本發(fā)明涉及中草藥的提取加工技術(shù)，具體是關(guān)于一種鐵皮石斛多糖的酶解法提取工藝。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛dendrobiumofficinalekimuraetmigo的干燥莖。具有滋陰養(yǎng)胃、潤肺止咳和清熱明目之功效，是傳統(tǒng)的珍稀名貴中藥材之一，名列“九大仙草”之首，因具有抗腫瘤、抗衰老、抗聲帶疲勞、擴張血管和增強人體免疫力等作用，被稱為救命仙草。由于石斛自然繁殖力低，種子需與真菌共生才能萌發(fā)，加上長期采挖，使得野生鐵皮石斛資源日漸枯竭，成為瀕危植物，被列為國家重點保護的野生藥材品種，因此鐵皮石斛資源的有效利用日益受到科研工作者的關(guān)注。

鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱等功效，用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨痿軟以及惡性腫瘤的輔助治療以及慢性咽炎、慢性胃炎、糖尿病和久病體虛免疫功能低下等。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，鐵皮石斛中含有的主要活性成分為石斛多糖、石斛堿、氨基酸、芪類及其衍生物、微量元素以及多種揮發(fā)性成分等。石解多糖主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等單糖組成，是其具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、增強免疫功能、降低血糖，抗肝損傷等活性的主要成分。多糖含量的高低是判斷鐵皮石解質(zhì)量優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)(《中國藥典》2015年版一部第282頁石斛項下規(guī)定)。

傳統(tǒng)水提法是提取鐵皮石解多糖的主要方法，近年有超聲或微波輔助水提法、酶解法、超高壓提取法、閃式提法等用于鐵皮石斛多糖的提取。葉余原[文獻1：超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究[j].中藥材,2009,32(04):617-620.]采用超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究結(jié)果以料液比1∶30的，50℃超聲水浴，45khz超聲頻率，提取1.5h，鐵皮石斛多糖的平均提取得率為15.3％。尚喜雨等[文獻2：正交實驗優(yōu)選鐵皮石斛多糖提取工藝的研究[j].遼寧中醫(yī)雜志,2010,37(04):708-709.]采用微波輔助提取鐵皮石斛多糖，在微波功率400w，ph值為8，微波作用時間6min，料液比1:50的條件下多糖提取量為17.48％?？v偉等[文獻3：石斛多糖超高壓提取工藝條件的優(yōu)化[j].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,27(04):36-39.]采用超高壓方法提取鐵皮石斛中的多糖成分，將石斛粉碎到80目后，按固液比1∶20，采用300mpa的壓力提取6min后，石斛多糖的得率達到19.27％。王培培等[文獻4：正交實驗法優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝[j].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(11):2781-2782.]料液比1∶40，浸提溫度70℃，浸提時間2h，浸提2次，鐵皮石斛多糖的得率達到31.9％。唐政等[文獻5：混合酶提法提取鐵皮石斛中石斛多糖的優(yōu)化工藝研究[j].北方園藝,2014,(06):132-134.]采用纖維素酶與果膠酶的等量混合提取鐵皮石斛多糖。結(jié)果在工藝條件ph6.5、1％濃度的纖維素酶和果膠酶1∶1等量混合、50℃下提取135min，石斛多糖提取率為41.33％。吳迪等[文獻6：鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化研究[j].浙江科技學(xué)院學(xué)報,2016,28(06):444-449.]實驗結(jié)果表明，料液質(zhì)量比1∶120、浸提溫度70℃、浸提90min時提取鐵皮石斛多糖提取率為55.2％。

因此，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員致力于研究一種提高鐵皮石斛多糖提取率的提取工藝，從而提高鐵皮石斛資源的有效利用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明公開了一種酶解法提取鐵皮石斛多糖的工藝。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：

