本發(fā)明涉及一種對蝦過氧化物還原酶的基因序列，更具體涉及斑節(jié)對蝦過氧化物還原酶1編碼基因序列及其用途。

背景技術(shù)：

對蝦只能依靠先天免疫作為第一道防線來防止入侵病原微生物和環(huán)境毒性應(yīng)激；過氧化物還原酶可用于對蝦的先天免疫反應(yīng)。過氧化物還原酶是普遍存在的、分子量為20-30kda的、豐富的、多功能的和進(jìn)化上保守的抗氧化酶家族。過氧化物還原酶主要通過清除過氧化物以保護(hù)細(xì)胞免受活性氧引起的氧化損傷。此外，過氧化物還原酶在免疫反應(yīng)，分子伴侶，細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖，分化和凋亡，dna突變，腫瘤，癌癥，nk細(xì)胞活性增強(qiáng)等方面也起重要作用。

過氧化物還原酶1(prx1)屬于過氧化物還原酶家族中重要的一員，在各個(gè)門類中都發(fā)揮重要作用。斑節(jié)對蝦prx1的cdna是從斑節(jié)對蝦中分離出序列。斑節(jié)對蝦prx1cdna編碼198個(gè)氨基酸多肽,具有951個(gè)堿基對(bp)。斑節(jié)對蝦prx1蛋白有保守的過氧化物還原酶結(jié)構(gòu)域和過氧化物酶催化中心。從系統(tǒng)發(fā)育分析和序列圖中可以看出，斑節(jié)對蝦prx1在對蝦過氧化物還原酶家族中屬于典型的2-cys過氧化物還原酶成員，和過氧化物具有較強(qiáng)的親和性質(zhì)。對于轉(zhuǎn)錄水平，斑節(jié)對蝦prx1的mrna在各組織中被普遍檢測到，表明其在對蝦生理過程中起關(guān)鍵作用。科學(xué)研究還表明，斑節(jié)對蝦prx1在消除由病毒或細(xì)菌感染介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和炎癥過程中起著關(guān)鍵作用(wangetal.,2015)。

本研究提供了斑節(jié)對蝦prx1基因在對蝦中具有應(yīng)對各種毒物因子的有用信息，有助于進(jìn)一步探索斑節(jié)對蝦prx1的功能機(jī)制，可作為應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)的新型分子生物標(biāo)志物，或作為蝦類抗病或增強(qiáng)蝦類免疫力藥物使用，有助于了解多種生理活動(dòng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種斑節(jié)對蝦prx1的cdna。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種由上述斑節(jié)對蝦prx1的cdna編碼的氨基酸序列。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有上述斑節(jié)對蝦prx1的cdna的表達(dá)載體。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種制備斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白的方法。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種檢測由上述方法制備而成的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白的活性的方法。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種檢測由上述方法制備而成的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白對提高對蝦免疫力和成活率的效果的方法。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種斑節(jié)對蝦prx1的cdna，其特征在于：其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明上述斑節(jié)對蝦prx1的cdna，其具體通過如下方法獲得：根據(jù)已構(gòu)建的cdna文庫篩選斑節(jié)對蝦prx1的est序列，在對目的基因的est序列進(jìn)行驗(yàn)證后，設(shè)計(jì)pcr引物。利用cdna末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcdnaends,race)技術(shù)對目的基因的3ˊ和5ˊ末端進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得斑節(jié)對蝦prx1基因的全長序列。來自斑節(jié)對蝦的prx1的全長cdna序列為951bp，含有43bp的5'-非翻譯區(qū)(utr)，314bp的3'-utr，具有poly(a)尾巴。開放閱讀框(orf)為594bp，編碼198個(gè)氨基酸，分子量22kda，pi為5.3。在所有實(shí)驗(yàn)組織中，斑節(jié)對蝦prx1mrna中被普遍檢測到，表明在生理過程中起持續(xù)起作用。我們選擇鰓和肝胰腺作為目標(biāo)組織，用細(xì)菌刺激(哈維氏弧菌和無乳鏈球菌)及環(huán)境毒性應(yīng)激(重金屬，滲透壓和酸堿度應(yīng)激)處理后，結(jié)果顯示該基因在免疫器官中表達(dá)量明顯升高，并被外源刺激誘導(dǎo)表達(dá)，預(yù)示在斑節(jié)對蝦抗菌及抗應(yīng)激等生理過程中起重要作用。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種由上述斑節(jié)對蝦prx1的cdna編碼的氨基酸序列，其特征在于：如seqidno.2所示。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種含有上述斑節(jié)對蝦prx1的cdna的表達(dá)載體，其特征在于：所述的表達(dá)載體包含上述斑節(jié)對蝦prx1的orf序列。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種制備斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白的方法，其特征在于包括：使用上述斑節(jié)對蝦prx1的cdna的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體、純化獲得重組的斑節(jié)對蝦prx1蛋白，所述的寄主細(xì)胞為原核或真核細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述的寄主細(xì)胞為大腸桿菌bl21(de3)。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測由上述方法制備而成的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白的活性的方法，其特征在于：在體外對由上述方法制備而成的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白的抗氧化酶活性進(jìn)行測定，并利用瓊脂糖擴(kuò)散法檢測重組的對蝦prx1結(jié)合蛋白的抑菌效果。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測由上述方法制備而成的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白對提高對蝦免疫力和成活率的效果的方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1：將斑節(jié)對蝦分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，向所述的實(shí)驗(yàn)組中的斑節(jié)對蝦注射由上述方法制備而成的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白；所述的對照組不作任何處理；

