本發(fā)明涉及一種瘤果黑種草籽中新的酯類化合物及其制備方法和用途，具體說是以瘤果黑種草籽為原料，制備分離得到一個具有抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)活性的酯類化合物，及其在糖尿病治療藥物及保健品開發(fā)中的用途。
背景技術(shù)：
：瘤果黑種草屬毛茛科黑種草屬金蓮花亞科植物，為多年生至一年生草本，少數(shù)為藤本或灌木，主要產(chǎn)于新疆，是新疆特有的植物資源，同時也是維吾爾醫(yī)藥常用藥材。具有刺激消化、驅(qū)風(fēng)止痛、補腎健腦、利尿、發(fā)汗和健胃以及平喘等作用，其作為藥用植物，現(xiàn)已被收錄于《中華人民共和國藥典》、《中國藥用植物志》、《維吾爾藥志》。黑種草屬(nigella)約有22種，藥用植物除瘤果黑種草(nigellaglanduliferafreyn)外，還包括果黑種草(nigellasativa)和黑種草(nigelladamascenal.)。目前，已經(jīng)從黑種草屬植物中分離得到的化合物種類有：皂苷類、生物堿類、黃酮類、苯丙素類、揮發(fā)油類、甾體類、酚類、多糖、飽和脂肪酸以及不飽和脂肪酸類。通過對黑種草屬植物化學(xué)成分的研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗高血壓、降血糖、改善血脂代謝、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性。信學(xué)雷等通過對瘤果黑種草籽提取物組分的研究發(fā)現(xiàn)，某些提取物組分具有促進apo-ai與sr-bi之間相互作用的功效，從而促進膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，達到降低血脂的作用；同時，以降糖活性為指導(dǎo)，分離純化組分中的成分，證實了瘤果黑種草籽中存在具有抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)、α-葡萄糖苷酶、蛋白非酶糖化活性的成分。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是，提供一種瘤果黑種草籽中的酯類化合物及其制備方法和用途，該方法以瘤果黑種草籽為原料，利用有機溶劑進行提取，丙酮超聲溶解提取物、反復(fù)的正相硅膠柱層析法、正相薄層板分析法和半制備型高效液相色譜分離得到瘤果黑種草籽中新的酯類化合物，活性實驗結(jié)果證明，該瘤果黑種草籽中的酯類化合物具有抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)酶活性的作用，可用于糖尿病治療藥物及保健品的開發(fā)。本發(fā)明所述的一種瘤果黑種草籽中的酯類化合物，該化合物的結(jié)構(gòu)為：其中，該化合物的名稱為：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯。所述瘤果黑種草籽中的酯類化合物的制備方法，按下列步驟進行：a、將瘤果黑種草籽粉碎，用石油醚冷浸脫脂5次，脫脂后的殘渣充分干燥，用體積濃度為50-100％的乙醇、甲醇或丙酮在室溫下進行冷浸或滲漉提取，或加熱回流提取，濃縮得總提物，再將濃縮物用丙酮超聲溶解5-10次，濾去不溶物，收集丙酮部位，濃縮得丙酮部位；b、將步驟a中得到的丙酮部位利用正相硅膠柱層析，以體積比為10:1，5:1，1:1的正己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進行依次梯度洗脫，再用體積比為5:1，1:1，1:4正己烷:丙酮為洗脫溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯10:1和5:1的洗脫流分合并，得到含化合物(ⅰ)的流分；c、將步驟b中得到的得到含化合物(ⅰ)的流分進行正相硅膠柱層析，以體積比為100:3，100:7，100:9，100:11，100:13，100:15，100:17，100:19，100:25的正己烷:乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯體積比為100:7的洗脫流分，再將收集的流分用半制備型高效液相色譜進行分離，濃縮得到瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)，名稱為：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯。所述的瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)作為抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1b的作用。所述的瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)在制備治療糖尿病藥物中的用途。所述的瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)在制備糖尿病保健品中的用途。本發(fā)明所述的瘤果黑種草籽中的酯類化合物及其制備方法和用途，通過所述方法獲得的瘤果黑種草籽中的酯類化合物，活性測定實驗結(jié)果表明：所述瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)酶活性的抑制作用呈現(xiàn)為劑量依賴型。實驗結(jié)果說明，該酯類化合物具有降糖活性。本發(fā)明所述的瘤果黑種草籽中的酯類化合物，結(jié)構(gòu)鑒定過程如下：化合物(ⅰ)名稱：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯，理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù)結(jié)果和結(jié)構(gòu)鑒定：淡黃色液體，[α]d20+3.0(c0.1,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)280(0.90)、223(1.72)和210(2.07)，hr-esi(-)ms：[m-h]-351.2904：分子式：c22h40o3；1h-nmr(cd3od，400mhz)，其1h和13cnmr數(shù)據(jù)歸屬見表1[400mhz(1h)，100mhz(13c)，溶劑：cd3od]。