一種酶解法提取鐵皮石斛多糖的工藝，其包括背板，其包括以下步驟：

(1)以果膠酶、纖維素酶和漆酶按1-2:1-3:0.5-2.5的重量比例混合制成復(fù)合酶系，溶解于使用冰乙酸溶液調(diào)節(jié)ph值至4.0-6.0的緩沖液中；

(2)取鐵皮石斛，粉碎過20～80目篩，加入4-6倍量上述含有復(fù)合酶系的冰乙酸緩沖溶液；

(3)控制酶解溫度30-50℃，酶解1-3h；

(4)轉(zhuǎn)移至適宜容器中，加飲用水4-8倍，回流提取2h，120目篩濾過，濾液濃縮至相對密度1.25-1.40，溫度為60℃；

(5)加入乙醇使藥液含醇量達70～80％，攪拌均勻，靜置12h后，離心，收集沉淀物，揮去乙醇；

(6)60～80℃真空干燥，即得。

所述復(fù)合酶酶解工藝條件為：鐵皮石斛粉碎過20-80目篩、ph4.0-5.5的含有藥材質(zhì)量1.5％復(fù)合酶的緩沖液、30-50℃條件下處理1～2h；轉(zhuǎn)移至適宜容器中，加飲用水4-6倍體積，回流提取2h，120目篩濾過，濾液濃縮至相對密度1.25-1.40溫度為60℃；

加入乙醇使藥液含醇量達70～80％，攪拌均勻，靜置12h后，離心，收集沉淀物，揮去乙醇；60～80℃真空干燥，即得。

所述復(fù)合酶酶解工藝條件為：鐵皮石斛粉碎過20目篩、加入4倍量ph5.0的含有藥材質(zhì)量1.5％復(fù)合酶的緩沖液、45℃條件下處理1.5h；

轉(zhuǎn)移至提取器中，加入6倍飲用水，回流提取2h，120目篩濾過，濾液濃縮至相對密度1.40，溫度為60℃，加入乙醇使藥液含醇量達80％，攪拌均勻，靜置12h后，離心，收集沉淀物，揮去乙醇；60℃真空干燥，即得。分別測定多糖含量和甘露糖含量并計算提取率，結(jié)果鐵皮石斛多糖提取率為46.16％，甘露糖提取率為55.63％。

取鐵皮石斛，粉碎過40目篩；加入5倍量復(fù)合酶緩沖液，復(fù)合酶緩沖液中果膠酶、纖維素酶和漆酶按1-2:1-3:0.5-2.5的重量比例混合，加冰乙酸溶液調(diào)節(jié)ph值至4.0，控制酶解溫度50℃恒溫酶解120min；加飲用水5倍，回流提取2h，120目篩濾過，濾液濃縮至相對密度1.25，溫度為60℃，加入乙醇使藥液含醇量達70％，攪拌均勻，靜置12h后，離心，收集沉淀物，揮去乙醇；70℃真空干燥，即得。分別測定多糖含量和甘露糖含量并計算提取率，結(jié)果鐵皮石斛多糖提取率為43.27％，甘露糖提取率為52.83％。

取鐵皮石斛，粉碎過60目篩；加入6倍量復(fù)合酶緩沖液，復(fù)合酶緩沖液中果膠酶、纖維素酶和漆酶按1-2:1-3:0.5-2.5的重量比例混合，加冰乙酸溶液調(diào)節(jié)ph值至6.0，控制酶解溫度55℃恒溫酶解120min；

加飲用水4倍，回流提取2h，120目篩濾過，濾液濃縮至相對密度1.35，溫度為60℃，加入乙醇使藥液含醇量達80％，攪拌均勻，靜置12h后，離心，收集沉淀物，揮去乙醇；80℃真空干燥，即得。分別測定多糖含量和甘露糖含量并計算提取率，結(jié)果鐵皮石斛多糖提取率為39.88％，甘露糖提取率為48.26％。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明具有操作簡單、提取加液量少、易干燥、耗時短、提取率高的特點，有利于進一步進行有關(guān)藥品、功能保健食品、食品、高級飼料的制備。以下是本工藝與有關(guān)文獻的資料對比：