步驟2：對實(shí)驗(yàn)組和對照組的斑節(jié)對蝦進(jìn)行細(xì)菌刺激和環(huán)境毒性應(yīng)激處理后，進(jìn)行死亡率統(tǒng)計(jì)；所述的細(xì)菌刺激中的細(xì)菌包括哈維氏弧菌和無乳鏈球菌；所述的環(huán)境毒性應(yīng)激包括重金屬，滲透壓和酸堿度應(yīng)激。

通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組的死亡率，可以確定由上述方法制備而成的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白在抗逆過程中的實(shí)際效果。

有益效果：

本發(fā)明從對蝦樣品中得到一個(gè)新的斑節(jié)對蝦prx1的cdna序列，通過基因工程技術(shù)對其功能研究，發(fā)現(xiàn)該序列在真核或原核細(xì)胞中可以高效表達(dá)；本發(fā)明還將上述斑節(jié)對蝦prx1的cdna序列克隆到原核或真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過陽性克隆子的誘導(dǎo)表達(dá)得到其重組蛋白，研究其性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦prx1基因在免疫組織中特異性高表達(dá)，并受外源毒性刺激后通過上調(diào)或者下調(diào)，其重組純化蛋白對細(xì)菌具有抑制生長作用，在斑節(jié)對蝦活體注射實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)其可以降低有害刺激所引發(fā)的死亡率升高現(xiàn)象，揭示其可以作為蝦類抗菌或增強(qiáng)蝦類免疫力藥物使用。

附圖說明

圖1顯示斑節(jié)對蝦prx1的blastp結(jié)果，含有thioredoxin(trx)-likesuperfamily家族中typical2-cysprxsubfamily結(jié)構(gòu)域；

圖2斑節(jié)對蝦prx1的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列；每行的數(shù)字表示核苷酸或氨基酸的位置；起始密碼子(atg)和終止子密碼子(taa)被框著；硫氧還蛋白超家族信號區(qū)標(biāo)注為灰色；氧化還原活性位點(diǎn)標(biāo)為成綠色；兩個(gè)活性半胱氨酸標(biāo)為紅色(被三角形圈起)，聚腺苷酸化信號序列(aataaa)是粗體，poly(a)信號序列是斜體；

圖3是通過實(shí)時(shí)定量pcr檢測不同組織中斑節(jié)對蝦prx1的相對表達(dá)水平，ef-1α被選為內(nèi)參基因；

圖4a經(jīng)細(xì)菌刺激(哈維氏弧菌和無乳鏈球菌)后，斑節(jié)對蝦prx1在鰓中表達(dá)分布特征，ef-1α被選為內(nèi)參基因，*代表p<0.05,**代表p<0.01；

