本發(fā)明屬于蜜蜂幼蟲芽孢桿菌檢測技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法。
背景技術(shù):
美洲幼蟲腐臭病(americanfoulbrood,afb)是由幼蟲芽孢桿菌(paenibacilluslarvae,p.larvae)引起的蜜蜂幼蟲和蛹的一種細菌性、急性、毀滅性傳染病,其典型癥狀為封蓋后死亡的幼蟲巢房蓋變潮濕、下陷、顏色發(fā)暗并顯油光,大部分巢房蓋穿孔,挑取蟲體可拉出長10cm~15cm的膠體狀細絲,患病幼蟲蟲體變軟,失去正常白色和光澤,逐漸變成淡褐色至棕黑色。這種芽孢桿菌有7層結(jié)構(gòu)包圍,特殊的結(jié)構(gòu)使其極具生命力,在惡劣環(huán)境下仍可存活35年以上。afb一旦在蜂場發(fā)生,極易造成幼蟲死亡和蜂群群勢衰弱,且很難徹底清除,給養(yǎng)蜂業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(oie)將其列為法定報告動物疫病,我國將其列為二類動物疫病和進境動物檢疫疫病。目前,afb主要根據(jù)臨床癥狀進行診斷,易造成誤診,實驗室診斷主要是以病原形態(tài)學、病原分離培養(yǎng)、生理生化特征、pcr方法等,確診需要4d~6d,而且由于p.larvae的生長需要復雜的營養(yǎng),在普通培養(yǎng)基上不能萌發(fā)也不能形成芽孢。近年來,因熒光定量pcr技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點逐漸應用于各種病原體的定性和定量檢測。han等建立了p.larvae的微流體芯片定量pcr方法,該方法只需7.9min完成30個循環(huán),即可檢測出16srrna基因,并可以進行熔解曲線分析,此方法是目前世界上最快的實時熒光定量分析方法。martinez等針對p.larvae16srrna基因設(shè)計引物,建立了sybrgreen熒光定量pcr檢測方法,該方法用時2h,最低可檢出3.75個細菌/ml和10個芽孢/ml。已報道的上述兩種熒光定量pcr方法中,微流體芯片定量pcr專用儀器設(shè)備、試劑、耗材昂貴,檢測成本較高,目前還不利于普及和推廣應用;sybrgreen熒光定量pcr雖檢測成本低,但pcr反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光,通常本底較高,引起假陽性,特異性較差。
綜上所述,現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是:
1.微流體芯片定量pcr檢測速度快,但檢測成本高,目前還不利于普及和推廣應用;
2.sybrgreen熒光定量pcr檢測成本低,但檢測結(jié)果假陽性率高,特異性較差。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,本發(fā)明提供了一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的,一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法,所述蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法根據(jù)p.larvae16srrna基因序列,設(shè)計了一對特異性引物和一條taqman熒光探針,建立了蜜蜂美洲幼蟲腐臭病病原菌taqman熒光定量pcr檢測方法。具體的檢測流程:
1.dna抽提:采用ctab法或煮沸法或其它常規(guī)dna抽提方法提取樣品、陽性對照、陰性對照中的dna;
2.對照設(shè)置:幼蟲芽孢桿菌或含有目的dna片段的陽性質(zhì)粒作為陽性對照、健康蜜蜂幼蟲dna作為陰性對照,同時設(shè)立無模板空白對照;
3.pcr反應體系配置:在pcr管中加入10×pcrbuffer2.5μl,mgcl2(25mmol)1.5μl,dntps(2.5mmol)2μl,上下游引物(10μmol)各1μl,特異性探針(10μmol)0.5μl,taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl,模板dna1μl,加滅菌ddh2o15.0μl,使反應總體積為25.0μl;
4.pcr反應程序:94℃預變性2min;94℃變性15s、56℃退火延伸45s,共45個循環(huán),在56℃時收集熒光信號;
5.結(jié)果判定:陰性對照和空白對照無ct值并且無擴增曲線,陽性對照的ct值應≤33,并且出現(xiàn)典型的擴增曲線,說明試驗為有效試驗,否則試驗無效;在試驗有效的情況下,待測樣品無ct值,并且無擴增曲線,表示樣品中無幼蟲芽孢桿菌;待測樣品ct值≤33,并且出現(xiàn)典型的擴增曲線,表示樣品中存在幼蟲芽孢桿菌;待測樣品ct值>33的樣品重復檢測,重復檢測結(jié)果無ct值表示樣品中無幼蟲芽孢桿菌,重復檢測結(jié)果有ct值表示樣品中存在幼蟲芽孢桿菌。
