyc1tt終止子、rpp1btt終止子、rps2tt終止子、rpl2att終止子或rps3tt終止子。

17、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述重組巴斯德畢赤酵母還表達1個標記基因；所述標記基因選自質(zhì)粒bb3ak-af的硫酸卡那霉素編碼基因表達盒。

18、進一步優(yōu)選地，crti啟動子為pgpm1，終止子為sccyc1tt；crte的啟動子為ppdc1啟動子，終止子為rpp1btt；crtyb的啟動子為pmdh3，終止子為rps2tt；thmgr的啟動子為padh2，終止子為rpl2att；crtu的啟動子為pgap，終止子為rps3tt該質(zhì)粒攜帶的硫酸卡那霉素基因用作巴斯德畢赤酵母的篩選標記。

19、本發(fā)明的另一目的在于提供上述菌株的構(gòu)建方法，將所述crte、crtyb、crti以及thmgr的表達盒通過質(zhì)粒形式導入所述巴斯德畢赤酵母gs115，整合在巴斯德畢赤酵母菌株基因組上。

20、包括：

21、將所述crte、crtyb、crti、thmgr和crtu的基因片段通過goldengate方法插入質(zhì)粒bb1-23中，得到質(zhì)粒bb1-23-crte、bb1-23-crtyb、bb1-23-crti、bb1-23-thmgr和bb1-23-crtu；

22、將所述質(zhì)粒bb1-23-crti與質(zhì)粒bb1-12-pgpm1、質(zhì)粒bb1-34-sccyc1tt通過goldengate方法插入質(zhì)粒bb2-ab中，得到質(zhì)粒bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt；

23、將所述質(zhì)粒bb1-23-crte與質(zhì)粒bb1-12-ppdc1、質(zhì)粒bb1-34-rpp1btt通過goldengate方法插入質(zhì)粒bb2-bc中，得到質(zhì)粒bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt；

24、將所述質(zhì)粒bb1-23-crtyb與質(zhì)粒bb1-12-pmdh3、質(zhì)粒bb1-34-rps2tt通過goldengate方法插入質(zhì)粒bb2-cd中，得到質(zhì)粒bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt；

25、將所述質(zhì)粒bb1-23-thmgr與質(zhì)粒bb1-12-padh2、質(zhì)粒bb1-34-rpl2att通過goldengate方法插入質(zhì)粒bb2-de中，得到質(zhì)粒bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att；

26、將所述質(zhì)粒bb1-23-crtu與質(zhì)粒bb1-12-pgap、質(zhì)粒bb1-34-rps3tt通過goldengate方法插入質(zhì)粒bb2-ef中，得到質(zhì)粒bb2-ef-pgap-crtyb-rps3tt；

27、將所述質(zhì)粒bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt、bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt、bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt、bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att和bb2-ef-pgap-crtyb-rps3tt通過goldengate方法插入質(zhì)粒bb3ak-af中，得到質(zhì)粒bb3ak-af-l8crtu；

28、將所述質(zhì)粒bb3ak-af-l8crtu導入巴斯德畢赤酵母gs115，獲取重組菌株。

29、使用bpi1酶和t4連接酶通過goldengate方法構(gòu)建所述bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt、bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt、bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt、bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att、和bb2-ef-pgap-crtyb-rps3tt質(zhì)粒。

30、使用bsa1酶和t4連接酶通過goldengate方法構(gòu)建所述bb3ak-af-l8crtu質(zhì)粒。

31、生產(chǎn)異海綿烯的重組菌株在生產(chǎn)類胡蘿卜素中的應用。

32、所述重組菌株在生產(chǎn)異海綿烯中的應用。

33、所述應用包括：在25～35℃條件下，將重組菌接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)3～8天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；

34、所述營養(yǎng)培養(yǎng)基為：10g/l葡萄糖，20g/l蛋白胨和10g/l酵母粉；

35、所述菌株培養(yǎng)溫度優(yōu)選為30℃，發(fā)酵時間為4～5天。

36、在50ml的搖瓶發(fā)酵中，最高可以生產(chǎn)159.41mg/l的異海綿烯產(chǎn)量和9.43mg/g的異海綿烯含量。

37、采用二甲基亞砜和丙酮萃取所述發(fā)酵產(chǎn)物，得到異海綿烯。

38、提取方法包括如下步驟：取2ml發(fā)酵液，12000rpm離心3min，超純水洗滌兩遍，棄掉上清液，加2ml二甲基亞砜，震蕩搖勻，55℃水浴15min，加入2ml丙酮，55℃水浴避光靜置15min，12000rpm?3min取上清待下一步檢測。

39、本發(fā)明還提供了一種鑒定重組菌株的產(chǎn)物以及其產(chǎn)量的方法；

40、采用二甲基亞砜和丙酮萃取所述發(fā)酵產(chǎn)物，得到異海綿烯，采用lc-ms分析對產(chǎn)物異海綿烯定性檢測并通過高效液相色譜檢測其產(chǎn)量。

41、液相條件為：

42、色譜柱：c30色譜柱；紫外吸收波長為450nm；進樣量10ul；流動相a為甲醇b為甲基叔丁基醚，流速：1ml/min；洗脫程序：第一階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫30分鐘，其中流動相a的體積百分含量由95％變?yōu)?0％，流動相b的體積百分含量由5％變?yōu)?0％；第二階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫20分鐘，其中流動相a的體積百分含量由70％變?yōu)?0％，流動相b的體積百分含量由30％變?yōu)?0％；第三階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫10分鐘，其中流動相a的體積百分含量由50％變?yōu)?5％，流動相b的體積百分含量由50％變?yōu)?％。

43、質(zhì)譜條件為：

44、采集模式:mse(低能量/高能量切換掃描)；電噴霧正離子/負離子分別掃描；毛細管電壓2kv；錐孔電壓40v；霧化氣溫度:450℃；霧化氣流量900l/h；錐孔反吹氣50l/h；離子源溫度115℃；掃描范圍50～1000m/z；掃描速度0.2s；碰撞能量6ev/20～45ev；在線鎖定質(zhì)量；250pg/ul亮氨酸腦啡肽持續(xù)進樣，流速10ul/min；采集間隔0.5s；采集時間0.5s。

45、有益效果：

46、1.本發(fā)明首次證明在畢赤酵母中驗證類胡蘿卜素環(huán)合酶crtu的功能，該基因為一個新功能的基因，全長(從起始密碼子到終止密碼子)全長1566bp，可編碼521個氨基酸。

47、2.本發(fā)明首次實現(xiàn)了利用工程巴斯德畢赤酵母利用葡萄糖從頭合成異海綿烯。通過利用類胡蘿卜素環(huán)合酶crtu來構(gòu)建了能夠從頭合成異海綿烯的菌株，這也是首次在非天然菌株中合成異海綿烯的報道。

48、3.本發(fā)明提供了重組巴斯德畢赤酵母菌株中異海綿烯的提取及其檢測方法。