圖4b經(jīng)細(xì)菌刺激(哈維氏弧菌和無乳鏈球菌)后，斑節(jié)對蝦prx1在肝胰腺中表達(dá)分布特征，ef-1α被選為內(nèi)參基因，*代表p<0.05,**代表p<0.01；

圖5a經(jīng)銅、鋅、鉻刺激后，斑節(jié)對蝦prx1在鰓中表達(dá)分布特征，ef-1α被選為內(nèi)參基因，*代表p<0.05,**代表p<0.01；

圖5b經(jīng)銅、鋅、鉻刺激后，斑節(jié)對蝦prx1在肝胰腺中表達(dá)分布特征，ef-1α被選為內(nèi)參基因，*代表p<0.05,**代表p<0.01；

圖6a經(jīng)高、低鹽刺激后，斑節(jié)對蝦prx1在鰓中表達(dá)分布特征，ef-1α被選為內(nèi)參基因，*代表p<0.05,**代表p<0.01；

圖6b經(jīng)高、低鹽刺激后，斑節(jié)對蝦prx1在肝胰腺中表達(dá)分布特征，ef-1α被選為內(nèi)參基因，*代表p<0.05,**代表p<0.01；

圖7a經(jīng)不同ph(ph＝7，ph＝9)刺激后，斑節(jié)對蝦prx1在鰓中表達(dá)分布特征，ef-1α被選為內(nèi)參基因，*代表p<0.05,**代表p<0.01；

圖7b經(jīng)不同ph(ph＝7，ph＝9)刺激后，斑節(jié)對蝦prx1在肝胰腺中表達(dá)分布特征，ef-1α被選為內(nèi)參基因，*代表p<0.05,**代表p<0.01；

圖8斑節(jié)對蝦prx1基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)蛋白，其中：m：蛋白marker；1.prset空載體的e.colibl21菌株，iptg誘導(dǎo)表達(dá)；2-4.prset-pmprx1的e.colibl21重組菌株，iptg誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間分別為：0小時(shí)，2小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)；圖a是其sds-page結(jié)果，圖b為其westernblot結(jié)果；

圖9ni-nta樹脂親和純化的斑節(jié)對蝦prx1原核表達(dá)蛋白，其中m：蛋白marker；1-2.ni-nta樹脂親和純化的prset-pmprx1，分別為第一收集管，第二收集管；

圖10重組斑節(jié)對蝦prx1的抗氧化活性檢測實(shí)驗(yàn)，通過催化過氧化氫反應(yīng)的方法測定；

圖11斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白的體外對細(xì)菌的抗菌效果檢測。

圖12示出了斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白注射組死亡率明顯低于pbs注射組。

具體實(shí)施方式

下面通過以下具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但是本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。

1.總rna的提取和全長cdna文庫構(gòu)建

1.1總rna的提取

鮮活健康斑節(jié)對蝦(體重約30g)在我們南海水產(chǎn)研究所的深圳實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)暫養(yǎng)7d后(水溫約25±1℃，氣泵充氣，鹽度：3.3％)，解剖蝦體取出各組織約100mg，放入1mlrnalater(ambion,ca,usa)中，根據(jù)試劑說明，使用trizol試劑(invitrogen，shanghai，china)從解剖組織(約50mg)中純化總rna。通過260/280nm處的uv吸光度比(nanodrop-2000，thermofisher，usa)檢測rna的質(zhì)量，并得到其濃度，同時(shí)通過1.2％瓊脂糖凝膠電泳測量質(zhì)量。

1.2總rna的提取，全長cdna模板的制備

根據(jù)primescripttmreversetranscriptase試劑盒(takara，dalian，china)的說明書，用1μg總rna合成第一條cdna，在42℃,反應(yīng)2分鐘。取以上反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，37℃，40分鐘，85℃，5秒，取出將母液于-80℃保存?zhèn)溆?，普通pcr工作液濃度70ng/μl備用，定量pcr工作液濃度30ng/μl備用，放-20℃進(jìn)行使用。

