本發(fā)明涉及一種番茄黑環(huán)病毒rt-lamp檢測用的試劑盒及檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

番茄黑環(huán)病毒tomatoblackringnepovirus，tbrv，屬于豇豆病毒花葉科comoviridae線蟲傳多面體病毒屬nepovirus，包括很多的株系：煙草黑環(huán)株系tobaccoblackringstrain；萵苣環(huán)斑株系lettuceringspotstrain；馬鈴薯花束株系potatobouquetstrain；馬鈴薯偽奧古巴株系potatopseudo-aucubastrain；甜菜環(huán)斑株系beetringspotstrain；芹菜黃脈株系celeryyellowveinstrain，這些株系不能通過寄主植物的癥狀來有效區(qū)分，但可以通過血清學(xué)和介體關(guān)系來區(qū)分。

tbrv主要發(fā)生在歐洲，現(xiàn)分布在全球30多個國家和地區(qū)。據(jù)報道tbrv的寄主范圍很廣，能夠廣泛侵染單子葉和雙子葉草本和木本植物，包括許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，如葡萄和其他果樹、甜菜、馬鈴薯和蔬菜以及觀賞植物，還能侵染喬木和灌木以及一些雜草品種，可造成這些植物的嚴(yán)重危害。據(jù)了解，番茄黑環(huán)病毒在美國、土耳其、加拿大、英國、德國、意大利、法國、荷蘭等國雖有分布，但因該病毒的危害性較大，這些國家在各自的進(jìn)境檢疫法規(guī)中都明確規(guī)定為檢疫性有害生物。

該病毒的傳播途徑很多，可以接觸傳毒、種子帶毒和線蟲傳毒。據(jù)文獻(xiàn)記載超過15個屬24種以上的植物可以tbrv種傳，許多植物的種傳率超過10％，甚至達(dá)到100％。如研究發(fā)現(xiàn)甜菜、黃豆、萵苣和番茄的種傳效率分別是3-7，83，3和20％。由于病毒在線蟲介體中僅保持?jǐn)?shù)周，tbrv的種傳在病害流行病學(xué)中占有重要地位?？梢娋€蟲介體只能短距離傳播，被害的植物種子和其它繁殖材料可以進(jìn)行遠(yuǎn)距離的傳播。因此植物種子和種球苗木是tbrv在國際間進(jìn)行傳播和擴(kuò)散的重要根源。

隨著我國加入wto，國際貿(mào)易越來越頻繁，尤其是上海作為我國十分重要的口岸城市，每年進(jìn)口大量的花卉、林木和蔬菜的種子和苗木，且進(jìn)口的數(shù)量和品種有逐年增多的趨勢。tbrv為我國進(jìn)境檢疫法規(guī)中明確規(guī)定的危險性有害生物，寄主范圍廣、傳播途徑多、適生性強(qiáng)，進(jìn)口植物種子苗木攜帶該病毒的風(fēng)險性很大，伴隨著我國進(jìn)出境貿(mào)易的高速增長，傳入我國并危害流行的可能性極大。因而，必須對此病毒引起高度重視，研究準(zhǔn)確可靠快速的檢測方法，以防止tbrv隨種苗的國際貿(mào)易傳入我國，引起農(nóng)作物、花卉和蔬菜生產(chǎn)的巨大損失。

目前，國內(nèi)針對tbrv的檢測方法研究較少，采用的檢測手段主要是血清學(xué)方法，因?yàn)閠brv具有多個血清型突變株和分離物，常規(guī)的血清學(xué)方法由于其靈敏度較低和特異性較差，僅靠此單一的方法大大限制了對該病毒的檢測，并可能出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象。國外學(xué)者采用免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄pcr的方法檢測到黃瓜上的tbrv，但尚未見到系統(tǒng)的分子生物學(xué)方法檢測tbrv的報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種快速、簡便、高效、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏性高，番茄黑環(huán)病毒檢測用的試劑盒；

本發(fā)明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測番茄黑環(huán)病毒的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：