下面結(jié)合附圖與具體實施方式，對本發(fā)明進一步說明。

附圖說明

圖1為不同復(fù)合酶對鐵皮石斛多糖提取率的影響圖。

具體實施方式

實施例1，參見圖1，本實施例提供的一種酶解法提取鐵皮石斛多糖的工藝。

1.1實驗材料

鐵皮石斛(批號yd160326)，購自浙江本草石斛科技有限公司。纖維素酶(批號l1531059)、果膠酶(批號l1531059)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；漆酶(寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司生產(chǎn))；d-無水葡萄糖對照品(110833-201506)、d-鹽酸氨基葡萄糖對照品(140649-201606)、d-甘露糖對照品(140651-201504)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2實驗方法與結(jié)果

1.2.1評價指標(biāo)選擇

1.2.1.1多糖的含量測定(紫外分光光度法)

多糖對照品溶液的制備取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每lml含90μg的溶液，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別置10ml具塞試管中，各加水補至1.0ml，精密加入5％苯酚溶液lml(臨用配制)，搖勻，再精密加硫酸5ml，搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰浴中冷卻5分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在488nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)約0.3g，精密稱定，加水200ml，加熱回流2小時，放冷，轉(zhuǎn)移至250ml量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2ml，置15ml離心管中，精密加入無水乙醇10ml，搖勻，冷藏1小時，取出，離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn))20分鐘，棄去上清液(必要時濾過)，沉淀加80％乙醇洗滌2次，每次8ml，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

測定法精密量取供試品溶液1ml，置10ml具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，自“精密加入5％苯酚溶液lml”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量，計算，即得。

1.2.1.2甘露糖的含量測定(高效液相色譜法)

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：0.02mol/l乙酸銨(a)-乙腈(b)梯度洗脫，0～20min(b:17％-17％),20～40min(b:17％-37％)；流速：1.00ml/min；檢測波長：250nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)按甘露糖峰計算應(yīng)不低于4000。

校正因子測定取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每lml含12mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取甘露糖對照品約10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液lml，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取400μl，加0.5mol/l的pmp(1-苯基-3-甲基-5-p比唑啉酮)甲醇溶液與0.3mol/l的氫氧化鈉溶液各400μl，混勻，70℃水浴反應(yīng)100分鐘。再加0.3mol/l的鹽酸溶液500μl，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2ml，棄去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10μl，注入液相色譜儀，測定，計算校正因子。

測定法取本品粉末(過三號篩)約0.12g，精密稱定，置索氏提取器中，加80％乙醇適量，加熱回流提取4小時，棄去乙醇液，藥渣揮去乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100ml，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2ml，煎煮小時并時時攪拌，放冷，加水補至約100ml，混勻，離心，吸取上清液1ml，置安瓿瓶或頂空瓶中，加3.0mol/l的鹽酸溶液0.5ml，封口，混勻，110℃水解1小時，放冷，用3.0mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至中性，吸取400μl，照校正因子測定方法，自“加0.5mol/l的pmp甲醇溶液”起，依法操作，取上清液注入液相色譜儀，測定，即得。

1.2.2提取方法

稱取鐵皮石斛飲片(粉碎成粗顆粒)50.00g，置于500ml燒杯中，加入200g預(yù)先用一定ph的冰醋酸水溶液溶解的復(fù)合酶溶液，于一定溫度的水浴鍋中恒溫酶解規(guī)定的時間；取出，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h,濾過(120目篩)，濾液濃縮，轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中，加飲用水至刻度，備用。

1.2.3復(fù)合酶法提取鐵皮石斛多糖工藝篩選

主要對影響提取的復(fù)合酶組成、藥材粉碎度、酶解ph、酶用量、酶解溫度、酶解時間等因素進行單因素考察，優(yōu)選復(fù)合酶法輔助提取鐵皮石斛多糖的工藝。