2.斑節(jié)對蝦prx1基因cdna全序列的克隆

2.1est序列驗(yàn)證

從之前構(gòu)建的cdna文庫中篩選斑節(jié)對蝦prx1的est序列。使用pmprx1-f5'-atgagcaacactgttccagc-3’和pmprx1-r5'-caatagctggaacagtgttgc-3’引物驗(yàn)證est序列。

以上述合成的cdna作為模板，用進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：超純水17μl，cdna模版1μl，10mmol/ldntp2μl，10nmol/l引物f和r各1μl，extaq酶0.5μl，10xextaqbuffer2.5μl,共25μl。反應(yīng)條件為：94℃變性3min；33個(gè)循環(huán)：94℃高溫變性30s,56℃低溫退火30s,72℃延伸1:30min；72℃延伸10min；4℃保溫。所擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。然后將純化的pcr產(chǎn)物克隆到puc-19t載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh-5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆單菌株，220rpm,搖6h，提質(zhì)粒，并用m13通用引物進(jìn)行測序。

2.2斑節(jié)對蝦prx1全長cdna的獲得

根據(jù)已驗(yàn)證的est序列片段設(shè)計(jì)特異性引物。利用cdna末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcdnaends,race)技術(shù)對目的基因的3’末端進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

依據(jù)序列合成3’-race引物：一擴(kuò)引物5’-gcagaatctccgtcaggtaacaat-3’和2擴(kuò)引物5’-agtatgccctgctggctggaaacc-3’，采用上述合成的全長cdna為模板，采用touchdownpcr和nestpcr的方法，按照race5'/3'試劑盒(takara,japan)進(jìn)行3’racepcr擴(kuò)增。第一次反應(yīng)體積為25μl，反應(yīng)條件為個(gè)94℃變性3min；9個(gè)循環(huán)：94℃變性30s,72℃【-1℃】退火30s,72℃延伸1:30min,每循環(huán)一次降1℃；24個(gè)循環(huán)：94℃變性30s,62℃退火30s,72℃延伸1：30min；72℃延伸10min；4℃保溫。2擴(kuò)體系保持不變，反應(yīng)條件為94℃變性3min；33個(gè)循環(huán)：94℃變性30s,68-62℃(梯度反應(yīng))退火30s,72℃延伸1：30min；72℃延伸10min；4℃保溫。pcr產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離，亞克隆puc-19t載體，t7、sp6進(jìn)行測序反應(yīng)獲得3’race片段314bp的核酸序列，拼接后獲得全長cdna為951bp(圖2)。

2.3斑節(jié)對蝦prx1的生物信息學(xué)分析

表1-斑節(jié)對蝦prx1的blast分析結(jié)果

用blast(http://www.ncbi.nim.nih.gov/)進(jìn)行同源性分析，結(jié)果上表1所示，該基因與印度明對蝦、日本囊對蝦、凡納濱對蝦等的prx1蛋白有高度同源性，揭示該基因是prx1基因。利用dnastar等工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析，揭示起始密碼atg位于44-46核苷酸，終止密碼子位于637-639核苷酸，開放讀碼框?yàn)?94個(gè)核苷酸，推測編碼一個(gè)198個(gè)氨基酸的蛋白(圖2)。5’utr為43bp，3’utr為314bp，3’utr存在典型的加尾信號aataaa(圖2)。預(yù)測分子質(zhì)量22kda和理論pi值為5.3。利用expasy軟件和signalip軟件分析該蛋白顯示，斑節(jié)對蝦prx1蛋白序列屬于硫氧還蛋白超家族，具有從第六個(gè)氨基酸到第164個(gè)的trx折疊結(jié)構(gòu)域。它含有兩個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，一個(gè)氧化還原活性位點(diǎn)(tfvcpt)，兩個(gè)prx特征基序(fypldftfvcptei和gevcpa)和兩個(gè)活性半胱氨酸(cys51和cys172)(圖1)，但斑節(jié)對蝦prx1缺乏信號肽。

