本發(fā)明屬于生物合成，特別涉及一種蛋白、編碼基因及其原核表達(dá)方法和應(yīng)用，尤其涉及一種重組纖連蛋白、編碼基因及其原核表達(dá)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、纖連蛋白(fibronectin，fn)是一種廣泛存在于血液、體液及各種組織中的高分子糖蛋白，是細(xì)胞間外基質(zhì)(ecm)的重要組成成分，其基因位于人類2號染色體上，由i型、ii型和iii型三種同源序列組成，蛋白分子量為440kda，由兩個分子量為220kda的亞基通過二硫鍵連接而成。其亞基有6個致密的球狀體，每一區(qū)都有特定的功能，可與特殊的配體結(jié)合，具有多種生物學(xué)功能。fn廣泛參與細(xì)胞遷移、黏附、增殖、止血及組織修復(fù)等過程，調(diào)動單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除損傷組織有害物質(zhì)，具有生長因子的作用。fn作為細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)，可提高多種細(xì)胞的貼比率、匯合率，縮短細(xì)胞匯合時間，使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)良好，代謝率增強(qiáng)，dna、rna及蛋白質(zhì)合成速率顯著提高。近年來，關(guān)于fn在臨床、醫(yī)藥方面的應(yīng)用研究越來越多，也有將其應(yīng)用于生物材料的文獻(xiàn)報道。此外，也有企業(yè)嘗試進(jìn)行fn相關(guān)的醫(yī)療和美容產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化，表明fn在化妝品行業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景。

2、fn在美容護(hù)膚方面的功效主要為祛除皺紋、祛斑美白。皺紋的形成主要是支持皮膚的膠原蛋白、彈力蛋白、網(wǎng)狀纖維流失造成的，膠原蛋白是最主要的胞外基質(zhì)成分之一，與其他細(xì)胞外基質(zhì)一起維持皮膚的彈性、韌性和光澤。fn作為信號分子，誘導(dǎo)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的表達(dá)分泌，也促進(jìn)細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸以及其他糖蛋白分子，并影響ecm的定向排列，因此具有祛皺的作用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種重組纖連蛋白、編碼基因及其原核表達(dá)方法和應(yīng)用，以大腸桿菌作為重組表達(dá)載體，ni2+-nta親和純化制備重組纖連蛋白，以發(fā)揮纖連蛋白在抵抗光老化損傷的功效，進(jìn)而發(fā)掘其應(yīng)用于抗皺美容護(hù)膚品的潛力。

2、為此，本發(fā)明技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)由序列表中序列1(seq?id?no.1)所示的氨基酸序列組成。序列1：

4、acssspskhcgggggsnapqpshiskyilrwrpknsvgrwkeatipghln?sytikglkpgvvyegqlisiqqyghqevtrfdftttstst

5、第二方面，本發(fā)明提供編碼如第一方面所述蛋白質(zhì)的基因。

6、優(yōu)選的，所述基因為序列表中序列2(seq?id?no.2)所示的dna序列。序列2由人纖連蛋白截取rgd結(jié)構(gòu)域并進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到，具體序列如下：gcttgtagcagttctccctcaaaacactgcggcggtggcggcggtagcaacgcaccacagccgagccatatttccaaatacatcctgcgctggcgtccgaagaactctgttggtcgttggaaagaagcgacgatcccgggccacttgaattcctacaccatcaaaggtctgaagccgggggtggtgtatgagggtcagctgattagcattcagcaatatggtcaccaagaggttacccgttttgacttcaccacgaccagcacctcgactccg

7、第三方面，本發(fā)明提供含有如第二方面所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或基因工程菌。

8、第四方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建pet28a(+)-fn3重組表達(dá)載體的方法，至少包括以下步驟：

9、將序列表中序列2所示的核苷酸序列插入到表達(dá)載體pet28a(+)的酶切位點ndei和xhoi之間，通過熱激方法轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌dh5α中，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，得到pet28a(+)-fn3重組表達(dá)載體。

10、第五方面，本發(fā)明提供如第一方面所述蛋白質(zhì)的原核表達(dá)方法，所述方法至少包括以下步驟：

11、1)依據(jù)序列表中序列2所示的核苷酸序列，構(gòu)建pet28a(+)-fn3重組表達(dá)載體；

12、2)將pet28a(+)-fn3重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主大腸桿菌rosetta感受態(tài)細(xì)胞，通過培養(yǎng)、pcr、篩選，獲得重組基因工程菌；

