本發(fā)明涉及一種香草扁桃酸衍生物、其合成方法及一種香草扁桃酸免疫原、其制備方法及其應用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

香草扁桃酸(vanillymandelicacid，vma)，其結(jié)構(gòu)式如式ⅵ所示：

香草扁桃酸又稱為3-甲氧基-4-羥基苦杏仁酸(dl-3-methoxy-4-hydroxymandelicacid，mhma)或香草苦杏仁酸，是腎上腺髓質(zhì)激素兒茶酚胺(ca)類物質(zhì)的終末代謝產(chǎn)物，ca幾乎全部在體內(nèi)代謝，少部分的ca經(jīng)單胺氧化酶作用，生成對-二羥杏仁酸，大部分ca在ca-o-甲基轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲氧腎上腺素或去甲氧腎上腺素，最終代謝為3-甲氧基-4-羥基苦杏仁酸。體內(nèi)的ca代謝非常迅速，其代謝產(chǎn)物多由尿液排出。臨床上24h尿中vma的含量升高見于嗜鉻細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、原發(fā)性高血壓、心肌梗塞、慢性腎功能不全、甲狀腺機能亢進或減退、腎上腺皮質(zhì)功能不全、交感神經(jīng)生理功能異常等。因此，測定24h尿中vma的排出量對于上述疾病的臨床診斷具有重要意義。

經(jīng)典的vma檢測方法主要有：可見光分光光度法，此方法操作過程繁瑣，精確度差；氣象色譜法，此法對儀器要求比較高，操作復雜；高相液相-電化學法，此方法易受儀器質(zhì)量和工作環(huán)境的干擾，測定的靈敏度和專一性均需進一步提升；重氮法，此方法操作繁瑣、可靠性低，回收率、重復性、穩(wěn)定性還有待提高。以上測定方法都不能適應vma臨床檢驗的需要，目前市場上缺乏穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強的vma檢測試劑，尤其是質(zhì)量好的自動化檢驗試劑。因此，研發(fā)一種質(zhì)量達到臨床檢驗要求、實用性強、性價比高，可應用于全自動生化分析儀的vma檢測試劑勢在必行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種香草扁桃酸衍生物，該衍生物為新合成物質(zhì)，自然界中不存在。

實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達到：一種香草扁桃酸衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示：

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種香草扁桃酸衍生物的合成方法，該合成方法有別于常規(guī)合成方法，并具有良好的合成效果，大大提高香草扁桃酸衍生物的合成效率。

實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達到：一種如上所述的香草扁桃酸衍生物的合成方法，合成路線如下式所示：

反應過程包括以下：

合成化合物ⅳ步驟：將化合物ⅱ、化合物ⅲ溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，并加入k2co3進行反應后，經(jīng)萃取、干燥、濃縮、純化得到化合物ⅳ；

合成化合物ⅰ步驟：將化合物ⅳ與芐基三乙基氯化銨溶解于氯仿中，制成反應溶液；將naoh溶液滴加入反應溶液中，反應后調(diào)節(jié)溶液ph＝4，然后經(jīng)萃取、干燥、濃縮、純化，得到化合物ⅰ即香草扁桃酸衍生物。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種香草扁桃酸免疫原的制備方法。

實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達到：一種香草扁桃酸免疫原的制備方法，包括：

溶解載體蛋白步驟：將載體蛋白100-300g溶解于25-75ml0.2m、ph＝8.5的磷酸緩沖液中，得到載體蛋白溶液；

混合液制備步驟：將以下溶液混合并攪拌溶解反應30-60min，得到混合液；

100-300mg香草扁桃酸衍生物；

1.75-5.25ml二甲基甲酰胺；

1.75-5.25ml乙醇；

3.5-10.5ml10mm、ph＝5的磷酸鉀緩沖液；

100-300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺、

25-75mgn-羥基硫代琥珀酰亞胺；

免疫原制備步驟：將混合液滴加至載體蛋白溶液中，并在2-8℃下攪拌至少8h，得到抗原；將抗原經(jīng)過透析進行純化，得到香草扁桃酸免疫原。

本發(fā)明的第四個目的在于提供一種香草扁桃酸免疫原。

實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達到：一種如上所述的香草扁桃酸免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式ⅴ所示：

