本發(fā)明屬于蜜蜂幼蟲芽孢桿菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法。

背景技術(shù)：

美洲幼蟲腐臭病(americanfoulbrood，afb)是由幼蟲芽孢桿菌(paenibacilluslarvae，p.larvae)引起的蜜蜂幼蟲和蛹的一種細菌性、急性、毀滅性傳染病，其典型癥狀為封蓋后死亡的幼蟲巢房蓋變潮濕、下陷、顏色發(fā)暗并顯油光，大部分巢房蓋穿孔，挑取蟲體可拉出長10cm～15cm的膠體狀細絲，患病幼蟲蟲體變軟，失去正常白色和光澤，逐漸變成淡褐色至棕黑色。這種芽孢桿菌有7層結(jié)構(gòu)包圍，特殊的結(jié)構(gòu)使其極具生命力，在惡劣環(huán)境下仍可存活35年以上。afb一旦在蜂場發(fā)生，極易造成幼蟲死亡和蜂群群勢衰弱，且很難徹底清除，給養(yǎng)蜂業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(oie)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為二類動物疫病和進境動物檢疫疫病。目前，afb主要根據(jù)臨床癥狀進行診斷，易造成誤診，實驗室診斷主要是以病原形態(tài)學、病原分離培養(yǎng)、生理生化特征、pcr方法等，確診需要4d～6d，而且由于p.larvae的生長需要復雜的營養(yǎng)，在普通培養(yǎng)基上不能萌發(fā)也不能形成芽孢。近年來，因熒光定量pcr技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點逐漸應用于各種病原體的定性和定量檢測。han等建立了p.larvae的微流體芯片定量pcr方法，該方法只需7.9min完成30個循環(huán)，即可檢測出16srrna基因，并可以進行熔解曲線分析，此方法是目前世界上最快的實時熒光定量分析方法。martinez等針對p.larvae16srrna基因設(shè)計引物，建立了sybrgreen熒光定量pcr檢測方法，該方法用時2h，最低可檢出3.75個細菌/ml和10個芽孢/ml。已報道的上述兩種熒光定量pcr方法中，微流體芯片定量pcr專用儀器設(shè)備、試劑、耗材昂貴，檢測成本較高，目前還不利于普及和推廣應用；sybrgreen熒光定量pcr雖檢測成本低，但pcr反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，引起假陽性，特異性較差。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：

1.微流體芯片定量pcr檢測速度快，但檢測成本高，目前還不利于普及和推廣應用；

2.sybrgreen熒光定量pcr檢測成本低，但檢測結(jié)果假陽性率高，特異性較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法，所述蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法根據(jù)p.larvae16srrna基因序列，設(shè)計了一對特異性引物和一條taqman熒光探針，建立了蜜蜂美洲幼蟲腐臭病病原菌taqman熒光定量pcr檢測方法。具體的檢測流程：

1.dna抽提：采用ctab法或煮沸法或其它常規(guī)dna抽提方法提取樣品、陽性對照、陰性對照中的dna；

2.對照設(shè)置：幼蟲芽孢桿菌或含有目的dna片段的陽性質(zhì)粒作為陽性對照、健康蜜蜂幼蟲dna作為陰性對照，同時設(shè)立無模板空白對照；

3.pcr反應體系配置：在pcr管中加入10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(25mmol)1.5μl，dntps(2.5mmol)2μl，上下游引物(10μmol)各1μl，特異性探針(10μmol)0.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，模板dna1μl，加滅菌ddh2o15.0μl，使反應總體積為25.0μl；

4.pcr反應程序：94℃預變性2min；94℃變性15s、56℃退火延伸45s，共45個循環(huán)，在56℃時收集熒光信號；

5.結(jié)果判定：陰性對照和空白對照無ct值并且無擴增曲線，陽性對照的ct值應≤33，并且出現(xiàn)典型的擴增曲線，說明試驗為有效試驗，否則試驗無效；在試驗有效的情況下，待測樣品無ct值，并且無擴增曲線，表示樣品中無幼蟲芽孢桿菌；待測樣品ct值≤33，并且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中存在幼蟲芽孢桿菌；待測樣品ct值>33的樣品重復檢測，重復檢測結(jié)果無ct值表示樣品中無幼蟲芽孢桿菌，重復檢測結(jié)果有ct值表示樣品中存在幼蟲芽孢桿菌。