13、3)對重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)上清；

14、4)將誘導(dǎo)上清純化后，獲得蛋白質(zhì)。

15、其中，步驟3)中誘導(dǎo)表達(dá)具體為：將獲得的重組基因工程菌接入lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，再以1％的接種量接種到lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600達(dá)到0.6-0.8，加入終濃度為0.5mm?iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)6-8h，離心收集菌體。將上述步驟得到的蛋白菌體按1g菌體：25ml裂解緩沖液的比例加入裂解緩沖液，充分吹打使其重懸后冰浴破碎，破碎完全后離心收集誘導(dǎo)上清。

16、其中，步驟4)中純化具體為：對收集的誘導(dǎo)上清進(jìn)行親和層析純化，經(jīng)過平衡層析柱、反復(fù)上樣、低濃度咪唑緩沖液洗滌雜質(zhì)，最后用200mm和300mm咪唑緩沖液逐步洗脫目的蛋白得到純化蛋白，采用超濾濃縮方式進(jìn)一步獲得高濃度蛋白產(chǎn)物。純化結(jié)果采用sds-page鑒定。

17、第六方面，本發(fā)明提供如第二方面所述基因的應(yīng)用。

18、優(yōu)選的，所述應(yīng)用包括但不限于臨床、醫(yī)藥或美容護(hù)膚中的任意一種或至少兩種的組合。

19、優(yōu)選的，所述美容護(hù)膚中的應(yīng)用包括但不限于制備祛除皺紋和/或祛斑美白護(hù)膚品。

20、優(yōu)選的，所述應(yīng)用至少包括以下步驟：將第二方面所述的基因?qū)肴顺衫w維細(xì)胞，使人成纖維細(xì)胞加強(qiáng)包括但不限于在光老化損傷方面的抵抗能力。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

22、本發(fā)明以人纖連蛋白基因為基礎(chǔ)，截取rgd結(jié)構(gòu)域并優(yōu)化后，作為功能表達(dá)片段，成功表達(dá)出新的纖連蛋白片段。該蛋白片段經(jīng)過純化后，實驗驗證其可以有效保護(hù)紫外線對成纖維細(xì)胞的損傷，也可以促進(jìn)i型膠原蛋白的表達(dá)。

技術(shù)特征：

1.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成。

2.編碼如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。

3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因為序列表中序列2所示的dna序列。

4.含有如權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組基因工程菌。

5.一種構(gòu)建pet28a(+)-fn3重組表達(dá)載體的方法，包括以下步驟：

6.一種如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的原核表達(dá)方法，其特征在于，至少包括以下步驟：

7.如權(quán)利要求2或3所述的基因的應(yīng)用。

8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括但不限于臨床、醫(yī)藥或美容護(hù)膚中的任意一種或至少兩種的組合。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述美容護(hù)膚中的應(yīng)用包括但不限于制備祛除皺紋類護(hù)膚品。

10.如權(quán)利要求7-9中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，至少包括以下步驟：將權(quán)利要求2或3所述的基因?qū)肴顺衫w維細(xì)胞，使人成纖維細(xì)胞加強(qiáng)包括但不限于在光老化損傷方面的抵抗能力。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種重組纖連蛋白、編碼基因及其原核表達(dá)方法和應(yīng)用，所述的重組蛋白肽段的氨基酸序列為SEQ?ID?No.1所示，編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?No.2所示，通過進(jìn)行密碼子優(yōu)化和設(shè)計得到基因序列，所述基因序列插入到表達(dá)載體pET28a(+)的酶切位點NdeI和XhoI之間構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a(+)?FN3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)胞，挑取陽性克隆，培養(yǎng)誘導(dǎo)進(jìn)行高效表達(dá)。通過促細(xì)胞分泌膠原蛋白試驗可得所制備的重組蛋白具有良好的促膠原生成功效，表明該蛋白具有作為祛皺緊致美容護(hù)膚化妝品原料的巨大潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：高媛媛,羅麗芬,劉浩,王希麗,潘發(fā)伍,方驍宇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：嘉文麗（福建）化妝品有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19