進一步,所述特異性引物的序列為:seqidno:1和seqidno:2。
進一步,所述探針的序列為:seqidno:3。
本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為:為建立蜜蜂幼蟲芽孢桿菌(p.larvae)熒光定量pcr檢測方法,根據(jù)genbank中幼蟲芽孢桿菌(p.larvae)16srrna基因保守序列設(shè)計特異性引物和探針,經(jīng)反應體系及條件優(yōu)化,建立了檢測p.larvaetaqman熒光定量pcr方法。本發(fā)明與其它病原無交叉反應;最低可檢出1.3×10拷貝/μl的陽性質(zhì)粒,比普通pcr靈敏度高100倍;重復試驗顯示該方法的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于3%。應用本發(fā)明對50份實驗室模擬樣品和100份臨床樣品進行了檢測,與預期結(jié)果一致。
本發(fā)明建立的方法可用于美洲幼蟲腐臭病(afb)的早期快速檢測及p.larvae定量分析;本發(fā)明建立的taqman熒光定量pcr方法,為afb的早期診斷、防控及在分子流行病學研究等方面提供一種新的技術(shù)手段。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實施例提供的陽性模板的擴增示意圖;
圖中:m:dl2000dnamarker;1:pcrproduct;2:negativecontrol。
圖2是本發(fā)明實施例提供的熒光定量pcr標準曲線示意圖;
圖中:1-7:pxt-16srecombinantplasmiddilutedfrom1.3×107copies/μl-1.3×101copies/μl。
圖3是本發(fā)明實施例提供的熒光定量pcr特異性試驗擴增曲線示意圖;
圖中:1:p.larvae;2:negative;3:m.pluton;4:n.apis;5:a.apis;6:blankcontrast。
圖4是本發(fā)明實施例提供的熒光定量pcr(a)與普通pcr(b)敏感性試驗示意圖;
圖中:1-8:1.3×107copiesto1.3×100copies;9:negativecontrol。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白,以下結(jié)合實施例,對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解,此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。
本發(fā)明實施例提供的蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法包括以下步驟:
1.dna抽提:采用ctab法或煮沸法或其它常規(guī)dna抽提方法提取樣品、陽性對照、陰性對照中的dna;
2.對照設(shè)置:幼蟲芽孢桿菌或含有目的dna片段的陽性質(zhì)粒作為陽性對照、健康蜜蜂幼蟲dna作為陰性對照,同時設(shè)立無模板空白對照;
3.pcr反應體系配置:在pcr管中加入10×pcrbuffer2.5μl,mgcl2(25mmol)1.5μl,dntps(2.5mmol)2μl,上下游引物(10μmol)各1μl,特異性探針(10μmol)0.5μl,taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl,模板dna1μl,加滅菌ddh2o15.0μl,使反應總體積為25.0μl;
4.pcr反應程序:94℃預變性2min;94℃變性15s、56℃退火延伸45s,共45個循環(huán),在56℃時收集熒光信號;
5.結(jié)果判定:陰性對照和空白對照無ct值并且無擴增曲線,陽性對照的ct值應≤33,并且出現(xiàn)典型的擴增曲線,說明試驗為有效試驗,否則試驗無效;在試驗有效的情況下,待測樣品無ct值,并且無擴增曲線,表示樣品中無幼蟲芽孢桿菌;待測樣品ct值≤33,并且出現(xiàn)典型的擴增曲線,表示樣品中存在幼蟲芽孢桿菌;待測樣品ct值>33的樣品重復檢測,重復檢測結(jié)果無ct值表示樣品中無幼蟲芽孢桿菌,重復檢測結(jié)果有ct值表示樣品中存在幼蟲芽孢桿菌。
根據(jù)p.larvae16srrna基因序列,設(shè)計了一對特異性引物和一條taqman熒光探針,建立了蜜蜂美洲幼蟲腐臭病病原菌taqman熒光定量pcr檢測方法。
下面結(jié)合試驗對本發(fā)明的應用效果作詳細的描述。
1材料與方法