表1.化合物(ⅰ)的1h和13cnmr數(shù)據(jù)[δ(ppm),j(hz)]附圖說明圖1為本發(fā)明瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)的1h核磁共振譜圖；圖2為本發(fā)明瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)的13c核磁共振譜圖。具體實施方式實施例1a、將2kg瘤果黑種草籽粉碎，用石油醚冷浸脫脂5次，脫脂后的殘渣充分干燥，并分別用體積濃度為100％和50％乙醇，溫度80℃加熱回流提取，將提取液合并，濃縮，再將濃縮物用丙酮超聲溶解5次，濾去不溶物，收集丙酮部位，濃縮得丙酮部位5.0g；b、將步驟a中得到的丙酮部位利用正相硅膠柱層析，以體積比為10:1，5:1，1:1的正己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進行依次梯度洗脫，再用體積比為5:1，1:1，1:4正己烷:丙酮為洗脫溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯10:1和5:1的洗脫流分合并，得到含化合物(ⅰ)的流分；c、將步驟b中得到的得到含化合物(ⅰ)的流分進行正相硅膠柱層析，以體積比為100:3，100:7，100:9，100:11，100:13，100:15，100:17，100:19，100:25的正己烷:乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯體積比為100:7的洗脫流分，再將收集的流分用半制備型高效液相色譜進行分離，分離條件：體積比為75:25的乙腈-h2o，流速3.5ml/min，收集保留時間為30分鐘的流分，濃縮得到瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)，名稱為：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯。實施例2a、將2kg瘤果黑種草籽粉碎，用石油醚冷浸脫脂5次，脫脂后的殘渣充分干燥，并用體積濃度為90％和60％乙醇室溫下滲漉提取，將提取液合并，濃縮，再將濃縮物用丙酮超聲溶解7次，濾去不溶物，收集丙酮部位，濃縮得丙酮部位4.8g；b、將步驟a中得到的丙酮部位利用正相硅膠柱層析，以體積比為10:1，5:1，1:1的正己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進行依次梯度洗脫，再用體積比為5:1，1:1，1:4正己烷:丙酮為洗脫溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯10:1和5:1的洗脫流分合并，得到含化合物(ⅰ)的流分；c、將步驟b中得到的得到含化合物(ⅰ)的流分進行正相硅膠柱層析，以體積比為100:3，100:7，100:9，100:11，100:13，100:15，100:17，100:19，100:25的正己烷:乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯體積比為100:7的洗脫流分，再將收集的流分用半制備型高效液相色譜進行分離，分離條件：體積比為75:25的乙腈-h2o，流速3.5ml/min，收集保留時間為30分鐘的流分，濃縮得到瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)，名稱為：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯。實施例3a、將2kg瘤果黑種草籽粉碎，用石油醚冷浸脫脂5次，脫脂后的殘渣充分干燥，并用體積濃度為100％和60％甲醇冷浸提取，將提取液合并，濃縮，再將濃縮物用丙酮超聲溶解8次，濾去不溶物，收集丙酮部位，濃縮得丙酮部位5.1g；b、將步驟a中得到的丙酮部位利用正相硅膠柱層析，以體積比為10:1，5:1，1:1的正己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進行依次梯度洗脫，再用體積比為5:1，1:1，1:4正己烷:丙酮為洗脫溶劑進行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜法，收集正己烷:乙酸乙酯10:1和5:1的洗脫流分合并，得到含化合物(ⅰ)的流分；c、將步驟b中得到的得到含化合物(ⅰ)的流分進行正相硅膠柱層析，以體積比為100:3，100:7，100:9，100:11，100:13，100:15，100:17，100:19，100:25的正己烷:乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯體積比為100:7的洗脫流分，再將收集的流分用半制備型高效液相色譜進行分離，分離條件：體積比為75:25的乙腈-h2o，流速3.5ml/min，收集保留時間為30分鐘的流分，濃縮得到瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)，名稱為：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯。實施例4a、將2kg瘤果黑種草籽粉碎，用石油醚冷浸脫脂5次，脫脂后的殘渣充分干燥，并用體積濃度為90％和50％甲醇溫度80℃加熱回流提取，將提取液合并，濃縮，再將濃縮物用丙酮超聲溶解10次，濾去不溶物，收集丙酮部位，濃縮得丙酮部位5.15g；b、將步驟a中得到的丙酮部位利用正相硅膠柱層析，以體積比為10:1，5:1，1:1的正己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進行依次梯度洗脫，再用體積比為5:1，1:1，1:4正己烷:丙酮為洗脫溶劑進行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜法，收集正己烷:乙酸乙酯10:1和5:1的洗脫流分合并，得到含化合物(ⅰ)的流分；c、將步驟b中得到的得到含化合物(ⅰ)的流分進行正相硅膠柱層析，以體積比為100:3，100:7，100:9，100:11，100:13，100:15，100:17，100:19，100:25的正己烷:乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯體積比為100:7的洗脫流分，再將收集的流分用半制備型高效液相色譜進行分離，分離條件：體積比為75:25的乙腈-h2o，流速3.5ml/min，收集保留時間為30分鐘的流分，濃縮得到瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)，名稱為：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯。