專(zhuān)利名稱(chēng)：一種規(guī)?；咝Э焖俜敝宠F皮石斛試管苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物的栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種繁殖鐵皮石斛試管苗的方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛是我國(guó)藥典中記載的一種極為珍稀名貴中藥材，素有“中華仙草”、“藥中黃金”之美稱(chēng)，被國(guó)際藥用植物界稱(chēng)為“藥界大熊貓”，現(xiàn)已成為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，隨著野生資源的枯竭，而不斷攀升的市場(chǎng)需求，促進(jìn)了人工栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而產(chǎn)業(yè)發(fā)展中優(yōu)質(zhì)種苗繁育環(huán)節(jié)越來(lái)越成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸?，F(xiàn)有的種苗快繁過(guò)程中，通常整個(gè)生產(chǎn)階段采取了種子播種到固體培養(yǎng)基中，繼代轉(zhuǎn)接，壯苗生根等階段，從播種到壯苗生根整個(gè)生產(chǎn)階段完全由日光燈作為光源，導(dǎo)致生產(chǎn)周期長(zhǎng)、種子萌發(fā)率低、種苗玻璃化及變異率大、能耗高， 生產(chǎn)成本大、移栽成活率低等問(wèn)題，試管苗整個(gè)生產(chǎn)階段耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)8 10個(gè)月，成苗后還需要經(jīng)歷練苗階段才能轉(zhuǎn)移到大棚栽培種植。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題，是提供一種規(guī)?；咝Э焖俜敝宠F皮石斛試管苗的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種規(guī)模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，該方法包括以下步驟(1)將鐵皮石斛蒴果先用酒精浸泡45 60s，再放置于氯化汞水溶液中浸泡12 15min，再用無(wú)菌水反復(fù)漂洗3 4次，將消毒后的蒴果切開(kāi)，取種子備用；(2)將步驟(1)得到的鐵皮石斛種子播種于液體培養(yǎng)基中，在22 25°C、轉(zhuǎn)速 120 150r/min、光照度300 1000勒克斯、光照時(shí)間11 l!3h/d的條件下，振蕩培養(yǎng)50 60d，種子萌發(fā)形成原球莖并進(jìn)一步形成小芽，取小芽備用；其中，所述的液體培養(yǎng)基組成為6-芐基嘌呤0. 2 0. %ig/L+萘乙酸0. 1 0. 3mg/L+ 土豆汁60 80g/L+蔗糖25 30g/L+l/4MS培養(yǎng)基+pH 5. 4 5. 6 ；通過(guò)液體振蕩培養(yǎng)，種子萌發(fā)率可達(dá)90%以上。(3)將步驟(2)得到的小芽置于壯苗培養(yǎng)基中，在25 ^°C、光照度1000 2000 勒克斯、光照時(shí)間11 nh/d的條件下培養(yǎng)2 2. 5個(gè)月，小芽變成具有2 3片葉并帶有 1 2條幼根的小苗；其中，所述的壯苗培養(yǎng)基組成為萘乙酸0.8 1.0mg/L+香蕉汁80 100g/L+蔗糖25 30g/L+改良的N6培養(yǎng)基+瓊脂4. 5 6g/L+pH 5. 6 5. 8，所述改良的 N6培養(yǎng)基是將N6培養(yǎng)基中的大量元素中KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調(diào)整為3000mg/L和 200mg/L，其余的成分不變；通過(guò)改良原有的N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基，更利于鐵皮石斛幼苗的生長(zhǎng)。(4)將步驟(3)中得到的小苗轉(zhuǎn)移到壯苗生根培養(yǎng)基中，并將組培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮蔭的大棚溫室苗床上，溫度控制在25 30°C，利用太陽(yáng)光或自然光作為光源進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 3個(gè)月得到成苗；其中，所述的壯苗生根培養(yǎng)基組成為奈乙酸1. 0 1. 5mg/L+香蕉汁80 100g/L+蔗糖25 30g/L+活性炭為0. 5 0. 8g/L+改良的N6培養(yǎng)基+瓊脂4. 5-6g/L+pH 5. 6 5. 8，所述改良的N6培養(yǎng)基是將N6培養(yǎng)基中的大量元素中KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調(diào)整為3000mg/L和200mg/L，其余的成分不變；通過(guò)改良原有的N6 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，更利于鐵皮石斛幼苗的生長(zhǎng)。