本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種香菇多糖-鉻配合物的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

免疫力是人體自身的防御機(jī)制，是人體識(shí)別和消滅外來(lái)進(jìn)入的任何異物（病毒、細(xì)菌等）；處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞以及識(shí)別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的能力?，F(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為，免疫力是人體識(shí)別和排除“異己”的生理反應(yīng)。幾乎所有疾病的產(chǎn)生都與自身免疫力下降有關(guān)，或由于疾病導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，所以提高自身免疫力是人體健康的基本保證。因而免疫調(diào)節(jié)或免疫增強(qiáng)劑對(duì)人類的健康起了舉足輕重的作用。

香菇多糖（lentinan簡(jiǎn)稱lnt）是從傘菌科香菇屬的天然香菇子實(shí)體中提取得到的一種β(1-3）葡聚糖。它是一類具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體免疫力等藥理活性的物質(zhì)，還有降血糖、抗氧化等多種功效。尤其是它具有顯著的、獨(dú)特的抗腫瘤活性，如對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病、胃癌、鼻煙癌、直腸癌和乳腺癌等有抑制作用和防止手術(shù)后轉(zhuǎn)移的效果，適用于病后機(jī)體康復(fù)，是目前已知較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)劑，并減輕放療和化療的毒副作用。此外，香菇多糖還是治療各種肝炎，特別是慢性遷移肝炎的良好藥物。目前，由金陵藥業(yè)股份有限公司福州梅峰制藥廠生產(chǎn)的香菇多糖注射液，用于慢性乙型遷延性肝炎及消化道腫瘤的放、化療輔助藥,在臨床有很高的療效。但是，雖然香菇多糖有卓越的生物學(xué)功能，迄今為止多糖作為藥物僅僅停留在輔助治療階段。研究還發(fā)現(xiàn)，多糖的藥理活性在體內(nèi)多通過(guò)糖脂、糖蛋白結(jié)合作用或以金屬螯合物的形式起作用。

許多微量元素如過(guò)渡金屬元素（如cu、cr）、非金屬元素如硒等，它們具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥理活性，如鉻是人體必需的一種微量元素，可以改善動(dòng)物的免疫功能,從而提高其抗病能力。但這些具有生物活性的微量元素其單質(zhì)或游離的金屬離子（如cu2+、cr3+）吸收率低，毒性較大，其生理活性都要通過(guò)合適配體形成配合物才能起作用。通常有機(jī)配體與金屬離子形成螯合物后不但其理化性能發(fā)生較大變化，生物活性也會(huì)發(fā)生巨大變化。它不但能更好發(fā)揮原有配體和金屬離子的功能，還可能產(chǎn)生協(xié)同效果。如很多功能性有機(jī)物-金屬配合物抗癌藥物、抗生素-金屬螯合物抗菌藥以及功能性有機(jī)物-微量金屬元素配合物保健食品的廣泛應(yīng)用已證明了這一點(diǎn)。鑒于此，如果在合適條件下將多糖與活性金屬離子螯合，形成穩(wěn)定的螯合物，不但其毒性降低、吸收率提高，其生理性能也必將發(fā)生很大的改善，將成為多功能物質(zhì)。

鑒于此，如果將香菇多糖與金屬離子螯合，其性能也必將發(fā)生很大的改善。由于多糖有豐富的羥基，是很好的配體，而cr有空3d軌道是很好的中心離子，只要條件合適必將形成穩(wěn)定的螯合物。本項(xiàng)目用香菇多糖與cr螯合形成香菇多糖-cr螯合物，研究其配位結(jié)構(gòu)和抗氧化、免疫調(diào)節(jié)活性的效果，實(shí)驗(yàn)表明，香菇多糖-鉻配合物的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)活性顯著高于無(wú)機(jī)鉻和香菇多糖，因而可用于制備抗氧化、免疫調(diào)節(jié)劑的藥物和保健食品中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種香菇多糖-鉻配合物的制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的香菇多糖-鉻配合物是將香菇粗多糖通過(guò)svage法進(jìn)行去蛋白提純，將提純后的香菇多糖在不同的溫度、不同的ph值、不同的反應(yīng)時(shí)間與cr³⁺配位反應(yīng)，探究最佳工藝。香菇多糖-鉻化合物經(jīng)紅外光譜法、紫外-可見光譜法檢測(cè)，香菇多糖與鉻配位形成絡(luò)合物；動(dòng)物活性實(shí)驗(yàn)表明，香菇多糖-鉻配合物具有顯著抗氧化和提高免疫力功能。因而可用于制備抗氧化、免疫調(diào)節(jié)劑的藥物和保健食品中。