實施例5a、將2kg瘤果黑種草籽粉碎，用石油醚冷浸脫脂5次，脫脂后的殘渣充分干燥，并用體積濃度為70％和50％的丙酮溫度80℃加熱回流提取，將提取液合并，濃縮，再將濃縮物用丙酮超聲溶解10次，濾去不溶物，收集丙酮部位，濃縮得丙酮部位5.1g；b、將步驟a中得到的丙酮部位利用正相硅膠柱層析，以體積比為10:1，5:1，1:1的正己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進行依次梯度洗脫，再用體積比為5:1，1:1，1:4正己烷:丙酮為洗脫溶劑進行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜法，收集正己烷:乙酸乙酯10:1和5:1的洗脫流分合并，得到含化合物(ⅰ)的流分；c、將步驟b中得到的得到含化合物(ⅰ)的流分進行正相硅膠柱層析，以體積比為100:3，100:7，100:9，100:11，100:13，100:15，100:17，100:19，100:25的正己烷:乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯體積比為100:7的洗脫流分，再將收集的流分用半制備型高效液相色譜進行分離，分離條件：體積比為75:25的乙腈-h2o，流速3.5ml/min，收集保留時間為30分鐘的流分，濃縮得到瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)，名稱為：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯。實施例6a、將2kg瘤果黑種草籽粉碎，用石油醚冷浸脫脂5次；脫脂后的殘渣充分干燥，并用體積濃度為100％和60％丙酮室溫滲漉提取，將提取液合并，濃縮，再將濃縮物用丙酮超聲溶解10次，濾去不溶物，收集丙酮部位，濃縮得丙酮部位4.9g；b、將步驟a中得到的丙酮部位利用正相硅膠柱層析，以體積比為10:1，5:1，1:1的正己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進行依次梯度洗脫，再用體積比為5:1，1:1，1:4正己烷:丙酮為洗脫溶劑進行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜法，收集正己烷:乙酸乙酯10:1和5:1的洗脫流分合并，得到含化合物(ⅰ)的流分；c、將步驟b中得到的得到含化合物(ⅰ)的流分進行正相硅膠柱層析，以體積比為100:3，100:7，100:9，100:11，100:13，100:15，100:17，100:19，100:25的正己烷:乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，收集正己烷:乙酸乙酯體積比為100:7的洗脫流分，再將收集的流分用半制備型高效液相色譜進行分離，分離條件：體積比為75:25的乙腈-h2o，流速3.5ml/min，收集保留時間為30分鐘的流分，濃縮得到瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)，名稱為：丁基(10e，12e)-9-羥基-十八碳-10,12-二烯酸酯。實施例7瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)抑制酪氨酸磷酸酶1b酶活性的測試：1.篩選方法：對-硝基苯基磷酸二鈉(pnpp)作為底物，以陽性藥物3-(3,5-二溴-4-羥基-苯甲?；?-2-乙基-苯并呋喃-6-磺酸基-(4-(噻唑-2-磺酸胺基)-苯胺為對照，利用酶標(biāo)儀進行蛋白酪氨酸磷酸酶1b抑制劑的高通量篩選，根據(jù)蛋白酪氨酸磷酸酶1b水解產(chǎn)物的磷酸基團而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來測定蛋白酪氨酸磷酸酶1b的活性；1.1蛋白酪氨酸磷酸酶1b工作液濃度的確定：取0.5-1μl酶，用300μl磷酸緩沖液稀釋并充分混勻；取179μl稀釋好的酶液于96孔板，再加1μl二甲亞砜(溶劑空白)，震勻后放置5min；5min后，加入20μl底物-35mm對硝基苯磷酸二鈉鹽，充分震勻后室溫避光反應(yīng)30min；酶標(biāo)儀(spectramaxmd5，美國分子儀器公司)405nm處檢測od值，若od值為0.8±0.1，此時的酶溶液濃度作為工作液濃度，若od值在0.8±0.1范圍之外，則根據(jù)od微調(diào)酶的加入量；1.2篩選步驟：根據(jù)酶工作液濃度配制所需體積的酶工作液：取179μl蛋白酪氨酸磷酸酶1b酶工作液加入96孔板，再加1μl樣品(或者二甲亞砜做空白)，震勻后反應(yīng)5min，再過5min后，加入20μl對硝基苯磷酸二鈉鹽溶液，震勻后室溫避光反應(yīng)30min；酶標(biāo)儀405nm處檢測od值，蛋白酪氨酸磷酸酶1b抑制實驗設(shè)計如表2：表2蛋白酪氨酸磷酸酶1b抑制實驗設(shè)計陽性對照化合物為：3-(3,5-二溴-4-羥基-苯甲?；?-2-乙基-苯并呋喃-6-磺酸基-(4-(噻唑-2-磺酸胺基)-苯胺；抑制率(％)＝[1-(樣品組–樣品空白組)/(酶活組–酶活空白組)]×100％；表3瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b酶活性的實驗結(jié)果樣品半數(shù)抑制濃度(微摩爾)化合物(ⅰ)7.38±0.14蛋白酪氨酸磷酸酶1b抑制劑1.81±0.02由表3可知，瘤果黑種草籽中的酯類化合物(ⅰ)具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b酶活性的作用。當(dāng)前第1頁12