一種網紅細胞生長因子及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物【技術領域】，具體涉及一種網紅細胞生長因子及其制備方法和應用。本發(fā)明從抗胰蛋白酶制劑（α1-antitrypsin，源自人血漿）的雜質中分離純化了該因子，并確定了該因子為抗胰蛋白酶分子的前綴（precusor）中的片斷，具有很強的促進小鼠網質紅細胞生成的功能。EPO的單抗不能與之結合。該因子用Ⅰ125標記，與小鼠骨髓細胞表面受體結合后，EPO不能與之競爭。用不同的熒光染料標記EPO和RGF，證明它們各自有不同的受體。該因子與EPO同時注入小鼠體內或再障小鼠體內，可產生明顯的促網紅細胞和紅細胞生成的協(xié)同作用。本發(fā)明所述網紅細胞生長因子可制備成治療嚴重貧血的藥物。
【專利說明】—種網紅細胞生長因子及其制備方法和應用
一、【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物【技術領域】，具體涉及一種網紅細胞生長因子及其制備方法和應用。
二、【背景技術】
[0002]目前臨床上用于治療嚴重貧血的最有效藥物當推紅細胞生成素Erythropoietin(rhu-EPO)。自1989年美國Amgen公司的重組人EPO獲得FDA批準上市后，已被普遍接受，現已發(fā)展為DNA重組藥物中最成功的例子。EPO是紅細胞生成中迄今發(fā)現的唯一的一個專一的增紅因子，雖有報導干細胞生長因子(SCF)，多種集落刺激因子(CSFs)也對紅細胞生成有促進作用，但它們的作用是多功能的，不是專一的。目前尚未發(fā)現新的治療嚴重貧血的藥物。
三、
【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明需要解決的問題是提供一種新的網紅細胞生長因子(ReticulocyteGrowth factor, RGF)及其制備方法和應用。
[0004]本發(fā)明在研究過程中，在腎細胞培養(yǎng)液中，人尿和血漿中均發(fā)現有促紅細胞生成活性的蛋白存在，但它們的分子量和免疫原性，甚至受體都和EPO不同。但該活性蛋白的含量很低，很難得到足夠的 純品進行性質研究，最后發(fā)現來源于人血漿的a 1-antitrypsin制劑的雜質中有很高的促網紅細胞生成的活性。本發(fā)明通過高壓液相層析(HPLC)等生化純化手段得到幾個高活性蛋白，經鑒定均為a !-antitrypsin的前綴(precusor)中的不同長度的肽段，帶有不同長度的糖，有的成分含糖很少或者無糖。
[0005]本發(fā)明的技術方案
[0006]1、RGF 的純化
[0007]a、Sigma公司的a j-antitrypsin制劑(A-9024)源自人血衆(zhòng),該制劑中存在很高的促網紅細胞生成的活性?；钚詸z查采用程雅琴教授的小鼠網紅細胞測定法，具體方法描述如下:
[0008]動物:ICR小鼠，體重18_22g，雄性
[0009]樣品:按RGF的活性稀釋，一般在5-20 μ g/ml
[0010]方法:3只小鼠為一組，肌肉注射0.06ml,0.12ml,0.24ml，連續(xù)注射3天，第4天眼眶取血，7-8滴加入已加有20μ 1100U/ml肝素鈉的帶蓋小管中混勻，取出50 μ I血液，滴加在預涂在玻片一端已干的煌焦油蘭染料上，充分混合，放入濕盒中30分鐘。在二片載玻片上推成單層細胞，自然干燥后，甲醇固定，然后經瑞氏染液復染，同時滴加0.02mol/L PBS(PH6.8)勿使干枯，30分鐘后用PBS或蒸餾水沖去染液。
[0011]高倍油鏡讀片，網紅細胞中核物質，可被煌焦油蘭染成深藍色點狀、線狀、鏈狀或團狀,而紅細胞不含核物質。一般計數500-1000個紅細胞，計算網紅細胞所占百分率。每個樣品讀二張片子取平均值，每組3只小鼠再取平均值，減去對照組(0.12μ I生理鹽水)網紅細胞百分率，為網紅細胞凈增％。每上升1%，定義為I個單位(U)，以注射的蛋白量(一次注射量)計算比活性，即每mg蛋白質刺激上升的單位(U/mg)作為比活性。
[0012]將a !-antitrypsin制劑用生理鹽水配成不同濃度，取ICR小鼠(體重18_22g，雄性)15只，3只一組分成5組，對照組肌肉注射0.12ml生理鹽水，其余分組小鼠注射0.12ml不同濃度的antitrypsin制劑,連續(xù)注射3天后,第4天眼眶取血、煌焦油蘭染色,油鏡計數網紅細胞在紅細胞中的百分比。結果證明該制劑中促網紅細胞生成的活性很強，可作為起始材料進一步分離純化。結果見下表:
[0013]表1 a ^antitrypsin制劑的促網紅細胞生成活性
[0014]
【權利要求】
1.一種網紅細胞生長因子，其特征是氨基酸序列為: a J-antitrypsin的precusor的418個氨基酸中的片段,屬同一家族 N端(帶1-1)
24
Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His
His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys49或 N端(帶1-2)
25
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys

49或 N端(帶1-3)
27
Pro Gln Gly Asp Ala Al a Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln
Asp His Pro Thr Phe Asn Lys
49或 N端(帶1-4)
30
Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro
Thr Phe Asn Lys
49 C端 412
Val Val Asn Pro Thr Gln Lys

418 凡與上述序列有70%相同的序列的糖蛋白及非糖蛋白均屬RGF家族。
2.根據權利要求1所述網紅細胞生長因子的制備方法，其特征是由以下步驟構成:(1)源自人血衆(zhòng)的a!-antitrypsin制劑以0.02mol/L的PBS，溶解為每ml2.5mg ； (2)通過HPLCC18f反相柱中性分離得3個蛋白峰群，經活性測定，第3峰群有抑制表皮細胞生長的活性； (3)取第3峰群再經HPLCC18f 二次分離，當拉長洗脫梯度得到10個蛋白收集部分，測活證明第8峰部分有較高活性； (4)將第8峰收集部進行制備性SDS-PAGE，切取有明顯蛋白的膠條帶搗碎，用水反復抽提，濃縮后檢測純度和活性，并進行測序。
3.權利要求1所述網紅細胞生長因子在制備治療貧血藥物中的應用。
4.權利要求3所述網紅細胞生長因子在制備治療貧血藥物中的應用，其特征是與紅細胞生成素聯合使用，有明顯的協(xié)同作用。
【文檔編號】A61P7/06GK103804484SQ201410036118
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權日:2014年1月24日
【發(fā)明者】金以豐, 吳奇, 張?zhí)? 馬曉艷, 宣佶 申請人:南京必優(yōu)康生物技術有限公司