本發(fā)明涉及細胞工程技術領域，具體涉及一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法。

背景技術：

mll-af9融合基因在嬰兒與髓系和淋巴系侵襲性白血病都有相關性，而在成體，這種易位主要與急性髓系白血病相關。這些結果暗示在胚胎和成體組織白血病發(fā)展的細胞來源方面存在差異。我們猜測細胞來源的內在特性在決定白血病的譜系方面扮演了重要角色。

事實上，新生兒cd34⁺細胞表達mll-af9可永生化為髓系或淋巴系細胞，而成體骨髓cd34⁺細胞的永生化更難以實現(xiàn)，且具有強烈的髓系偏好性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供了一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法。

本發(fā)明技術方案的設計思路為：

為獲得具有永生化能力的小鼠血液髓系細胞，申請人在來源于成年骨髓的血液祖細胞/干細胞中表達mll-af9融合基因。這種策略產(chǎn)生了克隆化的并依賴于細胞因子的髓系細胞系。由于正常的髓系細胞本身并不表達mll-af9，在血液細胞中異位表達mll-af9可能會改變這些細胞，改變原代髓系細胞的某些生物學特性。為克服這一缺陷，申請人擬采用tet-on誘導型逆轉錄病毒載體，通過添加doxycycline來誘導mll-af9基因在成年骨髓的血液祖細胞/干細胞中表達，獲得髓系細胞系；而在這些永生化的髓系細胞用于生物學功能實驗前，撤銷doxycycline，終止mll-af9基因的表達。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為：一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，是采用tet-on誘導型逆轉錄病毒載體，通過添加doxycycline以誘導mll-af9融合基因在成年骨髓的血液祖細胞/干細胞中表達，獲得髓系細胞系。

進一步的，上述的一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，所述mll-af9融合基因的核苷酸序列如序列表中序列seqno.1所示。

進一步的，上述的一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，包括以下步驟：

1）用bamhi/xhoi雙酶切從ttrmpvir質粒上切下dsred基因片段，并將帶bamhi/xhoi黏性末端的mll-af9cdna連接入逆轉錄病毒載體ttrmpvir質粒，成功構建的質粒命名為vir-mll-af9；

dsred基因的表達受四環(huán)素調節(jié)元件tretight嚴格調控，載體組成型表達反式作用因子rtta3，在doxycycline的作用下發(fā)生構象變化，激活四環(huán)素調節(jié)元件tretight，啟動下游基因的表達；撤銷doxycycline，則下游基因的表達終止；

2）將vir-mll-af9質粒轉染逆轉錄病毒包裝細胞系gp+e-86，獲得條件性表達mll-af9融合基因的逆轉錄病毒；所述細胞系gp+e-86包含莫羅尼氏鼠白血病病毒mo-mulv的gag，pol和env區(qū)域；

3）將10-12周齡的c57bl/6小鼠在獲取骨髓3天前用5-氟尿嘧啶按150mg/kg處理，獲取骨髓后在imdm培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，0.15mm的mtg，100ng/ml的scf，10ng/ml的il-6和10ng/ml的il-3；

4）用含有4μg/mlpolybrene的逆轉錄病毒上清液轉導步驟3）所述骨髓細胞，室溫，轉速2000rpm離心90分鐘，將細胞轉移至培養(yǎng)箱孵育6小時后，棄去含polybrene的的逆轉錄病毒上清液，更換為步驟3）所述的添加有各種成分的imdm培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時，用流式細胞儀分析venus+的lineage-sca-1+c-kit+細胞，lineage包含cd3ε，b220，ter-119，cd11b，和gr-1；分選出的細胞培養(yǎng)于步驟3）所述的添加有各種成分的imdm培養(yǎng)基，并添加1μg/ml的doxycycline；最后存活的細胞即為永生化的小鼠髓系細胞。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，通過條件性表達mll-af9獲得的永生化的髓系細胞系（圖2右側）和成年小鼠骨髓中的原代髓系細胞（圖2左側）相比，具有相似的表面標志物，即cd11b⁺，但永生化的髓系細胞系極易擴增，獲得大量均一的細胞群體。