其中，-(ch2)3-co-為連接基團；r為載體，為具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多肽，為血清蛋白、血藍蛋白和甲狀腺球蛋白中的一種。

進一步地，r為牛血清蛋白。

本發(fā)明的第五個目的在于提供一種香草扁桃酸免疫原的應用，為將香草扁桃酸免疫原用于制備抗香草扁桃酸特異性抗體，和將抗香草扁桃酸特異性抗體用于制備香草扁桃酸檢測試劑，該檢測試劑可以實現(xiàn)在全自動生化分析儀上對香草扁桃酸高通量、快速化的檢測。

實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達到：一種如上所述的香草扁桃酸免疫原的應用，包括將香草扁桃酸免疫原用于制備抗香草扁桃酸特異性抗體，和將抗香草扁桃酸特異性抗體用于制備香草扁桃酸檢測試劑。

進一步地，抗香草扁桃酸特異性抗體為免疫實驗動物后產(chǎn)生的：完整抗體分子、具有與香草扁桃酸特異性結(jié)合能力的抗體片段和抗體衍生物中的一種；完整抗體分子、抗體片段和抗體衍生物，為采用單一的香草扁桃酸免疫原對動物加強免疫所得到的多克隆抗體，或者為免疫后經(jīng)體細胞雜交所得到的單克隆抗體；所述的實驗動物為兔、山羊、小鼠、綿羊、豚鼠或馬中的一種；

抗香草扁桃酸特異性抗體的制備方法為：

免疫步驟：用pbs將香草扁桃酸免疫原稀釋至0.1-3mg/ml，得到抗原溶液，然后用0.5-5ml抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對實驗動物進行第一次注射；2-3周后，用0.5-5ml抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑混合進行第二次注射；之后每隔4周用0.5-5ml抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑混合注射一次，免疫步驟中共注射三至六次；

分離抗體步驟：對經(jīng)免疫的實驗動物取血并分離純化，得到效價為1:30000-50000的抗香草扁桃酸特異性抗體。

進一步地，香草扁桃酸檢測試劑包括抗香草扁桃酸特異性抗體、香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物和酶的底物；香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯(lián)物；酶的底物為葡萄糖-6-磷酸。

進一步地，香草扁桃酸檢測試劑包括試劑a和試劑b：

試劑a為抗香草扁桃酸特異性抗體和酶的底物混合液，通過以下步驟制備得到：

將2.018-8.072g、5.625-22.50mm氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856-3.422g、5.625-22.50mm葡萄糖-6-磷酸用0.5-2l、55mm、ph＝8的tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將抗香草扁桃酸特異性抗體加到均相酶底物中，抗香草扁桃酸特異性抗體與均相酶底物的體積比為1:100-10000，得到試劑a；

試劑b為香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物溶液，通過以下步驟制備得到：

將香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物加到120mm、ph＝8.2的tris緩沖液中，香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物與tris緩沖液的體積比為1:100-10000。

進一步地，香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物通過以下方法制備得到：

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液的制備步驟：稱取7.5-22.5mg規(guī)格為100ku的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，溶解于6-18ml含72.6mg0.05mtris、8mg3.3mmmgcl2和100mgnacl的溶液中，調(diào)節(jié)ph＝9；然后加入112.5-337.5mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5-202.5mg葡萄糖-6-磷酸和0.375-1.125ml卡必醇；再逐滴加入1-3ml二甲基亞砜，得到葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液；