進一步，所述特異性引物的序列為：seqidno：1和seqidno：2。

進一步，所述探針的序列為：seqidno：3。

本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：為建立蜜蜂幼蟲芽孢桿菌(p.larvae)熒光定量pcr檢測方法，根據(jù)genbank中幼蟲芽孢桿菌(p.larvae)16srrna基因保守序列設(shè)計特異性引物和探針，經(jīng)反應體系及條件優(yōu)化，建立了檢測p.larvaetaqman熒光定量pcr方法。本發(fā)明與其它病原無交叉反應；最低可檢出1.3×10拷貝/μl的陽性質(zhì)粒，比普通pcr靈敏度高100倍；重復試驗顯示該方法的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于3％。應用本發(fā)明對50份實驗室模擬樣品和100份臨床樣品進行了檢測，與預期結(jié)果一致。

本發(fā)明建立的方法可用于美洲幼蟲腐臭病(afb)的早期快速檢測及p.larvae定量分析；本發(fā)明建立的taqman熒光定量pcr方法，為afb的早期診斷、防控及在分子流行病學研究等方面提供一種新的技術(shù)手段。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的陽性模板的擴增示意圖；

圖中：m：dl2000dnamarker；1：pcrproduct；2：negativecontrol。

圖2是本發(fā)明實施例提供的熒光定量pcr標準曲線示意圖；

圖中：1-7：pxt-16srecombinantplasmiddilutedfrom1.3×10⁷copies/μl-1.3×10¹copies/μl。

圖3是本發(fā)明實施例提供的熒光定量pcr特異性試驗擴增曲線示意圖；

圖中：1：p.larvae；2：negative；3：m.pluton；4：n.apis；5：a.apis；6：blankcontrast。

圖4是本發(fā)明實施例提供的熒光定量pcr(a)與普通pcr(b)敏感性試驗示意圖；

圖中：1-8：1.3×10⁷copiesto1.3×10⁰copies；9：negativecontrol。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。

本發(fā)明實施例提供的蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法包括以下步驟：

1.dna抽提：采用ctab法或煮沸法或其它常規(guī)dna抽提方法提取樣品、陽性對照、陰性對照中的dna；

2.對照設(shè)置：幼蟲芽孢桿菌或含有目的dna片段的陽性質(zhì)粒作為陽性對照、健康蜜蜂幼蟲dna作為陰性對照，同時設(shè)立無模板空白對照；

3.pcr反應體系配置：在pcr管中加入10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(25mmol)1.5μl，dntps(2.5mmol)2μl，上下游引物(10μmol)各1μl，特異性探針(10μmol)0.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，模板dna1μl，加滅菌ddh2o15.0μl，使反應總體積為25.0μl；

4.pcr反應程序：94℃預變性2min；94℃變性15s、56℃退火延伸45s，共45個循環(huán)，在56℃時收集熒光信號；

5.結(jié)果判定：陰性對照和空白對照無ct值并且無擴增曲線，陽性對照的ct值應≤33，并且出現(xiàn)典型的擴增曲線，說明試驗為有效試驗，否則試驗無效；在試驗有效的情況下，待測樣品無ct值，并且無擴增曲線，表示樣品中無幼蟲芽孢桿菌；待測樣品ct值≤33，并且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中存在幼蟲芽孢桿菌；待測樣品ct值>33的樣品重復檢測，重復檢測結(jié)果無ct值表示樣品中無幼蟲芽孢桿菌，重復檢測結(jié)果有ct值表示樣品中存在幼蟲芽孢桿菌。

根據(jù)p.larvae16srrna基因序列，設(shè)計了一對特異性引物和一條taqman熒光探針，建立了蜜蜂美洲幼蟲腐臭病病原菌taqman熒光定量pcr檢測方法。

下面結(jié)合試驗對本發(fā)明的應用效果作詳細的描述。

1材料與方法

1.1菌/蟲株p.larvae購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，蜂房蜜蜂球菌(melissococcuspluton)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，蜜蜂微孢子蟲(nosemaapis)、蜜蜂子囊球菌(asosphaeraapis)均由伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心分離保存。