附圖說明

圖1顯示為逆轉錄病毒載體ttrmpvir質粒的圖譜。

圖2顯示為永生化的髓系細胞系在髓系細胞生長因子作用下的分化情況。

圖3顯示為永生化的髓系細胞系在giemsa染色后鏡下觀察細胞核的特點。

圖4顯示為永生化的髓系細胞系在添加髓系細胞生長因子的methylcellulose培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成克隆集落的能力。

具體實施方式

實施例1：

一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，是采用tet-on誘導型逆轉錄病毒載體，通過添加doxycycline以誘導mll-af9基因在成年骨髓的血液祖細胞/干細胞中表達，獲得髓系細胞系；mll-af9基因的核苷酸序列如序列表中序列seqno.1所示。

其具體操作過程為：

逆轉錄病毒載體ttrmpvir質粒的模式圖如圖1所示。dsred基因的表達受四環(huán)素調節(jié)元件tretight嚴格調控。該載體組成型表達反式作用因子rtta3，在doxycycline的作用下可發(fā)生構象變化，激活四環(huán)素調節(jié)元件tretight，啟動下游基因的表達；撤銷doxycycline，則下游基因的表達終止。用bamhi/xhoi雙酶切從ttrmpvir質粒上切下dsred基因片段，并將帶bamhi/xhoi黏性末端的mll-af9cdna連接入該逆轉錄病毒載體，成功構建的質粒命名為vir-mll-af9。將vir-mll-af9質粒轉染逆轉錄病毒包裝細胞系gp+e-86（該細胞系包含莫羅尼氏鼠白血病病毒mo-mulv的gag，pol和env區(qū)域），可獲得條件性表達mll-af9基因的逆轉錄病毒。

將10-12周齡的c57bl/6小鼠在獲取骨髓3天前用5-氟尿嘧啶（5-fu）按150mg/kg處理。獲取骨髓后在iscovesmodifieddulbeccomedium(imdm)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(fcs)，0.15mmmonothiolglycerol(mtg)，100ng/mlsteelfactor(sf)，10ng/mlinterleukin-6(il-6)和10ng/mlinterleukin-3(il-3)。用含有4μg/mlpolybrene的逆轉錄病毒上清液轉導上述骨髓細胞，室溫2000rpm離心90分鐘。將細胞轉移至培養(yǎng)箱孵育6小時后，棄去含polybrene的的逆轉錄病毒上清液，更換為上述添加各種成分的imdm培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時，用流式細胞儀分析venus⁺的lineage^-sca-1⁺c-kit⁺(lsk)細胞，lineage包含cd3ε(145-2c11),b220(ra3-6b2),ter-119,cd11b(m1/70),andgr-1(rb6-8c5)。分選出的細胞培養(yǎng)于上述添加各種成分的imdm培養(yǎng)基，并添加1μg/ml的doxycycline。最后存活的細胞即為永生化的小鼠髓系細胞。

將轉化mll-af9的骨髓細胞在髓系細胞生長因子cocktail中培養(yǎng)5天后，經(jīng)流式細胞術檢測，如圖2所示，永生化的髓系細胞系可表達髓系細胞表面標志物cd11b，還有部分細胞表達粒細胞表面標志物gr-1,部分細胞表達樹突狀細胞表面標志物cd11c，部分細胞表達巨噬細胞表面標志物f4/80，說明我們構建的髓系細胞系具備分化為髓系細胞各個亞群的能力。經(jīng)giemsa染色后鏡下觀察，我們構建的永生化的髓系細胞系具有環(huán)狀核或分葉核，與髓系細胞核的特點相符（見圖3）。永生化的髓系細胞系在在添加髓系細胞生長因子的methylcellulose培養(yǎng)基中培養(yǎng)，具有形成髓系細胞克隆集落的能力（見圖4）。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

<110>西北民族大學

<120>一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法

<210>1

<211>4527

<212>dna

<213>mll-af9融合基因的核苷酸序列

<400>1

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