1.1菌/蟲株p.larvae購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,蜂房蜜蜂球菌(melissococcuspluton)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,蜜蜂微孢子蟲(nosemaapis)、蜜蜂子囊球菌(asosphaeraapis)均由伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心分離保存。
1.2主要試劑基因組dna提取試劑盒購自qiagen公司;taqdna聚合酶、mgcl2、dntps、dl2000marker、pxt19-tvector、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司。
1.3引物和探針的設(shè)計與合成根據(jù)genbank登錄的p.larvae基因保守序列(x60619.1),使用primerprimier5和primerexpress3.0軟件設(shè)計上下游引物(seqidno:1f:5'-ctaatacatgcaagtcgagcgga-3',seqidno:2r:5'–ggtattagctcacgtttccgca-3')和一條探針(seqidno:3p:5'-hex-cttgtgtttctttcgggagacgcca-bhq1-3'),預期擴增片段為129bp。引物和探針均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成。
1.4細菌基因組提取及標準品制備采用基因組dna提取試劑盒從p.larvae標準菌株中提取p.larvae基因組,應用特異性引物進行普通pcr擴增,產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,切膠純化pcr產(chǎn)物,克隆至pxt19-t中構(gòu)建重組質(zhì)粒pxt-16s,轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細菌中,37℃過夜搖菌后提取質(zhì)粒進行普通pcr擴增和送北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司測序,將鑒定正確的重組質(zhì)粒測定濃度,根據(jù)公式:拷貝數(shù)=(質(zhì)量/分子量)×6.0×1023計算其拷貝數(shù),作為熒光定量pcr標準品。
1.5反應體系及反應條件優(yōu)化以pxt-16s標準品作為模板,采用矩陣法分別對反應體系中的引物、探針、dntps、mg2+濃度及反應條件中退火、延伸溫度和時間進行優(yōu)化。
1.6標準曲線的建立將pxt-16s標準品經(jīng)微量紫外分光光度計測定濃度,使用緩沖液稀釋成10倍系列梯度濃度作為模板,于-20℃保存。按優(yōu)化好的體系條件進行熒光定量pcr,繪制標準曲線。
1.7特異性試驗采用基因組dna提取試劑盒提取p.larvae、m.pluton、n.apis、a.apis及健康蜜蜂幼蟲dna,以健康蜜蜂幼蟲dna作為陰性對照模板,設(shè)立無模板空白對照,采用本發(fā)明建立的熒光定量pcr進行檢測,評價該方法的特異性。
1.8敏感性試驗使用緩沖液將pxt-16s標準品進行10倍系列稀釋8個梯度(1.3×107拷貝/μl~1.3×100拷貝/μl),分別作為模板,按優(yōu)化好的體系條件進行熒光定量pcr,確定反應的最小檢出量。同時進行普通pcr反應,比較兩種檢測方法的敏感性。
1.9重復性試驗選取5個不同濃度梯度的pxt-16s標準品分別作為模板,各濃度進行4次重復檢測,根據(jù)ct值計算批內(nèi)變異系數(shù);以上述5個不同濃度的標準品分別作為模板,在3個不同時間進行熒光定量pcr檢測,根據(jù)ct值計算批間變異系數(shù),評價該方法的重復性和穩(wěn)定性。
1.10實驗室模擬樣品和臨床樣品檢測將定量的不同稀釋倍數(shù)的pxt-16s標準品摻入健康成蜂、幼蟲、蜂蛹、蜂蜜、蜂膠、蜂王漿和花粉樣品中制成50份實驗室模擬樣品;采自新疆主要養(yǎng)蜂區(qū)域的100份蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品作為臨床樣品,應用建立的熒光定量pcr方法進行檢測,并與普通pcr方法進行比較。
2結(jié)果
2.1標準品的制備將p.larvaedna進行普通pcr擴增,獲得長度約為130bp的目的片段(圖1),pcr產(chǎn)物經(jīng)測序分析,與genbank中登錄序列的同源性達到100%。將目的片段克隆于pxt19-t中構(gòu)建pxt-16s重組質(zhì)粒標準品,經(jīng)普通pcr和測序鑒定正確后,利用微量紫外分光光度計測定od260nm/od280nm=1.86,計算其濃度為1.3×107拷貝/μl。