香草扁桃酸衍生物的激活步驟：在無水狀態(tài)下稱取5-15mg香草扁桃酸衍生物，溶解于300-900μl二甲基甲酰胺中；使溶液溫度降至-2～-8℃后加入1.5-4.5μl三丁胺、0.75-2.25μl氯甲酸異丁酯，在-2～-8℃條件下攪拌30-60min；

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與香草扁桃酸衍生物的連接步驟：將已激活的香草扁桃酸衍生物溶液逐滴加入到葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液中；2-8℃攪拌至少8h，得到連接產(chǎn)物；

純化產(chǎn)物步驟：通過g-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8℃下儲存。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的香草扁桃酸衍生物及合成方法均為針對性的新研究與設計，在現(xiàn)有技術(shù)中并不存在；

2、本發(fā)明以香草扁桃酸衍生物制得的香草扁桃酸免疫原和抗體其靈敏度、特異性都比直接用香草扁桃酸原物制備的免疫原和抗體高，制備出的抗香草扁桃酸特異性抗體特異性強、效價高，并且與常見的92種干擾物無任何交叉反應，因此能夠體現(xiàn)出較高的準確性、精密度、靈敏度和特異性；

3、本發(fā)明的免疫檢測試劑可以實現(xiàn)在全自動生化分析儀上對香草扁桃酸高通量、快速化的檢測，能同時測定多個樣品，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、結(jié)果準確等優(yōu)點，還能有效降低香草扁桃酸檢測成本，有利于臨床推廣使用。

附圖說明

圖1為實施例4elisa檢測的標準曲線；

圖2為實施例7香草扁桃酸免疫檢測方法的標準曲線；

圖3為實施例9香草扁桃酸臨床標本免疫檢測與高效液相色譜檢測對比數(shù)據(jù)的散點圖。

具體實施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述：

一、香草扁桃酸衍生物及其合成：

香草扁桃酸衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示：

合成該香草扁桃酸衍生物過程的合成路線為：

反應過程包括以下：

合成化合物ⅳ步驟：將化合物ⅱ、化合物ⅲ溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，并加入k2co3進行反應后，經(jīng)萃取、干燥、濃縮、純化得到化合物ⅳ；

合成化合物ⅰ步驟：將化合物ⅳ與芐基三乙基氯化銨溶解于氯仿中，制成反應溶液；將naoh溶液滴加入反應溶液中，反應后調(diào)節(jié)溶液ph＝4，然后經(jīng)萃取、干燥、濃縮、純化，得到化合物ⅰ即香草扁桃酸衍生物。

二、香草扁桃酸免疫原的制備方法：

溶解載體蛋白步驟：將載體蛋白100-300g溶解于25-75ml0.2m、ph＝8.5的磷酸緩沖液中，得到載體蛋白溶液；

混合液制備步驟：將以下溶液混合并攪拌溶解反應30-60min，得到混合液；

100-300mg香草扁桃酸衍生物；

1.75-5.25ml二甲基甲酰胺；

1.75-5.25ml乙醇；

3.5-10.5ml10mm、ph＝5的磷酸鉀緩沖液；

100-300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺、

25-75mgn-羥基硫代琥珀酰亞胺；

免疫原制備步驟：將混合液滴加至載體蛋白溶液中，并在2-8℃下攪拌至少8h，得到抗原；將抗原經(jīng)過透析進行純化，得到香草扁桃酸免疫原；

得到的香草扁桃酸免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式ⅴ所示：

其中，-(ch2)3-co-為連接基團；r為載體，為牛血清蛋白。

三、香草扁桃酸免疫原的應用：

1、制備抗香草扁桃酸特異性抗體：

抗香草扁桃酸特異性抗體為免疫實驗動物后產(chǎn)生的：完整抗體分子、具有與香草扁桃酸特異性結(jié)合能力的抗體片段和抗體衍生物中的一種；完整抗體分子、抗體片段和抗體衍生物，為采用單一的香草扁桃酸免疫原對動物加強免疫所得到的多克隆抗體，或者為免疫后經(jīng)體細胞雜交所得到的單克隆抗體；所述的實驗動物包括但不限于兔、山羊、小鼠、綿羊、豚鼠或馬中的一種，優(yōu)選為兔；