將組培苗的培養(yǎng)環(huán)境從相對(duì)潔凈培養(yǎng)室中轉(zhuǎn)移至有外遮蔭的大棚溫室條件下，利用太陽(yáng)光或自然光作為光源，用濕水簾和風(fēng)機(jī)降溫，不僅符合低碳高效原則，而且也能促進(jìn)種苗生長(zhǎng)健壯，適應(yīng)性強(qiáng)，省去了組培苗的練苗環(huán)節(jié)，大大提高了移栽后成活率，一般可達(dá)96%以上。(5)將步驟(4)得到的成苗從瓶?jī)?nèi)取出用清水沖洗去除培養(yǎng)基后，用高錳酸鉀溶液浸泡3 5s，晾干，待其根部泛白后，移栽到溫室大棚內(nèi)的栽培基質(zhì)中，培養(yǎng)M 30個(gè)月，即可采收；所述的栽培基質(zhì)為碎石子與碎松樹(shù)皮按體積(1 1.幻(3 4. 5)組成的混合物。步驟(1)中，所述的酒精，體積百分濃度為體積百分濃度為70% 75%。步驟(1)中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的質(zhì)量百分含量為0.1% 0.15%。步驟⑵中，所述的液體培養(yǎng)基優(yōu)選組成為6-芐基嘌呤0. ang/L+萘乙酸0. 2mg/ L+ 土豆汁 80g/L+ 蔗糖 25g/L+l/4MS 培養(yǎng)基 +pH 5. 4步驟C3)中，所述的壯苗培養(yǎng)基優(yōu)選組成為萘乙酸0. 8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖 25g/L+改良的N6培養(yǎng)基+瓊脂5g/L+pH 5. 6。步驟(4)中，所述的壯苗生根培養(yǎng)基優(yōu)選組成為奈乙酸1. 5mg/L+香蕉汁80g/L+ 蔗糖30g/L+活性炭為0. 5g/L+改良的N6培養(yǎng)基+瓊脂5g/L+pH 5. 8。步驟(4)中，所述的封口膜為聚四氟乙烯(PTFE)細(xì)菌濾膜，封口膜層數(shù)為一層。加一層封口膜可以防止室外環(huán)境造成組培苗的污染。步驟(5)中，高錳酸鉀溶液的濃度為0. 1 0. 15g/L。步驟(5)中，碎石子的粒徑為1 3cm，碎松樹(shù)皮的長(zhǎng)和寬分別為1 3cm。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、鐵皮石斛蒴果消毒后，將種子播散到步驟O)中的液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，與現(xiàn)有的種子萌發(fā)培養(yǎng)方式相比，該方法種子養(yǎng)分吸收更加充分，萌發(fā)時(shí)間大大縮短20 25d，并且萌發(fā)率高達(dá)90%以上，變異率小于1 %，出芽整齊。2、步驟C3)所述的壯苗培養(yǎng)基中，將N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行改良，將其中的大量元素 KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調(diào)整為3000mg/L和200mg/L，并配以適當(dāng)?shù)募に睾吞烊惶砑游锝M合，與傳統(tǒng)的壯苗培養(yǎng)基相比，該方法能更好更快的促進(jìn)小芽的生長(zhǎng)和生根，平均2 2. 5個(gè)月，可得到3 5cm長(zhǎng)的小苗。3、步驟中適當(dāng)?shù)恼{(diào)整生長(zhǎng)素的濃度，添加少量的活性碳配成壯苗生根培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)環(huán)境從室內(nèi)移至溫室大棚中，利用太陽(yáng)光或自然光進(jìn)行培養(yǎng)，能充分利用太陽(yáng)光光譜廣、光譜段能量分布均勻等優(yōu)勢(shì)促進(jìn)小苗的生長(zhǎng)，與常規(guī)的方法相比，該方法可以提高小苗的生長(zhǎng)速度、健壯度，并減少能耗，成苗后，移栽適應(yīng)性好，成活率高98 %以上，是一種低碳高效的培養(yǎng)模式。


圖1為三種不同培養(yǎng)基處理種子萌發(fā)和生長(zhǎng)情況。圖2為實(shí)施例3中處理①和處理④播種50天后得出的試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 (1)在接種室超凈工作臺(tái)上，將未開(kāi)裂的鐵皮石斛蒴果，放置于廣口瓶中，往瓶?jī)?nèi)倒入70% (ν/ν)酒精，浸泡50s左右，將酒精濾出，再用0.1% (w/w)的氯化汞水溶液浸泡約12 15min，浸泡過(guò)程中反復(fù)水平振蕩，使蒴果表面消毒徹底，再用無(wú)菌水反復(fù)漂洗3 4次，將消毒后的蒴果切開(kāi)，取種子備用。(2)將鐵皮石斛種子播種于1/4MS培養(yǎng)基+6-芐基嘌呤0. 2mg/L+萘乙酸0. 2mg/ L+土豆汁80g/L+蔗糖25g/L，pH 5. 4的液體培養(yǎng)基中；并放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度25°C、轉(zhuǎn)速120 150r/min、光照度300 1000勒克斯、光照時(shí)間12h/d，振蕩培養(yǎng)50 60d，種子萌發(fā)先形成原球莖并進(jìn)一步形成帶一片葉的小芽，取小芽備用。(3)將得到的小芽轉(zhuǎn)接到改良的N6培養(yǎng)基+萘乙酸0. 8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖 25g/L+瓊脂5g/L，pH 5. 