1.2主要試劑基因組dna提取試劑盒購自qiagen公司；taqdna聚合酶、mgcl2、dntps、dl2000marker、pxt19-tvector、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3引物和探針的設(shè)計與合成根據(jù)genbank登錄的p.larvae基因保守序列(x60619.1)，使用primerprimier5和primerexpress3.0軟件設(shè)計上下游引物(seqidno：1f：5'-ctaatacatgcaagtcgagcgga-3'，seqidno：2r：5'–ggtattagctcacgtttccgca-3')和一條探針(seqidno：3p：5'-hex-cttgtgtttctttcgggagacgcca-bhq1-3')，預期擴增片段為129bp。引物和探針均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成。

1.4細菌基因組提取及標準品制備采用基因組dna提取試劑盒從p.larvae標準菌株中提取p.larvae基因組，應用特異性引物進行普通pcr擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠純化pcr產(chǎn)物，克隆至pxt19-t中構(gòu)建重組質(zhì)粒pxt-16s，轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細菌中，37℃過夜搖菌后提取質(zhì)粒進行普通pcr擴增和送北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司測序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒測定濃度，根據(jù)公式：拷貝數(shù)＝(質(zhì)量/分子量)×6.0×10²³計算其拷貝數(shù)，作為熒光定量pcr標準品。

1.5反應體系及反應條件優(yōu)化以pxt-16s標準品作為模板，采用矩陣法分別對反應體系中的引物、探針、dntps、mg²⁺濃度及反應條件中退火、延伸溫度和時間進行優(yōu)化。

1.6標準曲線的建立將pxt-16s標準品經(jīng)微量紫外分光光度計測定濃度，使用緩沖液稀釋成10倍系列梯度濃度作為模板，于-20℃保存。按優(yōu)化好的體系條件進行熒光定量pcr，繪制標準曲線。

1.7特異性試驗采用基因組dna提取試劑盒提取p.larvae、m.pluton、n.apis、a.apis及健康蜜蜂幼蟲dna，以健康蜜蜂幼蟲dna作為陰性對照模板，設(shè)立無模板空白對照，采用本發(fā)明建立的熒光定量pcr進行檢測，評價該方法的特異性。

1.8敏感性試驗使用緩沖液將pxt-16s標準品進行10倍系列稀釋8個梯度(1.3×10⁷拷貝/μl～1.3×10⁰拷貝/μl)，分別作為模板，按優(yōu)化好的體系條件進行熒光定量pcr，確定反應的最小檢出量。同時進行普通pcr反應，比較兩種檢測方法的敏感性。

1.9重復性試驗選取5個不同濃度梯度的pxt-16s標準品分別作為模板，各濃度進行4次重復檢測，根據(jù)ct值計算批內(nèi)變異系數(shù)；以上述5個不同濃度的標準品分別作為模板，在3個不同時間進行熒光定量pcr檢測，根據(jù)ct值計算批間變異系數(shù)，評價該方法的重復性和穩(wěn)定性。

1.10實驗室模擬樣品和臨床樣品檢測將定量的不同稀釋倍數(shù)的pxt-16s標準品摻入健康成蜂、幼蟲、蜂蛹、蜂蜜、蜂膠、蜂王漿和花粉樣品中制成50份實驗室模擬樣品；采自新疆主要養(yǎng)蜂區(qū)域的100份蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品作為臨床樣品，應用建立的熒光定量pcr方法進行檢測，并與普通pcr方法進行比較。

2結(jié)果

2.1標準品的制備將p.larvaedna進行普通pcr擴增，獲得長度約為130bp的目的片段(圖1)，pcr產(chǎn)物經(jīng)測序分析，與genbank中登錄序列的同源性達到100％。將目的片段克隆于pxt19-t中構(gòu)建pxt-16s重組質(zhì)粒標準品，經(jīng)普通pcr和測序鑒定正確后，利用微量紫外分光光度計測定od260nm/od280nm＝1.86，計算其濃度為1.3×10⁷拷貝/μl。

2.2反應體系和條件的優(yōu)化通過采用矩陣法優(yōu)選引物和探針最佳濃度配比，最佳反應體系為(25μl)：10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(25mmol)1.5μl，dntps(2.5mmol)2μl，上下游引物(10μmol)各1μl，特異性探針(10μmol)0.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，模板dna1μl，加滅菌ddh2o至25μl。最佳反應條件：94℃2min，94℃15s、56℃45s，45個循環(huán)，在56℃時收集熒光信號。

