本發(fā)明屬于多肽制備和疾病治療，具體涉及一種基于cxcr4受體的靶向肽-喜樹(shù)堿綴合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、喜樹(shù)堿(camptothecin,cpt)作為一種吡咯喹啉細(xì)胞毒性生物堿，由wall等人在1966年在我國(guó)引種的喜樹(shù)中分離得到，具有廣泛的抗腫瘤活性。作為dna拓?fù)洚悩?gòu)酶i(topoi)抑制劑，喜樹(shù)堿通過(guò)與此酶結(jié)合，進(jìn)而抑制細(xì)胞的dna形成雙螺旋，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。特別是，具有代表性的衍生物伊立替康已被列入2019年世衛(wèi)組織抗癌治療基本藥物模型清單。然而其膜穿透性差、對(duì)正常細(xì)胞的高毒性和較差的水溶性極大地限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。

3、目前，針對(duì)于抗腫瘤藥物選擇性的問(wèn)題，一種主流的策略是使用靶向配體將細(xì)胞毒性藥物遞送到癌癥部位，再發(fā)揮其相應(yīng)的抗腫瘤活性。腫瘤特異性靶向多肽通過(guò)連接基團(tuán)與小分子抗腫瘤藥物共價(jià)偶聯(lián)，得到多肽藥物偶聯(lián)物(peptide-drug?conjugate,pdc)。pdc在腫瘤靶向治療方面有很廣闊的應(yīng)用前景，目前pdc藥物已獲批上市用于腫瘤的治療。由多肽修飾得到的pdc藥物有著選擇性高、腫瘤穿透性強(qiáng)、免疫原性較低、合成成本低等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的廣泛關(guān)注。

4、趨化因子受體4(cxcr4)的高表達(dá)與許多癌癥的不良預(yù)后和化療抵抗相關(guān)，cxcr4對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和對(duì)治療藥物的耐受性起著重要作用。motixafortide(bl8040,bkt-140)是一種由14個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，和cxcr4有高親和力，是cxcr4特異的抑制劑。本發(fā)明將抗腫瘤藥物喜樹(shù)堿與多肽motixafrotide通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，增加其對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇殺傷作用，開(kāi)發(fā)新型高效的pdc化合物用抗腫瘤的治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)喜樹(shù)堿對(duì)正常細(xì)胞毒性大以及水溶性差的缺點(diǎn)，本發(fā)明通過(guò)將cxcr4特異性拮抗劑motixafortide(fxy-904)作為靶向肽與喜樹(shù)堿相連，提高其水溶性并增加其抗腫瘤的選擇性。此外，本發(fā)明通過(guò)將不同數(shù)量的喜樹(shù)堿偶聯(lián)到多肽上得到一系列motixafortide和不同數(shù)量喜樹(shù)堿的偶聯(lián)物。本發(fā)明通過(guò)可降解的酯鍵將motixafortide和喜樹(shù)堿偶聯(lián)在一起，使pdc可以緩慢持續(xù)釋放喜樹(shù)堿并發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，本發(fā)明采用了基于熒光內(nèi)自淬滅原理將熒光淬滅基團(tuán)二硝基苯基(dnp)引入到偶聯(lián)物中，達(dá)到了從空間和時(shí)間水平實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)喜樹(shù)堿釋放的目的。

2、具體的，本發(fā)明通過(guò)如下所述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物，所述motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物包含如下氨基酸殘基序列：

4、

5、上述motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物可以大幅度提高喜樹(shù)堿的水溶性，幫助其識(shí)別并進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，從而使喜樹(shù)堿更容易到達(dá)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，與topoⅰ-dna形成的復(fù)合物結(jié)合，阻止dna復(fù)制及rna合成。此外，motixafortide具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的效果。喜樹(shù)堿和motixafortide通過(guò)協(xié)同作用發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí)，利用基于喜樹(shù)堿/dnp的熒光內(nèi)自淬滅原理，從時(shí)間和空間水平實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)喜樹(shù)堿的釋放。

6、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供上述mortixafortide-喜樹(shù)堿綴合物的制備方法，所述制備方法包括采用多肽固相合成法合成mortixafortide，利用賴氨酸、丁二酸以及aeea等連接基團(tuán)將多肽和喜樹(shù)堿共價(jià)連接得到多肽藥物偶聯(lián)物。

7、具體的，以9-芴甲氧羰基為基礎(chǔ)的固相多肽合成法(fmoc-spps)合成上述多肽。

8、本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供上述motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物在制備抗癌或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

9、優(yōu)選的，所述癌癥或腫瘤可以選自乳腺癌、鼻咽癌、胸腺癌、膀胱癌、支氣管肺癌，非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌，卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤、甲狀腺乳頭狀癌、頭頸部鱗癌、睪丸癌。

10、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述癌癥或腫瘤為高表達(dá)cxcr4的人癌癥或腫瘤。

11、本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供上述多肽-喜樹(shù)堿綴合物的藥物釋放情況的監(jiān)測(cè)化合物。本發(fā)明的喜樹(shù)堿與dnp共價(jià)連接的motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物，在喜樹(shù)堿與多肽共價(jià)連接時(shí)無(wú)明亮的熒光，而當(dāng)喜樹(shù)堿從多肽上釋放下來(lái)時(shí)，dnp無(wú)法吸收游離的喜樹(shù)堿熒光，從而發(fā)射較明亮的藍(lán)色熒光，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在時(shí)空水平實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)喜樹(shù)堿的釋放，還可將此用于細(xì)胞、組織和動(dòng)物活體成像，進(jìn)而探究motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物在細(xì)胞、分子、組織、動(dòng)物水平的分布，抗腫瘤活性和抗腫瘤作用機(jī)制。