3.pcr檢測斑節(jié)對蝦prx1在斑節(jié)對蝦不同組織的分布

提取了雌雄斑節(jié)對蝦的不同組織(包括卵巢，心臟，肝胰臟，腸，腦，胸神經(jīng)，肌肉，鰓，胃，淋巴)的rna。總rna的提取方法見前所述。

pcr反應(yīng)使用定量引物qpmprx1-f(5’-taccctttggatttcacctttgtc-3’)和qpmprx1-r(5’-attgattgttacctgacggagatt-3’)擴(kuò)增斑節(jié)對蝦prx1基因，看家基因ef-1α(genbank:dq021452.1)(ef-f5’-atggttgtcaactttgcccc-3’，ef-r5’-ttgacctccttgatcacacc-3’)作為內(nèi)參，以上述合成的cdna作為模板。反應(yīng)總體系為12.5μl，含有6.25μl的2×sybrpre-mixextaq(takara，dalian，china)，1μlcdna模板，0.5μl30mmol/l的每個(gè)正向和反向引物，以及4.25μl去離子水。pcr反應(yīng)條件設(shè)定為94℃，30s，然后40個(gè)循環(huán)：94℃，5s，60℃，30s，72℃，30s。溶解曲線分析為65-95℃，以確保每個(gè)單一產(chǎn)物的擴(kuò)增。通過2^-δδct方法分析斑節(jié)對蝦prx1的相對表達(dá)水平。

4.pcr檢測斑節(jié)對蝦prx1的mrna在不同免疫刺激條件下的表達(dá)

現(xiàn)在,病原體和環(huán)境毒性刺激都嚴(yán)重威脅著全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這其中，包括哈維氏弧菌，無乳鏈球菌病害，以及重金屬，高低ph,高鹽低鹽脅迫。細(xì)菌免疫或環(huán)境脅迫通常會引起吞噬作用，誘導(dǎo)活性氧(ros)的產(chǎn)生。只能依賴先天免疫的甲殼動(dòng)物已發(fā)展出保護(hù)性抗氧化系統(tǒng)，其中的過氧化物酶(prx)是最后發(fā)現(xiàn)的，具有免疫功能的基因，prx誘導(dǎo)表達(dá)的基因往往被認(rèn)為參加了宿主抗菌的天然免疫過程。為確認(rèn)斑節(jié)對蝦prx1是否參與這一過程，進(jìn)行了相應(yīng)菌和環(huán)境毒性物質(zhì)刺激表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

健康斑節(jié)對蝦按照100μl1×10⁸cfu/ml密度的哈維氏弧菌，無乳鏈球菌，對照組注射100μlpbs緩沖液(nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo410mm，kh2po42mm，ph7.4)血液注射。注射后0,6,12,24,48,72和96h取鰓和肝胰腺，剪碎后置于rnalater中保存。此外，我們分別配置0.18mg/l銅，0.506mg/l鋅和7.73mg/l鎘，ph7.0±0.1,ph9.0±0.1，鹽度為2.3％，4.3％的海水，然后將健康的斑節(jié)對蝦放入其中進(jìn)行浸泡，并以正常海水中的對蝦為對照組，重金屬和酸堿度實(shí)驗(yàn)分別于0,6,12,24,48,和96h取鰓和肝胰腺，高鹽低鹽實(shí)驗(yàn)于0,4,8,16,和32h取鰓和肝胰腺，剪碎后置于rnalater中保存，并帶回實(shí)驗(yàn)室分析。

總rna抽提方法和cdna逆轉(zhuǎn)錄方法見前所述。根據(jù)斑節(jié)對蝦prx1基因的全cdna設(shè)計(jì)熒光定量pcr引物見前所述,同時(shí)選用ef-1α作為內(nèi)參基因。定量體系以及反應(yīng)程序都如前所述。結(jié)果見附圖4a-圖5b，斑節(jié)對蝦prx1在注射后有顯著的上調(diào)或者下調(diào)，表達(dá)量顯著異于對照組，說明斑節(jié)對蝦prx1受免疫刺激后參與此免疫過程，是免疫應(yīng)答表達(dá)蛋白。