抗香草扁桃酸特異性抗體的制備方法為：

免疫步驟：用pbs將香草扁桃酸免疫原稀釋至0.1-3mg/ml，得到抗原溶液，然后用0.5-5ml抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對實驗動物進行第一次注射；2-3周后，用0.5-5ml抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑混合進行第二次注射；之后每隔4周用0.5-5ml抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑混合注射一次，免疫步驟中共注射三至六次；

分離抗體步驟：對經(jīng)免疫的實驗動物取血并分離純化，得到效價為1:30000-50000的抗香草扁桃酸特異性抗體。

2、制備香草扁桃酸檢測試劑：

香草扁桃酸檢測試劑包括抗香草扁桃酸特異性抗體、香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物和酶的底物；香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯(lián)物；酶的底物為葡萄糖-6-磷酸；

具體地，香草扁桃酸檢測試劑在使用之前，為了避免指示試劑中的酶標偶聯(lián)物和酶的底物發(fā)生反應，酶標偶聯(lián)物和酶的底物是不混合且分開放置，所以將酶的底物與上述抗香草扁桃酸特異性抗體混合在一起。因此，香草扁桃酸檢測試劑包括兩類試劑，試劑a和試劑b：

試劑a為抗香草扁桃酸特異性抗體和酶的底物混合液，通過以下步驟制備得到：

將2.018-8.072g、5.625-22.50mm氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856-3.422g、5.625-22.50mm葡萄糖-6-磷酸用0.5-2l、55mm、ph＝8的tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將抗香草扁桃酸特異性抗體加到均相酶底物中，抗香草扁桃酸特異性抗體與均相酶底物的體積比為1:100-10000，得到試劑a；

試劑b為香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物溶液，通過以下步驟制備得到：

將香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物加到120mm、ph＝8.2的tris緩沖液中，香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物與tris緩沖液的體積比為1:100-10000；

抗香草扁桃酸特異性抗體與均相酶底物的體積優(yōu)選為1:1250；

香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物與tris緩沖液的體積比優(yōu)選為1:2500。

其中，香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物通過以下步驟制備得到：

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液的制備步驟：稱取7.5-22.5mg規(guī)格為100ku的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，溶解于6-18ml含72.6mg0.05mtris、8mg3.3mmmgcl2和100mgnacl的溶液中，調(diào)節(jié)ph＝9；然后加入112.5-337.5mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5-202.5mg葡萄糖-6-磷酸和0.375-1.125ml卡必醇；再逐滴加入1-3ml二甲基亞砜，得到葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液；

香草扁桃酸衍生物的激活步驟：在無水狀態(tài)下稱取5-15mg香草扁桃酸衍生物，溶解于300-900μl二甲基甲酰胺中；使溶液溫度降至-2～-8℃后加入1.5-4.5μl三丁胺、0.75-2.25μl氯甲酸異丁酯，在-2～-8℃條件下攪拌30-60min；

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與香草扁桃酸衍生物的連接步驟：將已激活的香草扁桃酸衍生物溶液逐滴加入到葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液中；2-8℃攪拌至少8h，得到連接產(chǎn)物；

純化產(chǎn)物步驟：通過g-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8℃下儲存。

香草扁桃酸衍生物的結(jié)構(gòu)式同式ⅰ。

實施例1：

香草扁桃酸衍生物的合成及其分析鑒定

通過以下合成路線合成香草扁桃酸衍生物：

具體的合成步驟如下：

1)化合物ⅳ的合成：

稱取20g(131.6mmol)的化合物ⅱ、33.2g(170mmol)的化合物ⅲ，共同溶解于300mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，然后加入36.4g(263mmol)的k2co3，制成反應混合液；將反應混合液在室溫下攪拌12小時；反應結(jié)束后，在反應混合液中加入200ml純化水，然后用300ml二氯甲烷(dcm)進行萃取，萃取步驟重復3次；將萃取得到的結(jié)合的有機相通過na2so4進行干燥處理，再進行濃縮；將濃縮后得到的剩余物通過硅膠干燥柱(pe:ea＝5:1)進行純化，得到28g化合物ⅳ，產(chǎn)率80％。