本發(fā)明所述的香菇多糖-鉻配合物的制備方法及其應(yīng)用，包括如下步驟：

（1）香菇粗多糖采用svage法去蛋白方法獲得精制香菇多糖。

（2）純化后的香菇多糖與cr³⁺在弱堿性條件下合成香菇多糖-cr配合物；

（3）將香菇多糖-鉻配合物經(jīng)透析袋透析、濃縮冷凍干燥，得到純化后的香菇多糖-cr配合物，其中cr元素的含量為6.27wt%。

（4）利用紫外-可見光譜法、紅外光譜法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行配位分析，證明多糖與cr³⁺形成了配位化合物。

將香菇多糖-鉻配合物進(jìn)行了小鼠抗氧化活性的研究，結(jié)果顯示香菇多糖-鉻配合物具有比無(wú)機(jī)鉻和香菇多糖更高的抗氧化活性。

將香菇多糖-鉻配合物進(jìn)行了小鼠免疫調(diào)節(jié)活性的研究，結(jié)果顯示香菇多糖-鉻配合物比香菇多糖有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。

本發(fā)明的有益效果：1、香菇多糖-鉻配合物目前尚未有合成和抗氧化、提高免疫功能的活性研究報(bào)道，本發(fā)明可用于制備抗氧化、免疫調(diào)節(jié)劑的藥物和保健食品中。此新型化合物其最大優(yōu)點(diǎn)是香菇多糖為天然產(chǎn)物提取物，可藥食兩用；而鉻是正常碳水化合物和脂類代謝所必需的微量元素，三價(jià)鉻參與糖代謝，是維持動(dòng)物及人體正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素，同時(shí)又具有較強(qiáng)的提高免疫和抗應(yīng)激作用。二者形成螯合物后不但能更好發(fā)揮原有配體和金屬離子的功能，配體和金屬離子還會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高機(jī)體的抗氧化能力和免疫調(diào)節(jié)能力，且無(wú)毒副小，無(wú)不良反應(yīng)，可長(zhǎng)期使用；2、可用于制備抗氧化、免疫調(diào)節(jié)劑的藥物，也可用于制備保健食品；3、原料易得，配合物制備工藝簡(jiǎn)單，價(jià)廉，生產(chǎn)方便，開發(fā)價(jià)值高。

附圖說(shuō)明

圖1為香菇多糖紅外吸收?qǐng)D譜；

圖2為香菇多糖-鉻配合物紅外光譜圖；

圖3為crcl3?6h2o紫外-可見吸收光譜圖；

圖4為香菇多糖-鉻配合物紫外-可見吸收光譜圖；

圖5為小鼠脾臟指數(shù)對(duì)比圖；

圖6為小鼠血清中sod活力對(duì)比圖；

圖7為小鼠血清中l(wèi)dh活力對(duì)比圖；

圖8為小鼠血清中cat活力對(duì)比圖；

圖9為小鼠血清中l(wèi)zm含量對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1香菇多糖的純化

稱取10.0g粗香菇多糖于800ml蒸餾水中，80℃水浴加熱并滴入幾滴2mol?l^-1naoh溶液，控制溶液的ph=8.0左右。攪拌，加速粗多糖的溶解。然后按體積比（粗多糖液：氯仿：正丁醇=25：5:1）加入氯仿和正丁醇，快速攪拌約20min，靜置，分液除去下層有機(jī)試劑，然后離心除去中間蛋白質(zhì)固體。再按體積比（粗多糖液：氯仿：正丁醇=25：5:1）加入氯仿和正丁醇，重復(fù)以上操作，直至中間無(wú)白色固體產(chǎn)生。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮約至原體積的1/5，加入2-3倍體積量95wt%乙醇醇沉，離心，冷凍干燥得純化后的香菇多糖。純化后的香菇多糖為淡黃色的海綿狀物質(zhì)，較純化前易溶于水。