5.斑節(jié)對蝦prx1融合蛋白的制備

通過pcr(rpmprx1-f5’-cgacgatgacgataaggatccatgagcaacactgttccagc-3’，rpmprx1-r5’-gttagcagccggatcaagcttcaatagctggaacagtgttgc-3’；)擴(kuò)增整個(gè)斑節(jié)對蝦prx1編碼區(qū)，并克隆到prset質(zhì)粒中。將重組質(zhì)粒prset-pmprx1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)菌株中。只有prset的轉(zhuǎn)化體也轉(zhuǎn)化到用作對照組的大腸桿菌bl21(de3)菌株中。將兩種大腸桿菌bl21細(xì)胞在含有100μg/ml氨芐青霉素的luria-bertani(lb)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至大腸桿菌bl21細(xì)胞溶液的od600達(dá)到0.4～0.6。當(dāng)將1mm異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)以終濃度為1mol/l加入lb培養(yǎng)基中時(shí)，在37℃，220rpm下誘導(dǎo)細(xì)胞8h。根據(jù)his-bindingpurificationkit說明書(novagen)，通過ni-nta親和層析純化重組斑節(jié)對蝦prx1蛋白。通過sds-page和westernblot對純化蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，于29kda左右處有明顯條帶，去除由載體添加的6×his標(biāo)簽融合蛋白，和我們所預(yù)測的斑節(jié)對蝦prx1蛋白為22kda結(jié)果一致。所得斑節(jié)對蝦prx1蛋白的濃度使用改良的bca蛋白測定試劑盒(sangonbiotech,shanghai,china)。我們將純化的重組斑節(jié)對蝦prx1蛋白儲存在-80℃下為進(jìn)一步使用。

6.斑節(jié)對蝦prx1基因編碼蛋白的抗氧化酶活性檢測和抗菌活性測定

我們利用過氧化物酶催化過氧化氫反應(yīng)的原理，通過測定420nm處吸光度的變化得出酶活性的大小。根據(jù)過氧化物測試盒說明書(南京建城生物工程研究所，南京，中國)，按要求加入指定試劑和蛋白，37℃下準(zhǔn)確反應(yīng)半小時(shí)后，加入顯色試劑，3500rpm，10min，將樣品冷卻至測量溫度，測試od420nm處的吸光度，根據(jù)說明書，計(jì)算pmprx1蛋白的酶活性大小。其一，我們選擇對蝦的生長低溫20℃和生長高溫37℃作為不同反應(yīng)條件，進(jìn)行了斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白酶活測定試驗(yàn)，顯示斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白是溫度依賴型蛋白，隨溫度升高，酶活性升高。其二，我們進(jìn)行了不同斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白劑量的測定，即每個(gè)體系中分別加入10μg，20μgpmprx1蛋白，在37℃溫度下進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，該蛋白為劑量依賴性蛋白(圖10)。

通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測重組prset-pmprx1蛋白體外抑菌活性。具體步驟為：取哈維氏弧菌和無乳鏈球菌菌種，涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)活化；然后分別挑取單菌落，將單菌落于lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)活化擴(kuò)大培養(yǎng)；取0.1ml置于lb瓊脂平板上，用滅菌的l形曲玻璃棒均勻涂布，略干后，分別將用相同濃度prset-pmprx1蛋白，prset蛋白，pbs浸泡的無菌濾紙片放哈維氏弧菌和無乳鏈球菌涂布平板上，每個(gè)無菌紙片的距離大于等于24mm,每種菌株各做三個(gè)平行，鋪好后，將平板正置溫箱內(nèi)37℃培養(yǎng)檢測重組蛋白對各種菌的抑菌效果。結(jié)果顯示重組斑節(jié)對蝦prx1蛋白對哈維氏弧菌具有強(qiáng)溶解活性和對無乳鏈球菌只有輕微溶解活性。純化的prset蛋白和pbs沒有抗菌性能(圖11)。重要結(jié)果表明，純化的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白的抗菌性能表現(xiàn)出對病原菌的抑制具有選擇性作用，該蛋白對哈維氏弧菌更敏感。