12、上述技術(shù)方案的有益效果如下：

13、1.本發(fā)明合成的mortixafortide-喜樹(shù)堿綴合物，增強(qiáng)了24h喜樹(shù)堿對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。其中，綴合物的ic50(24h)如下:在b16-f10細(xì)胞中，12.8±1.7μm(fxy-922)，19.5±2.3μm(fxy-925)，65.8±4.5μm(fxy-926)，209.8±3.8μm(fxy-927)，在mcf-7細(xì)胞中，56.2±2.7μm(fxy-922)，98.7±3.5μm(fxy-925)，184.1±3.4μm(fxy-926)，>300μm(fxy-927)，在a549細(xì)胞中，51.3±4.2μm(fxy-922)，64.1±5.6μm(fxy-925)，162.8±2.7μm(fxy-926)，>300μm(fxy-927)，在4t1細(xì)胞中，18.9±3.8μm(fxy-922)，30.9±2.4μm(fxy-925)，84.9±3.4μm(fxy-926)，>300μm(fxy-927)，在hep3b細(xì)胞中，30.5±2.3μm(fxy-922)，41.4±5.1μm(fxy-925)，113.4±5.7μm(fxy-926)，>300μm(fxy-927)，最后在hepa1-6細(xì)胞中，37.9±1.8μm(fxy-922)，60.1±1.7μm(fxy-925)，>300μm(fxy-926)，>300μm(fxy-927)，較原型抗癌藥物喜樹(shù)堿(ic50:>133μm)有較大的改善。

14、2.上述技術(shù)方案可在短時(shí)間內(nèi)提高喜樹(shù)堿的膜透過(guò)能力。本項(xiàng)目采用cxcr4受體拮抗劑motixafortide與喜樹(shù)堿共價(jià)連接。motixafortide可以特異性的靶向腫瘤細(xì)胞表面的cxcr4，并進(jìn)入細(xì)胞中，相比于喜樹(shù)堿單體，motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物可以攜帶著喜樹(shù)堿在短時(shí)間內(nèi)識(shí)別腫瘤細(xì)胞并進(jìn)入細(xì)胞，極大地提高了喜樹(shù)堿的選擇性和膜透過(guò)性，進(jìn)而使大量的喜樹(shù)堿進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。

15、3.上述技術(shù)方案可大幅提高喜樹(shù)堿的水溶性。本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物在水中的溶解度>3000μm，相較于喜樹(shù)堿單體的溶解度(2.83μm)有了極大地提高。

16、4.上述技術(shù)方案可以通過(guò)分子內(nèi)自淬滅原理實(shí)現(xiàn)對(duì)喜樹(shù)堿釋放的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。該發(fā)明的綴合物由于是通過(guò)喜樹(shù)堿的活性必需基團(tuán)羥基與多肽偶聯(lián)，因此喜樹(shù)堿需要從綴合物上釋放下來(lái)，才可以發(fā)揮抗腫瘤活性。利用喜樹(shù)堿自身發(fā)射藍(lán)色熒光，將其與熒光淬滅基團(tuán)dnp連用，當(dāng)喜樹(shù)堿從多肽上釋放下來(lái)時(shí)，dnp無(wú)法吸收游離的喜樹(shù)堿的熒光，從而發(fā)射較明亮的藍(lán)色熒光，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)喜樹(shù)堿釋放的監(jiān)測(cè)。可將此技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞、組織和活體動(dòng)物成像水平，進(jìn)而探索綴合物在分子、細(xì)胞、組織和動(dòng)物體內(nèi)水平的分布與釋放情況。

17、5.上述技術(shù)方案可以提高喜樹(shù)堿的選擇性。喜樹(shù)堿為廣譜類細(xì)胞毒性藥物，對(duì)各種腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞選擇性較差。上述技術(shù)方案得到的綴合物的靶點(diǎn)為cxcr4，因此，此綴合物可以大量靶向并內(nèi)吞進(jìn)cxcr4高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，而較少的內(nèi)吞進(jìn)cxcr4低表達(dá)或者不表達(dá)的細(xì)胞中，進(jìn)而達(dá)到提高喜樹(shù)堿對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，降低毒性的目的。

18、6.上述技術(shù)方案可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。motixafortide具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的效果。上述技術(shù)方案得到的motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物可以在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。motixafortide和喜樹(shù)堿協(xié)同作用，能夠更好地抑制并殺滅腫瘤細(xì)胞。

19、綜上所述，喜樹(shù)堿雖然具有廣譜的抗腫瘤活性，但其低水溶性、膜穿透性低，以及毒性大等問(wèn)題限制了其廣泛應(yīng)用。針對(duì)上述不足，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了新型motixafortide-喜樹(shù)堿綴合物，改善了喜樹(shù)堿的水溶性，通過(guò)靶向cxcr4高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，提高喜樹(shù)堿的抗腫瘤活性，降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性和膜穿透性。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單有效，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。