一種番茄黑環(huán)病毒rt-lamp檢測用的試劑盒，其特征在于包括以下組分：

引物f3：

tgttgagataaccgatctga

引物b3：

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引物fip：

ctatatttcgctgcgggacc-aataactcaactttcttctagagtg

引物bip：

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如上所述的一種番茄黑環(huán)病毒rt-lamp檢測用的試劑盒，其特征在于所述引物fip和引物bip的濃度均為40pmol/μl。

如上所述的一種番茄黑環(huán)病毒rt-lamp檢測用的試劑盒，其特征在于所述引物f3和引物b3濃度均為10pmol/μl。

一種番茄黑環(huán)病毒rt-lamp鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：

a、植物組織總dna提??；

b、lamp檢測：

采用權(quán)利要求所述的試劑盒配置預(yù)反應(yīng)溶液，在預(yù)反應(yīng)溶液中分別加入待檢測的樣品的dna5μl，使總量達(dá)到25μl；其中對照組在預(yù)反應(yīng)溶液加入去離子水5μl；陽性對照在預(yù)反應(yīng)溶液中加入帶病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時離心，混合時避免產(chǎn)生氣泡；將混合物置于反應(yīng)孔中，于65℃恒溫反應(yīng)60min，最后80℃下保溫5min以結(jié)束反應(yīng)；

c、lamp結(jié)果判斷

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，使用紫外線照射裝置，波長240-260nm，350-370nm，從反應(yīng)試管底部向上進(jìn)行紫外線照射，佩戴眼鏡等防護(hù)用具后從反應(yīng)試管側(cè)面進(jìn)行觀察，若與陽性對照一樣發(fā)出綠色熒光，則判定為陽性即樣品中帶有番茄黃化曲葉病毒；若與陰性對照一樣未發(fā)出熒光，則判定樣品中沒有攜帶番茄黃化曲葉病毒。

如上所述的鑒定方法，其特征在于步驟a中植物組織總dna提取的具體步驟：

a.取0.1g植物組織置于液氮中研磨，時間盡量短，保持研缽中有液氮；

b.轉(zhuǎn)移樣品到1.5mlrnasefree離心管中，加入1ml的pl裂解液顛倒混勻，65℃條件下進(jìn)行孵育5min，使核蛋白體分解完全；

c.室溫條件下12000rpm離心10min后，取上清轉(zhuǎn)入新的rnasefree過濾柱中；

d.10000rpm離心45s，收集下濾液于收集管中，進(jìn)行下一步的操作；

e.收集管中加入1倍體積的70％乙醇，顛倒進(jìn)行混勻，得到的溶液以及沉淀一起轉(zhuǎn)移到吸附柱ra中，量太多可分次進(jìn)行過柱；

f.10000rpm下離心45s，棄掉廢液后，重新將吸附柱放回收集管中；

g.加入500μl去蛋白液re，12000rpm下離心45s，廢液棄掉；

h.加入700μl漂洗液rw，12000rpm下離心60s，廢液棄掉；

i.加入500μl漂洗液rw，12000rpm下離心60s，廢液棄掉；

j.將吸附柱ra重新放回收集管中，12000rpm離心2min，除去漂洗液，以免抑制下游反應(yīng)；

k.取出吸附柱ra，取一個新的rnasefree離心管中放入，根據(jù)所預(yù)期基因組和rna的產(chǎn)量在吸附膜中間部位加50-80μlrnasefreewater，室溫下放置2min后12000rpm離心1min。

綜上所述，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明tbrvrt-lamp檢測方法，在27min時即可檢測到tbrv的擴(kuò)增，配合植物基因組rna快速提取試劑盒，從核酸的提取到完成整個lamp結(jié)果的檢測只需1.5h左右，檢測結(jié)果直觀、簡便且準(zhǔn)確性高。在靈敏度檢測方面，本論文建立的tbrv的lamp方法比pcr方法至少高1000倍，表明lamp方法具有較高的靈敏度。在特異性方面，結(jié)果表明lamp方法能夠準(zhǔn)確的檢測到tbrv并產(chǎn)生擴(kuò)增，而其他同屬的病毒和健康樣品均未發(fā)生擴(kuò)增，具有良好的特異性。因此，本發(fā)明成功建立了tbrv的lamp特異檢測方法。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