1.2.3.1不同復(fù)合酶對鐵皮石斛多糖提取率的影響

分別稱取粉碎過20目篩的鐵皮石斛50g，另取纖維素酶、果膠酶、漆酶組成復(fù)合酶，其用量為藥材質(zhì)量的1％，溶于用醋酸調(diào)節(jié)ph至5.5的緩沖液中，再與鐵皮石斛混合，水浴溫度40℃酶解1h，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h,濾過(120目篩)，濾液濃縮，轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中，加飲用水至刻度，測定多糖的提取率，結(jié)果如圖1所示。圖1結(jié)果顯示，復(fù)合酶e(纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1:3:2.5))的鐵皮石斛多糖的提取率高于其余各組，因此選擇復(fù)合酶纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1:3:2.5)進行鐵皮石斛多糖的進一步提取研究。

1.2.3.2藥材粉碎度對對鐵皮石斛多糖提取率的影響

分別稱取粉碎過10，20，40，60，80目篩的鐵皮石斛各50g，加入溶有藥材質(zhì)量的1％纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1-2:1-3:0.5-2.5)的復(fù)合酶緩沖液(用醋酸調(diào)節(jié)ph至5.5)，水浴40℃，酶解1h，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h,濾過(120目篩)，濾液濃縮，轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中，加飲用水至刻度，測定多糖的提取率，結(jié)果如表1。

表1藥材粉碎度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

表1結(jié)果顯示，粉碎度對鐵皮石斛多糖的提取率沒有顯著性影響，考慮到前處理的簡易性，以20目的粉碎度進行試驗。

1.2.3.3酶解ph對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取粉碎過20目篩的鐵皮石斛7份，每份50g，分別加入溶有藥材質(zhì)量的1％纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1-2:1-3:0.5-2.5)的復(fù)合酶緩沖液(分別用醋酸調(diào)節(jié)ph至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)，水浴40℃，酶解1h，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h,濾過(120目篩)，濾液濃縮，轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中，加飲用水至刻度，測定多糖的提取率，結(jié)果如表2。

表2酶解ph值對鐵皮石斛多糖提取率的影響

表2結(jié)果顯示，ph對鐵皮石斛多糖的提取率具有較顯著性的影響，復(fù)合酶在ph值為5.0時鐵皮石斛多糖的提取率最大，因此可以選擇酶解的ph值為5.0。

1.2.3.4酶的用量對對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取粉碎過20目篩的鐵皮石斛7份，每份50g，分別加入溶有藥材質(zhì)量的0.5％、0.75％、1.0％、1.25％、1.5％、1.75％、2.0％……15％纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1-2:1-3:0.5-2.5)的復(fù)合酶緩沖液(分別用醋酸調(diào)節(jié)ph至5.0)，水浴40℃，酶解1h，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h,濾過(120目篩)，濾液濃縮，轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中，加飲用水至刻度，測定多糖的提取率，結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖的提取率隨著復(fù)合酶用量的增加而增加，當(dāng)復(fù)合酶用量大于藥材量的10％，鐵皮石斛多糖的提取率增加不明顯。因此確定酶解時復(fù)合酶(纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1-2:1-3:0.5-2.5))的用量為原藥材的10％。

1.2.3.5溫度對對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取粉碎過20目篩的鐵皮石斛6份，每份50g，分別加入溶有藥材質(zhì)量的1.5％纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1-2:1-3:0.5-2.5)的復(fù)合酶緩沖液(分別用醋酸調(diào)節(jié)ph至5.0)，分別水浴25、30、35、40、45、50℃，酶解1h，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h，濾過(120目篩)，濾液濃縮，轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中，加飲用水至刻度，測定多糖的提取率，結(jié)果顯示，酶解溫度對鐵皮石斛多糖的提取率具有較顯著性的影響，復(fù)合酶在酶解溫度為45℃時鐵皮石斛多糖的提取率最大，因此可以選擇酶解的溫度為45℃。

