本發(fā)明涉及生物，特別是涉及一種重組病毒pedvδn?trvlp及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、由豬流行性腹瀉病毒(pedv)引起的豬流行性腹瀉(ped)是一種腸道傳染病，通常伴有腹瀉、脫水、食欲減退和發(fā)熱等癥狀，其導(dǎo)致哺乳期仔豬死亡率接近100％，已成為引起豬群腹瀉的主要病原之一，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

2、pedv病毒本身具有高突變性，因此導(dǎo)致各種突變型毒株不斷出現(xiàn)。在2010年前，采用cv777毒株制備的疫苗可以對(duì)原有流行毒株產(chǎn)生良好的免疫效果，因此ped在我國(guó)呈散發(fā)形式，并未造成嚴(yán)重危害。但自2010年，出現(xiàn)了新的pedv突變體(g2亞型)，目前已成為引起豬群腹瀉的主要病原之一，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。但目前該病致病機(jī)制仍不清楚，原有滅活疫苗不能再提供有效免疫保護(hù)，減毒活疫苗雖然具備良好的免疫原性，但也存在返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)；因此開(kāi)發(fā)一種安全、有效、免疫原性強(qiáng)的疫苗迫在眉睫。

3、通過(guò)對(duì)pedv基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可發(fā)現(xiàn)：pedv基因組全長(zhǎng)約28kb，與其他冠狀病毒類(lèi)似，pedv包括一個(gè)5’非編碼區(qū)，7個(gè)開(kāi)放閱讀框(orf1a、1b、2-6)和一個(gè)3'非編碼區(qū)?；蚪M編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白，包括s蛋白、e蛋白、m蛋白和n蛋白。冠狀病毒基因組編碼的核衣殼(n)蛋白在病毒復(fù)制周期中發(fā)揮多種功能。但是pedv?n基因缺失直接影響病毒的復(fù)制，不能重復(fù)再現(xiàn)病毒完整的生命周期，不利于相關(guān)致病機(jī)制研究。因此，本發(fā)明制備生產(chǎn)缺乏n基因的、仍具有轉(zhuǎn)錄、復(fù)制能力的pedv重組病毒(pedvδn?trvlp)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種重組病毒pedvδn?trvlp及其制備方法和應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，該重組病毒pedvδn?trvlp可在vero-n細(xì)胞系中穩(wěn)定增殖，證明其具有作為基因缺失疫苗的潛力，并為未來(lái)疫苗的研發(fā)提供重要思路。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一種重組病毒pedvδn?trvlp的制備方法，包括以下步驟：

4、將質(zhì)粒pbac-pedv-dr13s的n基因切割替換為報(bào)告基因序列，之后轉(zhuǎn)染至異位表達(dá)pedv?n蛋白的細(xì)胞，拯救出所述重組病毒pedvδn?trvlp；

5、所述質(zhì)粒pbac-pedv-dr13s是將yn200病毒的基因組序列構(gòu)建到bac載體上，再將yn200病毒的spike片段替換成dr13病毒的spike片段；

6、所述yn200病毒的全基因組序列在ncbi的登錄號(hào)為kt021233；

7、所述yn200病毒的spike片段的序列位于ncbi登錄號(hào)為kt021233的全基因組序列第20634-24785bp；所述dr13病毒的spike片段的序列位于ncbi登錄號(hào)為jq023162.1的全基因組序列第20610-24758bp。

8、進(jìn)一步地，利用核苷酸序列如seq?id?no.1-2所示的sgrna切割所述質(zhì)粒pbac-pedv-dr13s的n基因。

9、進(jìn)一步地，利用慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

10、進(jìn)一步地，所述細(xì)胞包含vero細(xì)胞；所述報(bào)告基因包含egfp基因。

11、本發(fā)明還提供所述的制備方法獲得的重組病毒pedvδn?trvlp。

12、本發(fā)明還提供所述的重組病毒pedvδn?trvlp在制備預(yù)防或治療豬流行性腹瀉病毒藥物中的應(yīng)用。

13、進(jìn)一步地，所述豬流行性腹瀉病毒藥物包括豬流行性腹瀉病毒疫苗。

14、進(jìn)一步地，所述豬流行性腹瀉病毒疫苗包括全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗或者基因工程疫苗。

15、本發(fā)明公開(kāi)了以下技術(shù)效果：

16、本發(fā)明利用包裝細(xì)胞中的異位表達(dá)進(jìn)行反式互補(bǔ)病毒n蛋白，從而產(chǎn)生重組病毒pedv△n?trvlp，通過(guò)對(duì)重組病毒的拯救、傳代鑒定及透射電鏡觀察，證實(shí)了pedvδn?trvlp可在vero-n細(xì)胞系中穩(wěn)定增殖，證明了pedvδn?trvlp毒株具有作為基因缺失疫苗的潛力。本方法使缺失pedv?n基因的病毒具有轉(zhuǎn)錄、復(fù)制能力，可以實(shí)現(xiàn)完整的病毒生命周期，并完全限制在異位表達(dá)pedv?n蛋白的細(xì)胞中，與傳統(tǒng)疫苗相比具有更高的安全性，可為未來(lái)疫苗的研發(fā)提供重要思路。

技術(shù)特征：

1.一種重組病毒pedvδn?trvlp的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，利用核苷酸序列如seq?id?no.1-2所示的sgrna切割所述質(zhì)粒pbac-pedv-dr13s的n基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，利用慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述細(xì)胞包含vero細(xì)胞；所述報(bào)告基因包含egfp基因。

5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法獲得的重組病毒pedvδn?trvlp。

6.如權(quán)利要求5所述的重組病毒pedvδn?trvlp在制備預(yù)防或治療豬流行性腹瀉病毒藥物中的應(yīng)用。

7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述豬流行性腹瀉病毒藥物包括豬流行性腹瀉病毒疫苗。

8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述豬流行性腹瀉病毒疫苗包括全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗或者基因工程疫苗。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組病毒PEDVΔN?trVLP及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，該制備方法包括將質(zhì)粒pBAC?PEDV?DR13S的N基因切割替換為報(bào)告基因序列，之后轉(zhuǎn)染至異位表達(dá)PEDVN蛋白的細(xì)胞，拯救出所述重組病毒PEDVΔN?trVLP。本發(fā)明還公開(kāi)了該重組病毒PEDVΔN?trVLP在制備預(yù)防或治療豬流行性腹瀉病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明使缺失PEDVN基因的病毒具有轉(zhuǎn)錄、復(fù)制能力，可以實(shí)現(xiàn)完整的病毒生命周期，并完全限制在異位表達(dá)PEDVN蛋白的細(xì)胞中，與傳統(tǒng)疫苗相比具有更高的安全性，可為未來(lái)疫苗的研發(fā)提供重要思路。

技術(shù)研發(fā)人員：彭貴青,張金濤,焦哲,史月軍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17