實(shí)施例1

一種番茄黑環(huán)病毒rt-lamp檢測用的試劑盒，包括以下組分：

引物f3：

tgttgagataaccgatctga

引物b3：

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引物fip：

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引物bip：

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實(shí)施例2

一種番茄黑環(huán)病毒rt-lamp檢測用的試劑盒，包括以下組分：

引物f3：

tgttgagataaccgatctga

引物b3：

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引物fip：

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引物bip：

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所述引物fip和引物bip的濃度均為40pmol/μl。

所述引物f3和引物b3濃度均為10pmol/μl。

實(shí)施例3

一種番茄黑環(huán)病毒rt-lamp鑒定方法，包括以下步驟：

a、植物組織總dna提??；

a.取0.1g植物組織置于液氮中研磨，時間盡量短，保持研缽中有液氮；

b.轉(zhuǎn)移樣品到1.5mlrnasefree離心管中，加入1ml的pl裂解液顛倒混勻，65℃條件下進(jìn)行孵育5min，使核蛋白體分解完全；

c.室溫條件下12000rpm離心10min后，取上清轉(zhuǎn)入新的rnasefree過濾柱中；

d.10000rpm離心45s，收集下濾液于收集管中，進(jìn)行下一步的操作；

e.收集管中加入1倍體積的70％乙醇，顛倒進(jìn)行混勻，得到的溶液以及沉淀一起轉(zhuǎn)移到吸附柱ra中，量太多可分次進(jìn)行過柱；

f.10000rpm下離心45s，棄掉廢液后，重新將吸附柱放回收集管中；

g.加入500μl去蛋白液re，12000rpm下離心45s，廢液棄掉；

h.加入700μl漂洗液rw，12000rpm下離心60s，廢液棄掉；

i.加入500μl漂洗液rw，12000rpm下離心60s，廢液棄掉；

j.將吸附柱ra重新放回收集管中，12000rpm離心2min，除去漂洗液，以免抑制下游反應(yīng)；

k.取出吸附柱ra，取一個新的rnasefree離心管中放入，根據(jù)所預(yù)期基因組和rna的產(chǎn)量在吸附膜中間部位加50-80μlrnasefreewater，室溫下放置2min后12000rpm離心1min。

b、lamp檢測：

采用權(quán)利要求所述的試劑盒配置預(yù)反應(yīng)溶液，在預(yù)反應(yīng)溶液中分別加入待檢測的樣品的dna5μl，使總量達(dá)到25μl；其中對照組在預(yù)反應(yīng)溶液加入去離子水5μl；陽性對照在預(yù)反應(yīng)溶液中加入帶病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時離心，混合時避免產(chǎn)生氣泡；將混合物置于反應(yīng)孔中，于65℃恒溫反應(yīng)60min，最后80℃下保溫5min以結(jié)束反應(yīng)；

c、lamp結(jié)果判斷

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，使用紫外線照射裝置，波長240-260nm，350-370nm，從反應(yīng)試管底部向上進(jìn)行紫外線照射，佩戴眼鏡等防護(hù)用具后從反應(yīng)試管側(cè)面進(jìn)行觀察，若與陽性對照一樣發(fā)出綠色熒光，則判定為陽性即樣品中帶有番茄黃化曲葉病毒；若與陰性對照一樣未發(fā)出熒光，則判定樣品中沒有攜帶番茄黃化曲葉病毒。

sequencelisting

<110>陳,定虎

<120>番茄黑環(huán)病毒rt-lamp檢測用的試劑盒及檢測方法

<130>番茄黑環(huán)病毒rt-lamp檢測用的試劑盒及檢測方法

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