檢驗：利用brukeravanceiiiplus400mhz和varianmercuryplus300m對上述化合物ⅳ進行核磁共振光譜掃描，采用tms作為內(nèi)標；結(jié)果如下：¹h-nmr(400mhz,cdci3):δ9.86(s,1h),7.46(m,2h),7.01(m,1h),4.19(m,4h),3.93(s,3h),2.58(m,2h),2.22(m,2h),1.26(m,3h)。表征為結(jié)構(gòu)式所示的化合物ⅳ。

2)化合物ⅰ的合成：

稱取3g(11.3mmol)的化合物ⅳ、0.15g(0.6mmol)芐基三乙基氯化銨，共同溶解于30ml氯仿(chcl3)中制成反應溶液；將濃度為15g/mlnaoh溶液在56℃條件下逐滴加入反應溶液中，并在56℃條件下攪拌2.5小時；反應結(jié)束后得到的剩余物用1n的hci調(diào)節(jié)至ph＝4，進行酸化處理，然后用30ml乙酸乙酯(ea)進行萃取，萃取步驟重復3次；將萃取得到的結(jié)合的有機相進行干燥與濃縮處理；將濃縮后得到的剩余物通過pre-hplc進行純化，得到0.4g白色固體狀的化合物ⅰ，即為香草扁桃酸衍生物(vma衍生物)，產(chǎn)率12.4％。

檢驗：利用brukeravanceiiiplus400mhz和varianmercuryplus300m對上述白色固體化合物進行核磁共振光譜掃描，采用tms作為內(nèi)標。結(jié)果如下：¹h-nmr(400mhz,cd3od):δ7.08(s,1h),6.93(m,2h),5.06(s,1h),4.04(m,2h),3.83(s,3h),2.50(m,2h),2.03(m,2h)。表征為結(jié)構(gòu)式所示的化合物ⅰ。

實施例2

香草扁桃酸免疫原的合成：

香草扁桃酸免疫原的結(jié)構(gòu)式如式ⅴ所示：

香草扁桃酸免疫原由載體與香草扁桃酸衍生物的-(ch2)3-co-基團連接而成；r為牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)。

該免疫原的制備方法具體步驟如下：

溶解載體蛋白步驟：將牛血清蛋白200g溶解于50ml0.2m、ph＝8.5的磷酸緩沖液中，得到載體蛋白溶液；

混合液制備步驟：將以下溶液混合并攪拌溶解反應30min，得到混合液；

200mg香草扁桃酸衍生物；

3.5ml二甲基甲酰胺；

3.5ml乙醇；

7ml10mm、ph＝5的磷酸鉀緩沖液；

200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺、

50mgn-羥基硫代琥珀酰亞胺；

免疫原制備步驟：將混合液滴加至bas溶液中，并在2-8℃下攪拌至少8h，得到抗原；將抗原經(jīng)過透析進行純化，得到香草扁桃酸免疫原。

實施例3

抗香草扁桃酸特異性抗體的制備：

抗香草扁桃酸特異性抗體的制備方法為：

免疫步驟：用pbs將香草扁桃酸免疫原稀釋至1mg/ml，得到抗原溶液，然后用1ml抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對實驗動物兔進行第一次注射；2-3周后，用1ml抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑混合進行第二次注射；之后每隔4周用0.5-5ml抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑混合注射一次，免疫步驟中共注射四次；