1.2.3.6酶解時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取粉碎過20目篩的鐵皮石斛5份，每份50g，分別加入溶有藥材質(zhì)量的10％纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1-2:1-3:0.5-2.5)的復(fù)合酶緩沖液(分別用醋酸調(diào)節(jié)ph至5.0)，分別水浴45℃，酶解0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、4.5、5h，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h，濾過(120目篩)，濾液濃縮，轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中，加飲用水至刻度，測定多糖的提取率，結(jié)果顯示，酶解時間在大于4h后對鐵皮石斛多糖的提取率無顯著性影響，復(fù)合酶在酶解時間為4.5h后鐵皮石斛多糖的提取率基本達到平衡，不在增加，因此可以選擇酶解的時間為4.5h。

1.3最優(yōu)驗證實驗

稱取粉碎過20目篩的鐵皮石斛3份，每份50g，分別加入溶有藥材質(zhì)量的10％纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1︰1︰0.5)的復(fù)合酶緩沖液(分別用醋酸調(diào)節(jié)ph至5.0)，分別水浴25℃，酶解4.5h，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h，濾過(120目篩)，濾液濃縮，轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶中，加飲用水至刻度，測定多糖的提取率，結(jié)果如表3。

表3優(yōu)選工藝驗證試驗結(jié)果

表3結(jié)果顯示，3次驗證試驗結(jié)果基本相近，接近于優(yōu)選過程中的各試驗的最大值，說明優(yōu)選的條件基本穩(wěn)定、合理。

1.4濃縮、干燥考察

取粉碎過20目篩的鐵皮石斛500g；加入溶有藥材質(zhì)量的1.5％纖維素酶︰果膠酶︰漆酶(1-2:1-3:0.5-2.5)的復(fù)合酶緩沖液(分別用醋酸調(diào)節(jié)ph至5.0)，分別水浴25℃，酶解4.5h，轉(zhuǎn)移至1000ml圓底燒瓶中，補加300g飲用水，回流提取2h，濾過(120目篩)，濾液濃縮至相對密度1.40(60℃)，加入乙醇使溶液含醇量達80％，攪拌均勻，靜置24h后，離心，收集沉淀物，揮去乙醇；60℃真空干燥，即得。分別測定多糖含量和甘露糖含量并計算提取率，結(jié)果鐵皮石斛多糖提取率為46.16％，甘露糖提取率為55.63％。

實施例2

取鐵皮石斛，粉碎過40目篩；加入4倍量復(fù)合酶緩沖液(果膠酶-纖維素酶-漆酶(1-2:1-3:0.5-2.5)，加冰乙酸溶液調(diào)節(jié)ph值至4.0)，控制酶解溫度50℃恒溫酶解140min；加飲用水5倍，回流提取2h，濾過(120目篩)，濾液濃縮至相對密度1.30(60℃)，加入乙醇使溶液含醇量達75％，攪拌均勻，靜置12h后，離心，收集沉淀物，揮去乙醇，70℃真空干燥，即得。分別測定多糖含量和甘露糖含量并計算提取率，結(jié)果鐵皮石斛多糖提取率為43.27％，甘露糖提取率為52.83％。

實施例3

取鐵皮石斛，粉碎過60目篩；加入6倍量復(fù)合酶緩沖液(果膠酶-纖維素酶-漆酶(1:1:0.5)，加冰乙酸溶液調(diào)節(jié)ph值至6.0)，控制酶解溫度55℃恒溫酶解120min；加飲用水4倍，回流提取2h，濾過(120目篩)，濾液濃縮至相對密度1.25(60℃)，加入乙醇使溶液含醇量達70％，靜置36h后，離心，收集沉淀物，揮去乙醇；80℃真空干燥，即得。分別測定多糖含量和甘露糖含量并計算提取率，結(jié)果鐵皮石斛多糖提取率為39.88％，甘露糖提取率為48.26％。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的技術(shù)手段和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。故凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明之形狀、構(gòu)造及原理所作的等效變化，均應(yīng)涵蓋于本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。