本發(fā)明屬于酶工程領域，具體涉及一種具有酸堿耐受性的普魯蘭酶突變體及其應用。

背景技術：

1、普魯蘭酶(pullulanase)是一類淀粉脫支酶，因其能專一性水解普魯蘭糖(pullulan，麥芽三糖以α-1，6糖苷鍵連接起來的聚合物)而得名，屬淀粉酶類，能夠專一性切開支鏈淀粉分支點中的α-1，6糖苷鍵，切下整個分支結構，形成直鏈淀粉。

2、但是，現(xiàn)有的普魯蘭酶仍然存在很多缺陷。第一、較為顯著的缺陷是酶活力低，不同研究人員將不同來源(bacillus?acidopullulyticus、bacillus?deramificans、bacillus?naganoensis)的普魯蘭酶在大腸桿菌中進行表達，但是其酶活遠遠達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求；第二、熱穩(wěn)定性差，例如，來源于shewanella?arctica的普魯蘭酶，其在40℃下的半衰期僅有20min；來源于bacillus?megaterium的普魯蘭酶，其在40℃下處理后，只能殘余40％的酶活，而淀粉水解的過程常需要一定的溫度(40℃左右)；第三、酶的耐酸性差，淀粉的糖化過程在ph?4.5-5.0的范圍內進行，而大多數(shù)種類的普魯蘭酶在此范圍內活性很低。

3、目前利用基因工程技術手段對普魯蘭酶的改良主要集中在耐熱性，酸堿耐受性的改善。但是目前獲得的普魯蘭酶仍然普遍存在熱穩(wěn)定性產(chǎn)、酸堿耐受性差、酶活低等缺點，不能廣泛適用于各種ph指和不同溫度條件下的普魯蘭多糖的水解。

4、因此，如何獲得一種熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性好的普魯蘭酶對于工業(yè)生產(chǎn)至關重要。本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)，將親代普魯蘭酶(氨基酸序列如seq?id?no.1所示)序列中的第205位、288位和387位的賴氨酸同時突變?yōu)楸奖彼岬玫搅艘环N普魯蘭酶突變體，所述普魯蘭酶突變體在ph2.0-10.0和溫度30℃-90℃之間均具有比親代普魯蘭酶更好的酶活力，具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種普魯蘭酶及其應用，具體包括以下內容：

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種普魯蘭酶突變體，所述普魯蘭酶突變體為將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的親本普魯蘭酶的第205位、288位和387位的賴氨酸同時突變?yōu)楸奖彼岖@得。

3、優(yōu)選地，所述普魯蘭酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

4、第二方面，本發(fā)明提供了一種含有上述第一方面所述普魯蘭酶突變體在酶解含有α-1，6糖苷鍵的多糖的產(chǎn)品中的應用。

5、優(yōu)選地，所述多糖為普魯蘭糖。

6、第三方面，本發(fā)明提供了一種編碼普魯蘭酶突變體的基因，所述基因序列如seqid?no.4所示。

7、第四方面，本發(fā)明提供了一種含有上述第二方面所述普魯蘭酶突變體基因的重組表達質粒/載體。

8、第五方面，本發(fā)明提供了一種含有上述第二方面所述普魯蘭酶突變體基因的宿主細胞。

9、優(yōu)選地，所述宿主細胞為細菌或真菌。

10、優(yōu)選地，所述細菌為大腸桿菌。

11、第六方面，本發(fā)明提供了上述第一方面所述普魯蘭酶突變體的制備方法，所述方法為：

12、將上述第五方面所述的宿主細胞接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心，分離獲得上述第一方面所述的普魯蘭酶突變體。

13、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種普魯蘭酶突變體，所述普魯蘭酶突變體是將親代普魯蘭酶(氨基酸序列如seq?id?no.1所示)序列中的第205位、288位和387位的賴氨酸同時突變?yōu)楸奖彼岖@得；所述的普魯蘭酶突變體在ph2.0-10.0和溫度30℃-90℃之間均具有比親代普魯蘭酶更好的酶活力，具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性，可廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中。

技術特征：

1.一種普魯蘭酶突變體，其特征在于，所述普魯蘭酶突變體是將氨基酸序列如seq?idno.1所示的親代普魯蘭酶的第205位、288位和387位的賴氨酸同時突變?yōu)楸奖彼岖@得。

2.如權利要求1所述的普魯蘭酶突變體，其特征在于，所述普魯蘭酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

3.如權利要求1或2所述的普魯蘭酶突變體在酶解含有α-1，6糖苷鍵的多糖的產(chǎn)品中的應用。

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述多糖為普魯蘭糖。

5.一種編碼如權利要求1或2所述普魯蘭酶突變體的基因，其特征在于，所述基因序列如seq?id?no.4所示。

6.一種含有權利要求5所述基因的重組表達質?；蜉d體。

7.一種含有權利要求5所述基因的宿主細胞。

8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為細菌或真菌。

9.如權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所述細菌為大腸桿菌。

10.如權利要求1或2所述普魯蘭酶突變體的制備方法，其特征在于，將權利要求7-9任一所述的宿主細胞接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心，分離獲得權利要求1或2所述的普魯蘭酶突變體。

技術總結
本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種具有酸堿耐受性的普魯蘭酶突變體及其應用。本發(fā)明在氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的親本普魯蘭酶的基礎上，將第205位、288位以及387位的賴氨酸突變?yōu)楸奖彼岷?，獲得了一種普魯蘭酶突變體；所述普魯蘭酶突變體在pH2.0?10.0和溫度30℃?90℃之間均具有比親代普魯蘭酶更好的酶活力，具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性，可廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，具有廣闊的應用前景。

技術研發(fā)人員：高英豪,王玉蓮,傅敏,宋衛(wèi)生
受保護的技術使用者：山東暢億聯(lián)生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/17