6的壯苗培養(yǎng)基中；所述改良的N6培養(yǎng)基是將N6培養(yǎng)基中的大量元素中KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調(diào)整為3000mg/L和200mg/L，其余的成分不變，以下相同；培養(yǎng)室環(huán)境設(shè)置為溫度25 ^°C、光照度1000 1200勒克斯、光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)2 2. 5個(gè)月，小芽變成具有2 3片葉并帶有1 2條幼根的小苗。(4)將得到的小苗轉(zhuǎn)移到改良的N6培養(yǎng)基+奈乙酸1. 5mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖 30g/L+活性炭為0. 5g/L++瓊脂5g/L+pH 5. 8壯苗生根培養(yǎng)基中，并將組培瓶瓶口多加一層PTFE細(xì)菌濾膜，能有效的降低組培苗在溫室大棚外界環(huán)境下污染的問(wèn)題，移至有外遮蔭的大棚溫室苗床，溫度控制在25 30°C，利用太陽(yáng)光或自然光作為光源進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2個(gè)月左右得到成苗。(5)將得到的成苗從瓶?jī)?nèi)取出用清水沖洗去除培養(yǎng)基后，用0. 1 0. 15g/L高錳酸鉀溶液浸泡3 5s，晾干，待其根部泛白后，移栽到溫室大棚內(nèi)的栽培基質(zhì)中，即進(jìn)入栽培種植環(huán)節(jié)，24 30個(gè)月，即可采收入藥；上述的栽培基質(zhì)為碎石子與碎松樹(shù)皮按體積(1 1.5) (3 4. 5)混勻而成。實(shí)施例2 除實(shí)施例1中步驟( 種子播種于液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)改為固體培養(yǎng)基萌發(fā)、步驟(5)溫室大棚自然光和太陽(yáng)光培養(yǎng)改為培養(yǎng)室日光燈培養(yǎng)外，其它同實(shí)施例1 ；步驟(2)、 步驟(3)、步驟(4)中種子萌發(fā)、壯苗培養(yǎng)、壯苗生根培養(yǎng)三個(gè)階段分別以表1所列培養(yǎng)基組合進(jìn)行篩選，以?xún)?yōu)選最適培養(yǎng)基組合配方。表1說(shuō)明①培養(yǎng)基配方優(yōu)化主要是設(shè)計(jì)不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素濃度、天然添加物、活性炭濃度等對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，本實(shí)例中均設(shè)計(jì)成固體培養(yǎng)基，每種配方中瓊脂濃度均為5g/L，蔗糖為25g/L，培養(yǎng)環(huán)境為溫度25V、 光照度1000 2000勒克斯、光照時(shí)間iai/d培養(yǎng)室內(nèi)。②針對(duì)生產(chǎn)，不同的培養(yǎng)階段設(shè)計(jì)了三組培養(yǎng)基配方，種子播種階段主要觀察種子萌發(fā)的快慢、長(zhǎng)勢(shì)、顏色(翠綠為佳)、原球莖是否增殖(越少越好)等指標(biāo)判斷配方是否合理；壯苗培養(yǎng)階段，主要通關(guān)觀察苗的生長(zhǎng)勢(shì)、粗度、玻璃化程度(越低越好)、顏色以及整齊度等指標(biāo)來(lái)判斷配方的好壞；壯苗生根階段，主要通關(guān)觀察苗的健壯度、根系發(fā)達(dá)程度、苗的長(zhǎng)勢(shì)、顏色以及整齊度等指標(biāo)來(lái)判斷配方的好壞。通過(guò)觀察和各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，并用“★”和“☆”的多少代表配方的好壞，★越多表示越好，☆比★要低一個(gè)等次。
表1培養(yǎng)基配方篩選
權(quán)利要求
1.一種規(guī)?；咝Э焖俜敝宠F皮石斛試管苗的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將鐵皮石斛蒴果先用酒精浸泡45 60s，再放置于氯化汞水溶液中浸泡12 15min，再用無(wú)菌水反復(fù)漂洗3 4次，將消毒后的蒴果切開(kāi)，取種子備用；(2)將步驟(1)得到的鐵皮石斛種子播種于液體培養(yǎng)基中，在22 25°C、轉(zhuǎn)速120 150r/min、光照度300 1000勒克斯、光照時(shí)間11 l!3h/d的條件下，振蕩培養(yǎng)50 60d， 種子萌發(fā)形成原球莖并進(jìn)一步形成小芽，取小芽備用；其中，所述的液體培養(yǎng)基組成為 6-芐基嘌呤0. 2 0. 4mg/L+萘乙酸0. 1 0. 3mg/L+ 土豆汁60 80g/L+蔗糖25 30g/ L+1/4MS 培養(yǎng)基 +pH 5. 4 5. 6 ；(3)將步驟(2)得到的小芽置于壯苗培養(yǎng)基中，在25 ^°C、光照度1000 2000勒克斯、光照時(shí)間11 13h/d的條件下培養(yǎng)2 2. 5個(gè)月，小芽變成具有2 3片葉并帶有 1 2條幼根的小苗；其中，所述的壯苗培養(yǎng)基組成為萘乙酸0. 8 1. Omg/L+香蕉汁80 100g/L+蔗糖25 30g/L+改良的N6培養(yǎng)基+瓊脂4. 5 6g/L+pH 5. 6 5. 