分離抗體步驟：對經(jīng)免疫的實驗動物兔取血并分離純化，得到效價為1:30000-50000的抗香草扁桃酸特異性抗體。

實施例4

香草扁桃酸的elisa檢驗：

1、香草扁桃酸的elisa檢測標準曲線的建立：

1)標準品的制備：

將香草扁桃酸粉末(購于sigma公司)溶解于甲醇溶液，制備成1mg/ml的儲存液。用elisa緩沖液將儲存液依次稀釋為16mg/l、8mg/l、4mg/l、2mg/l、1mg/l和0mg/l的標準溶液。其中，elisa緩沖液含有50mmtris，145mmnacl和體積百分比0.25％的bsa。

2)利用香草扁桃酸的elisa檢驗方法制備標準曲線：

用pbs將實施例3中所制備的抗香草扁桃酸抗體稀釋成1:10000的終濃度溶液，100μl/孔包被在96孔酶聯(lián)板上，4℃放置12-24h；用pbs將上述包被有抗香草扁桃酸抗體的96孔酶聯(lián)板洗滌3次后，加入200μl/孔的體積百分比0.5％的bsa溶液，4℃封閉放置8-16h。然后用pbs洗滌3次，加入20μl/孔的標準品。再加入100μl/孔工作濃度的hrp-香草扁桃酸偶聯(lián)物；室溫下孵育30min后pbs洗板5次；然后每孔加入100μltmb底物，室溫孵育30min。再每孔加入100μl終止液(2m硫酸)。測定450nm的吸光值。根據(jù)各標準品所對應的450nm的吸光值定標，制作標準曲線，結(jié)果如圖1所示。

2、待測樣品中香草扁桃酸含量的檢測：

1)制作待測樣品：

制備方法：將香草扁桃酸粉末(購于sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1mg/ml的儲存液，并將此儲存液稀釋于空白尿液中，至終濃度分別為0，2，8，16mg/l，分別形成空白、低、中、高濃度的尿液樣本?？瞻啄蛞簽椴缓悴荼馓宜岬慕】等四蛞?。

2)測試方法：

利用上述香草扁桃酸的elisa檢驗方法，將上述空白、低、中、高濃度的尿液樣本代替標準品，測試上述空白、低、中、高濃度的尿液樣本在450nm的吸光值。

3)測試結(jié)果：

對照圖1中所示的香草扁桃酸的elisa檢驗的標準曲線，計算每個樣本中香草扁桃酸含量，并對每個樣本進行3個復孔測定，根據(jù)上述樣本中香草扁桃酸的實際含量計算回收率，結(jié)果如表格1所示。

表格1香草扁桃酸的elisa檢測結(jié)果

由表格1中結(jié)果可知：采用本發(fā)明香草扁桃酸的elisa檢測試劑測定不同濃度樣品中的香草扁桃酸回收率都較高，均在99％-101％之間，說明本發(fā)明所述的抗香草扁桃酸特異性抗體可以用于樣本中香草扁桃酸的檢測，并且結(jié)果準確度高。

實施例5

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備方法為：

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pdh)溶液的制備步驟：

準確稱取15mg規(guī)格為100ku的g6pdh，室溫溶解于12ml含72.6mg0.05mtris、8mg3.3mmmgcl2和100mgnacl的溶液中，調(diào)節(jié)ph＝9，本步驟在燒杯中進行。

在燒杯中加入225mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)、135mg葡萄糖-6-磷酸(g-6-p)和0.75ml卡必醇(carbitol)。

在燒杯中再逐滴加入2ml二甲基亞砜(dimethysulfoxide，dmso)，得到葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液。