2香菇多糖-鉻配合物的制備

稱取1.6g純化并干燥的香菇多糖，于250ml80℃的蒸餾水中加熱溶解。在80℃水浴條件下慢慢滴加2mol?l^-1的crcl3?6h2o溶液（約600μl，相當(dāng)于0.32gcrcl3?6h2o）和2mol?l^-1的naoh溶液并不斷攪拌，控制溶液ph=9.0左右。直到溶液中出現(xiàn)絮狀沉淀，停止滴加crcl3?6h2o和naoh溶液，繼續(xù)保持80℃水浴加熱1h。3500r/min離心10min取上清液，加入2-3倍體積量的95wt%乙醇，冷卻靜置離心收集沉淀。分別用95wt%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚攪拌蕩洗沉淀物，離心收集沉淀并減壓干燥，得香菇多糖-鉻配合物粗品。

香菇多糖-鉻配合物粗品溶于適量蒸餾水中，裝入已預(yù)先處理的透析袋中并夾緊，在2l大燒杯加水，磁力攪拌透析2-3天，中間每隔一段時(shí)間換一次水，換水頻率先快后慢，透析結(jié)束后，濃縮，加入2-3倍體積量95wt%乙醇，離心收集沉淀，沉淀分別用95wt%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚洗滌，減壓干燥，得香菇多糖-鉻配合物精品，其中cr元素的含量為6.27wt%。

3香菇多糖-鉻配合物光譜分析

3.1紅外光譜分析

分別將徹底干燥后的香菇多糖及其cr配合物與kbr按質(zhì)量比1：（100-200）的比例混勻、研磨后壓片，用紅外光譜儀掃描，得兩者的紅外光譜。

由紅外圖譜圖1和圖2對(duì)比可知，香菇多糖鉻配合物在波長(zhǎng)3400cm^－1左右的羥基伸縮振動(dòng)(νo-h)的氫鍵締合峰強(qiáng)度與相應(yīng)多糖對(duì)比有所減弱，且吸收峰頻率向高波數(shù)方向移動(dòng)（從3407cm^-1到3446cm^-1）,推測(cè)這可能是由于三價(jià)鉻離子與羥基氧原子發(fā)生了配位反應(yīng)，導(dǎo)致羥基形成分子間和分子內(nèi)氫鍵能力減弱，配位使形成氫鍵的原化學(xué)鍵的鍵力常數(shù)升高，紅外吸收頻率移向高波數(shù)。由圖1和圖2還可以看出香菇多糖鉻配合物的紅外吸收峰與香菇多糖配位前相比，骨架的特征吸收峰沒(méi)有發(fā)生明顯變化，所以推測(cè)三價(jià)鉻離子與香菇多糖的羥基形成了配位鍵。

3.2紫外光譜分析

將香菇多糖-鉻絡(luò)合物與crcl3?6h2o均配制成0.01mol?l^-1的水溶液，使用紫外-可見光譜儀掃描波長(zhǎng)200-800nm處，用蒸餾水做參比，掃描速率為“快”，采樣間隔為1nm。得兩者的紫外光譜。

由圖3和圖4對(duì)比可知，香菇多糖-cr配合物中的三價(jià)鉻的最大吸收波長(zhǎng)相對(duì)于crcl3?6h2o中鉻有明顯的紅移現(xiàn)象（從410cm^－1—435cm^－1，從575cm^－1—590cm^－1）。我們知道，作為配體的香菇多糖本身沒(méi)有紫外吸收，可排除多糖的干擾，因此推測(cè)紅移是由于crcl3?6h2o溶液中的三價(jià)鉻離子的d軌道電子受到配位體的影響產(chǎn)生電子躍遷使吸收譜帶產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。