2.3標準曲線的建立以10倍系列梯度稀釋的pxt-16s標準品分別作為模板進行熒光定量pcr反應，標準品濃度從1.3×10⁷拷貝/μl～1.3×10¹拷貝/μl與ct值呈良好的線性關(guān)系，斜率為-3.34，截距為37.89，從而可以得出標準曲線回歸方程式：ct＝-3.34×logco+37.89，相關(guān)系數(shù)r²＝0.998(圖2)。

2.4特異性試驗應用建立的熒光定量pcr方法，利用蜜蜂常見疫病病原p.larvae、m.pluton、n.apis、a.apis及健康蜜蜂幼蟲dna作為模板，進行特異性試驗，結(jié)果顯示僅p.larvae有特異性曲線，其它病原、陰性對照及無模板空白對照檢測結(jié)果均為陰性(圖3)，表明建立的熒光定量pcr方法具有良好的特異性。

2.5敏感性試驗用緩沖液將pxt-16s標準品10倍系列稀釋8個梯度(1.3×10⁷拷貝/μl～1.3×10⁰拷貝/μl)，分別作為模板進行熒光定量pcr和普通pcr檢測，結(jié)果顯示熒光定量pcr最小檢出量為1.3×10拷貝/μl，普通pcr最小檢出量為1.3×10³拷貝/μl(圖4)，表明熒光定量pcr的敏感性比普通pcr提高了約100倍。

2.6重復性試驗選取5個濃度的pxt-16s標準品進行批內(nèi)和批間重復性試驗，根據(jù)擴增反應的ct值，計算變異系數(shù)(cv)，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)cv≤1.56％，批間變異系數(shù)cv≤2.37％(表1)，表明所建立的方法具有較好的重復性。

表1熒光定量pcr的重復性試驗

2.7實驗室模擬樣品和臨床樣品檢測應用建立的熒光定量pcr和普通pcr方法對50份實驗室模擬樣品和采自新疆主要養(yǎng)蜂區(qū)域的100份蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品臨床樣品進行檢測，結(jié)果顯示實驗室模擬樣品熒光定量pcr和普通pcr方法共同檢出20份陽性和10份陰性，兩種檢測方法的符合率為60％。其中熒光定量pcr方法檢測為陽性的40份(陽性率80％)樣品中，僅有20份普通pcr方法檢測為陽性(陽性率40％)，熒光定量pcr能檢出加入pxt-16s標準品濃度在1.3×10拷貝/μl以上的實驗室模擬樣品，與預期結(jié)果相一致；蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品臨床樣品兩種方法檢測結(jié)果均為陰性。表明該熒光定量pcr具有良好的臨床應用性。

目前，已報道的p.larvae熒光定量pcr檢測方法有微流體芯片定量pcr和sybrgreen熒光定量pcr方法，前者檢測速度快，但成本高，后者檢測成本低，但特異性差。本發(fā)明根據(jù)p.larvae16srrna基因序列，設(shè)計了一對特異性引物和一條taqman熒光探針，建立了蜜蜂美洲幼蟲腐臭病病原菌taqman熒光定量pcr檢測方法，彌補了上述兩種方法的不足。本發(fā)明建立的方法特異性好，靈敏度高，重復性好，批內(nèi)和批間重復性試驗ct值變異系數(shù)均小于3％；適用范圍廣，檢測成蜂、幼蟲、蜂蛹、蜂蜜、蜂膠、蜂王漿和花粉等實驗室模擬樣品與預期結(jié)果一致。因此，該方法可用于蜜蜂及蜂產(chǎn)品中afb的早期、高通量快速診斷及p.larvae定量分析。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110>伊犁職業(yè)技術(shù)學院、伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心

<120>蜜蜂幼蟲芽孢桿菌taqman熒光定量pcr檢測方法

<160>3

<210>23

<211>序列的長度

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

5'-ctaatacatgcaagtcgagcgga-3'

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

5'–ggtattagctcacgtttccgca-3'

<210>3

<211>25

<212>rna

<213>人工序列

5'-hex-cttgtgtttctttcgggagacgcca-bhq1-3'