香草扁桃酸衍生物的激活步驟：

在無水狀態(tài)下稱取10mg實施例1合成的香草扁桃酸衍生物，溶解于600μl二甲基甲酰胺(dmf)中；使上述溶液溫度降到-2～-8℃后加入3μl三丁胺(tributylamine)、1.5μl氯甲酸異丁酯(isobutylchloroformate)，-2～-8℃攪拌30min。

g6pdh與香草扁桃酸衍生物的連接步驟：

將已激活的香草扁桃酸衍生物溶液逐滴加入到g6pdh溶液中，2-8℃攪拌過夜(至少8h)，得到連接產(chǎn)物。

純化產(chǎn)物步驟：

通過g-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8℃下儲存。

實施例6

香草扁桃酸檢測試劑的制備：

香草扁桃酸檢測試劑在使用之前，為了避免指示試劑中的酶標偶聯(lián)物和酶的底物發(fā)生反應，酶標偶聯(lián)物和酶的底物是不混合且分開放置，所以將酶的底物與上述抗香草扁桃酸特異性抗體混合在一起。因此，香草扁桃酸檢測試劑包括兩類試劑，試劑a和試劑b：

試劑a的制備：

將4.036g(11.25mm)氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad⁺)和1.711g(11.25mm)葡萄糖-6-磷酸(g-6-p)置于燒杯中，用1l、55mm、ph＝8的tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將實施例3中制備的抗香草扁桃酸特異性抗體加到均相酶底物中，抗體與均相酶底物的體積比為1:1250，得到試劑a。

試劑b的制備：

將實施例5制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到120mm、ph＝8.2的tris緩沖液中，香草扁桃酸酶標偶聯(lián)物與tris緩沖液的體積比為1:2500。

實施例7

香草扁桃酸免疫檢驗及結(jié)果

1、獲得標準曲線：

1)設置邁瑞bs-480全自動生化分析儀反應參數(shù)，如表格2所示。

表格2生化分析儀參數(shù)設置

2)操作步驟為：先加試劑a，再加入標準品，最后加入試劑b。加入試劑b后，測定不同時間點的od340吸光值，算出不同標準品濃度時的反應速率，實際操作過程中需不斷調(diào)整試劑a和試劑b的體積比例，同時調(diào)整測光點，最后得出較理想的反應標準曲線圖，如圖2所示。

2、樣本檢測：通過本發(fā)明的香草扁桃酸檢測試劑得到的標準曲線，重復測定低、中、高濃度質(zhì)控樣本10次，上述質(zhì)控樣本為：將香草扁桃酸標準品溶解于人尿液中，至濃度分別為2，8，16mg/l。檢測數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析見表格3。

表格3樣品的檢測結(jié)果

檢測結(jié)果：本發(fā)明的香草扁桃酸檢測試劑測定的準確度高，回收率均在99％-101％之間，精密度高，cv均低于4％。

實施例8

藥物與激素干擾試驗：

干擾物選取62種常見藥物與30種常見激素及激素代謝物進行干擾檢測，調(diào)整濃度至1mg/l，采用實施例7的香草扁桃酸免疫檢驗進行測定：

將待測干擾物與實施例6制備的試劑a接觸反應，再加入試劑b；

檢測上述混合溶液的od340吸光值，根據(jù)圖2得到相應物質(zhì)的濃度。

62種常見藥物與30種常見激素及激素代謝物名稱以及測定結(jié)果具體參見表格4。

表格4常見干擾物測定結(jié)果

測定結(jié)果顯示：上述62種常見藥物與30種常見激素及激素代謝物等價于香草扁桃酸的濃度均小于0.01mg/l。由此可見，本發(fā)明的抗體是抗香草扁桃酸的特異性抗體，與常見干擾物無交叉反應。

實施例9

對100例臨床標本分別使用高效液相色譜法和實施例6的香草扁桃酸檢測試劑進行測定，并作相關(guān)性分析，測定的數(shù)據(jù)參見表格5。

表格5臨床標本測定結(jié)果對比數(shù)據(jù)

對上述數(shù)據(jù)作圖，參見圖3，得到的線性方程為：y＝1.003x－0.0442，相關(guān)系數(shù)r²＝0.999，表明香草扁桃酸檢測試劑測定香草扁桃酸臨床標本的準確度高。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。