4香菇多糖-鉻配合物的生物活性

4.1動(dòng)物分組及處理

小鼠買來(lái)常規(guī)飼養(yǎng)三天后，設(shè)置生理鹽水組、香菇多糖組、無(wú)機(jī)鉻組、香菇多糖-cr配合物高、中、低劑量組，共六個(gè)組，每組10只小鼠。香菇多糖組給藥量為100mg/kg，無(wú)機(jī)鉻組給藥量10μg/kg,香菇多糖鉻高劑量組給藥量為200mg/kg,中劑量組給藥量為100mg/kg，低劑量組給藥量為50mg/kg。每天灌胃給藥1次，每次0.2ml，連續(xù)給藥12天再禁食12h。

4.2活性指標(biāo)測(cè)定

給藥后的小鼠全部稱重并記錄數(shù)據(jù)。摘除小鼠眼球取血，4000r/min離心10分鐘分離血清冷藏備用。取完血后將小鼠解剖，用鑷子夾出脾臟，稱其質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。將試劑盒各組分從盒中取出，平衡至室溫（18～25℃）。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（sod）活性；過(guò)氧化氫酶（cat）活性的測(cè)定原理為過(guò)氧化氫酶分解過(guò)氧化氫的反應(yīng)通過(guò)加入鉬酸銨迅速中止，剩余的過(guò)氧化氫與鉬酸銨產(chǎn)生淡黃色的絡(luò)合物，在405nm處測(cè)定其變化量，可計(jì)算出cat活力；乳酸脫氫酶（ldh）活性測(cè)定則通過(guò)采用丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，其在堿性條件下顯棕紅色，故可通過(guò)比色法求得；免疫比濁法測(cè)定補(bǔ)體c3、c4含量。比濁法測(cè)定溶菌酶（lzm）含量。操作嚴(yán)格按各試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.3.1免疫器官脾臟指數(shù)

由圖5可知，小鼠給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻，香菇多糖-cr配合物后脾臟指數(shù)均有所提高，而且給藥香菇多糖-cr配合物高劑量或中劑量后，脾臟指數(shù)明顯高于給藥生理鹽水的小鼠、較給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻的小鼠也有明顯提高。

4.3.2超氧化物歧化酶（sod）活力測(cè)定

圖6可知，小鼠給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻，香菇多糖-cr配合物后血清中sod活力均有所提高，而且給藥香菇多糖-cr配合物高劑量或中劑量后，小鼠血清中sod活力明顯高于給藥生理鹽水的小鼠、較給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻的小鼠也有明顯提高。

4.3.3乳酸脫氫酶（ldh）活力測(cè)定

圖7可知，小鼠給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻，香菇多糖-cr配合物后血清中l(wèi)dh活性均有所提高，而且給藥香菇多糖-cr配合物中劑量或低劑量后，小鼠血清中l(wèi)dh活性明顯高于給藥生理鹽水的小鼠、較給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻的小鼠也有明顯提高。

4.3.4過(guò)氧化氫酶(cat)活力測(cè)定

圖8可知，小鼠給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻，香菇多糖-cr配合物后血清中cat活力均有所提高，而且給藥香菇多糖-cr配合物高、中、低劑量的實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中cat活力均高于給藥香菇多糖和無(wú)機(jī)鉻小鼠血清中的cat活力。

4.3.5溶菌酶（lzm）含量測(cè)定

圖9可知，小鼠給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻，香菇多糖-cr配合物后血清中溶菌酶含量均有所提高，而且給藥香菇多糖-cr配合物高劑量或中劑量后，小鼠血清中溶菌酶含量明顯高于給藥生理鹽水的小鼠、較給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻的小鼠也有明顯提高。

4.3.6補(bǔ)體c3、c4含量測(cè)定

表1：香菇多糖-cr配合物對(duì)小鼠血清中補(bǔ)體c3、c4含量的影響

由表1可知，小鼠給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻，香菇多糖-cr配合物后血清中補(bǔ)體c3、c4含量均有所提高，而且給藥香菇多糖-cr配合物高、中、低劑量后，小鼠血清中補(bǔ)體c3、c4含量較給藥香菇多糖、無(wú)機(jī)鉻有所提高。

5結(jié)論

由香菇多糖-cr配合物的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論，給藥一定量的香菇多糖-cr配合物可提高小鼠的免疫力和抗氧化能力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。