8，所述改良的N6培養(yǎng)基是將N6培養(yǎng)基中的大量元素中KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調(diào)整為3000mg/L 和200mg/L，其余的成分不變；(4)將步驟(3)中得到的小苗轉(zhuǎn)移到壯苗生根培養(yǎng)基中，并將組培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮蔭的大棚溫室苗床上，溫度控制在25 30°C，利用太陽(yáng)光或自然光作為光源進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 3個(gè)月得到成苗；其中，所述的壯苗生根培養(yǎng)基組成為奈乙酸1. 0 1. 5mg/ L+香蕉汁80 100g/L+蔗糖25 30g/L+活性炭為0. 5 0. 8g/L+改良的N6培養(yǎng)基+瓊脂4. 5-6g/L+pH 5. 6 5. 8，所述改良的N6培養(yǎng)基是將N6培養(yǎng)基中的大量元素中KNO3和 (NH4)2SO4的濃度分別調(diào)整為3000mg/L和200mg/L，其余的成分不變；(5)將步驟(4)得到的成苗從瓶?jī)?nèi)取出用清水沖洗去除培養(yǎng)基后，用高錳酸鉀溶液浸泡3 5s，晾干，待其根部泛白后，移栽到溫室大棚內(nèi)的栽培基質(zhì)中，培養(yǎng)M 30個(gè)月，即可采收；所述的栽培基質(zhì)為碎石子與碎松樹(shù)皮按體積(1 1.幻(3 4. 5)組成的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(1)中，所述的酒精，體積百分濃度為70% 75%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；咝Э焖俜敝宠F皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(1)中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的質(zhì)量百分含量為0. 0. 15%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟( 中，所述的液體培養(yǎng)基組成為6-芐基嘌呤0. ang/L+萘乙酸0. ang/L+土豆汁80g/ L+ 蔗糖 25g/L+l/4MS 培養(yǎng)基 +pH 5. 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(3)中，所述的壯苗培養(yǎng)基組成為萘乙酸0. 8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖25g/L+改良的N6培養(yǎng)基+瓊脂5g/L+pH 5. 6。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；咝Э焖俜敝宠F皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟中，所述的壯苗生根培養(yǎng)基組成為奈乙酸1.5mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖30g/L+ 活性炭為0. 5g/L+改良的N6培養(yǎng)基+瓊脂5g/L+pH 5. 8。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于，步驟中，所述的封口膜為聚四氟乙烯細(xì)菌濾膜，封口膜層數(shù)為一層。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；咝Э焖俜敝宠F皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(5)中，高錳酸鉀溶液的濃度為0. 1 0. 15g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；咝Э焖俜敝宠F皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(5)中，碎石子的粒徑為1 3cm，碎松樹(shù)皮的長(zhǎng)和寬分別為1 3cm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種規(guī)?；咝Э焖俜敝宠F皮石斛試管苗的方法將鐵皮石斛蒴果消毒，漂洗，切開(kāi)，取種子；將種子播種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)50～60d，種子萌發(fā)形成原球莖并進(jìn)一步形成小芽；將小芽置于壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～2.5個(gè)月，小芽變成具有2～3片葉并帶有1～2條幼根的小苗；將小苗轉(zhuǎn)移到壯苗生根培養(yǎng)基中，并將組培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮蔭的大棚溫室苗床上，給予太陽(yáng)光或自然光，培養(yǎng)2～3個(gè)月得到成苗；將成苗從瓶?jī)?nèi)取出洗凈，消毒，晾干，移栽到溫室大棚內(nèi)的栽培基質(zhì)中，培養(yǎng)24～30個(gè)月，即可。本發(fā)明工藝可直接用于工廠化規(guī)?；姆N苗生產(chǎn)，具有污染少，種子萌發(fā)率高，變異率低，種苗健壯，生產(chǎn)成本低，移栽成活率高等優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102301953SQ20111020334
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者史俊, 席剛俊, 徐超, 楊鶴同, 趙桂華 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院