2.2反應體系和條件的優(yōu)化通過采用矩陣法優(yōu)選引物和探針最佳濃度配比,最佳反應體系為(25μl):10×pcrbuffer2.5μl,mgcl2(25mmol)1.5μl,dntps(2.5mmol)2μl,上下游引物(10μmol)各1μl,特異性探針(10μmol)0.5μl,taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl,模板dna1μl,加滅菌ddh2o至25μl。最佳反應條件:94℃2min,94℃15s、56℃45s,45個循環(huán),在56℃時收集熒光信號。
2.3標準曲線的建立以10倍系列梯度稀釋的pxt-16s標準品分別作為模板進行熒光定量pcr反應,標準品濃度從1.3×107拷貝/μl~1.3×101拷貝/μl與ct值呈良好的線性關(guān)系,斜率為-3.34,截距為37.89,從而可以得出標準曲線回歸方程式:ct=-3.34×logco+37.89,相關(guān)系數(shù)r2=0.998(圖2)。
2.4特異性試驗應用建立的熒光定量pcr方法,利用蜜蜂常見疫病病原p.larvae、m.pluton、n.apis、a.apis及健康蜜蜂幼蟲dna作為模板,進行特異性試驗,結(jié)果顯示僅p.larvae有特異性曲線,其它病原、陰性對照及無模板空白對照檢測結(jié)果均為陰性(圖3),表明建立的熒光定量pcr方法具有良好的特異性。
2.5敏感性試驗用緩沖液將pxt-16s標準品10倍系列稀釋8個梯度(1.3×107拷貝/μl~1.3×100拷貝/μl),分別作為模板進行熒光定量pcr和普通pcr檢測,結(jié)果顯示熒光定量pcr最小檢出量為1.3×10拷貝/μl,普通pcr最小檢出量為1.3×103拷貝/μl(圖4),表明熒光定量pcr的敏感性比普通pcr提高了約100倍。
2.6重復性試驗選取5個濃度的pxt-16s標準品進行批內(nèi)和批間重復性試驗,根據(jù)擴增反應的ct值,計算變異系數(shù)(cv),數(shù)據(jù)結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)cv≤1.56%,批間變異系數(shù)cv≤2.37%(表1),表明所建立的方法具有較好的重復性。
表1熒光定量pcr的重復性試驗
2.7實驗室模擬樣品和臨床樣品檢測應用建立的熒光定量pcr和普通pcr方法對50份實驗室模擬樣品和采自新疆主要養(yǎng)蜂區(qū)域的100份蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品臨床樣品進行檢測,結(jié)果顯示實驗室模擬樣品熒光定量pcr和普通pcr方法共同檢出20份陽性和10份陰性,兩種檢測方法的符合率為60%。其中熒光定量pcr方法檢測為陽性的40份(陽性率80%)樣品中,僅有20份普通pcr方法檢測為陽性(陽性率40%),熒光定量pcr能檢出加入pxt-16s標準品濃度在1.3×10拷貝/μl以上的實驗室模擬樣品,與預期結(jié)果相一致;蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品臨床樣品兩種方法檢測結(jié)果均為陰性。表明該熒光定量pcr具有良好的臨床應用性。
目前,已報道的p.larvae熒光定量pcr檢測方法有微流體芯片定量pcr和sybrgreen熒光定量pcr方法,前者檢測速度快,但成本高,后者檢測成本低,但特異性差。本發(fā)明根據(jù)p.larvae16srrna基因序列,設(shè)計了一對特異性引物和一條taqman熒光探針,建立了蜜蜂美洲幼蟲腐臭病病原菌taqman熒光定量pcr檢測方法,彌補了上述兩種方法的不足。本發(fā)明建立的方法特異性好,靈敏度高,重復性好,批內(nèi)和批間重復性試驗ct值變異系數(shù)均小于3%;適用范圍廣,檢測成蜂、幼蟲、蜂蛹、蜂蜜、蜂膠、蜂王漿和花粉等實驗室模擬樣品與預期結(jié)果一致。因此,該方法可用于蜜蜂及蜂產(chǎn)品中afb的早期、高通量快速診斷及p.larvae定量分析。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等,均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
<110>伊犁職業(yè)技術(shù)學院、伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心
<120>蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法
<160>3
<210>23
<211>序列的長度
<212>rna
<213>人工序列
<400>核苷酸序列
5'-ctaatacatgcaagtcgagcgga-3'
<210>2
<211>22
<212>rna
<213>人工序列
<400>核苷酸序列
5'–ggtattagctcacgtttccgca-3'
<210>3
<211>25
<212>rna
<213>人工序列
5'-hex-cttgtgtttctttcgggagacgcca-bhq1-3'