7.斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白在斑節(jié)對蝦活體中的抗菌功能研究

為了進(jìn)一步確定斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白在斑節(jié)對蝦活體中對于哈維氏弧菌及無乳鏈球菌的抗菌效果，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用斑節(jié)對蝦分成四組每組25尾.第一組及第二組作為對照組在注射50ul滅菌的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs，ph7.4)12小時(shí)后分別注射50ul哈氏弧菌懸液(0.5*10⁹cfu/ml)或50ul無乳鏈球菌懸液(0.5*10⁹cfu/ml)；第三組、第四組作為實(shí)驗(yàn)組在注射20ul的斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白(5μg/g)12小時(shí)后，分別注射50ul哈氏弧菌懸液(0.5*10⁹cfu/ml)或50ul無乳鏈球菌懸液(0.5*10⁹cfu/ml)。分別于12h，24h，48h，72h和96h后記錄死亡情況。結(jié)果顯示，斑節(jié)對蝦prx1重組蛋白注射組死亡率明顯低于pbs注射組(圖12)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所

<120>斑節(jié)對蝦過氧化物還原酶1編碼基因序列及其用途

<130>002

<160>2

<170>bissap1.3.6

<210>1

<211>951

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>斑節(jié)對蝦prx1的cdna的核苷酸序列

<400>1

ggcacgagggtcgttgagacaagagaataccaagaccaccaccatgagcaacactgttcc60

agctattggcaaacctgcccctgtcttcaagggcactgctgttgttgatgggcagttcaa120

ggagatctccctggaagattacaagggcaaatatgtcattttcttcttctaccctttgga180

tttcacctttgtctgccccactgaaattatcgccttctctgaccgtgttgaagaattcag240

gaaaattggatgcgaagtggttgcttgctctacagactcccacttctcccaccttgcttg300

gatcaacactccccgcaaggaaggtggtcttggtacgatgaagatccctcttctggctga360

caagtcaatggaagttgcaaaggcttacggagtccttaaggaggatgaaggcattgcttt420

cagaggcctctttgttattgatggcaagcagaatctccgtcaggtaacaatcaatgacct480

gccagttgggcgtgatgtagatgaaacgctgcgattagtacaagccttccagttcacaga540

tgagcatggtgaagtatgccctgctggctggaaacccggagccaagacaatgaaggccga600

tcctactggcagcaaagaatacttccagaatgaaaattaatataacatcatcatttcttg660

gatattttttttctccttttataaaatatttaggatctgtcttgttcaaaagagttggca720

ttcaggatatggcattaggttcattctggtaatgatctttccttttgtttaaaaccggtt780

tgaaagctcaagtaattacagtacacaacatagtttgaatcaaaataagttcaggttatt840

ttgaagaaaagctgcgttatatcacagtatcagtattctatgtttagaaggtgtatattt900

aatcaataaacttgccagtcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa951

<210>2

<211>198

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>一種由上述斑節(jié)對蝦prx1的cdna編碼的氨基酸序列

<400>2

metserasnthrvalproalaileglylysproalaprovalphelys

151015

glythralavalvalaspglyglnphelysgluileserleugluasp

202530

tyrlysglylystyrvalilephephephetyrproleuaspphethr

354045

phevalcysprothrgluileilealapheseraspargvalgluglu

505560

phearglysileglycysgluvalvalalacysserthraspserhis

65707580

pheserhisleualatrpileasnthrproarglysgluglyglyleu

859095

glythrmetlysileproleuleualaasplyssermetgluvalala

100105110

lysalatyrglyvalleulysgluaspgluglyilealaphearggly

115120125

leuphevalileaspglylysglnasnleuargglnvalthrileasn

130135140

aspleuprovalglyargaspvalaspgluthrleuargleuvalgln

145150155160

alapheglnphethraspgluhisglygluvalcysproalaglytrp

165170175

lysproglyalalysthrmetlysalaaspprothrglyserlysglu

180185190

tyrpheglnasngluasn*

195