本發(fā)明涉及一種基于單分子測(cè)序的同卵雙胞胎法醫(yī)檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于基因測(cè)序領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：法醫(yī)dna分析技術(shù)隨著基因研究領(lǐng)域的高速發(fā)展，越來(lái)越多的為涉及個(gè)體識(shí)別的案件提供客觀依據(jù)。其主要原理為通過(guò)檢測(cè)個(gè)體之間基因?qū)用娲嬖诘牟顒e，對(duì)不同個(gè)體進(jìn)行識(shí)別?，F(xiàn)在已經(jīng)成為法庭科學(xué)中的一項(xiàng)重要組成部分。但是在涉及同卵雙胞胎的案件中，由于其二者由同一受精卵發(fā)育而成，基因極為相似，雖然在同卵雙胞胎的基因并非100％一致，但由于二者間差異非常細(xì)小，傳統(tǒng)dna分析手段無(wú)法確認(rèn)嫌疑人究竟是同卵雙胞胎的哪一位，故亟待找到一種可以檢測(cè)到同卵雙胞胎個(gè)體間在基因?qū)用嫔蠀^(qū)別的方法，以對(duì)這種“基因相同”的不同個(gè)體進(jìn)行區(qū)別。尋找解決方案的其中一個(gè)方向就是找到一個(gè)標(biāo)記基因，根據(jù)其在雙胞胎之間的差異為個(gè)體識(shí)別提供依據(jù)。近年來(lái)大量文獻(xiàn)表明dyz1這一人類y染色體中的基因，可以在同卵雙胞胎間作為標(biāo)記基因?qū)ζ溥M(jìn)行區(qū)分【1】，基因名為dyz1的衛(wèi)星序列約占人類y染色體總量的20％【2】，男性y染色體中中dyz1被鑒定為一個(gè)3.4kb大小的條帶【3】，其主要包含一5核苷酸重復(fù)模組，如“ttcaa”“atcca”“ttaca”等，一個(gè)正常男性y染色體包含3000-3400個(gè)dyz1序列的拷貝，雖然dyz1基因不參與重組【4】，但其也被推測(cè)其在基因組中中具有重要性，大量重復(fù)的序列片段會(huì)承載不適當(dāng)?shù)耐蛔冐?fù)荷。dyz1現(xiàn)在報(bào)告在染色質(zhì)折疊和維護(hù)中起著至關(guān)重要的作用。由于dyz1處于人類y染色體異染色體區(qū)域，理論上同卵雙胞胎的受精卵在分裂早期階段，各自的y染色體會(huì)發(fā)生纏繞而發(fā)生變異，在發(fā)育為個(gè)體后便能偶以這些突變作為標(biāo)記予以區(qū)分。sahu等人利用限制性內(nèi)切酶酶譜分析和sanger測(cè)序的方法證明dyz1基因在同卵雙胞胎中具有多態(tài)性【1】。此研究結(jié)果為dyz1作為一種用于同卵雙胞胎個(gè)體識(shí)別基因標(biāo)記提供理論基礎(chǔ)。但在這sahu的研究中，他們采用sanger法對(duì)dyz1基因進(jìn)行測(cè)序，這種方法不但工作量大，用時(shí)長(zhǎng)，更重要的是在對(duì)dyz1拷貝進(jìn)行測(cè)序時(shí)，由于其主要由多種重復(fù)單元組成，一代和讀長(zhǎng)(800bp)無(wú)法跨越重復(fù)區(qū)，加之dyz1序列本身拷貝量龐大，測(cè)序得出的相似的碎片化的序列信息就無(wú)法拼接?！?】sahu,monalisha,andjosyulag.prasuna."twinstudies:auniqueepidemiologicaltool."indianjournalofcommunitymedicine:officialpublicationofindianassociationofpreventive&socialmedicine41.3(2016):177.【2】yadavsk,kumaria,alis:fateofthehumanychromosomelinkedgenesandlociinprostatecancercelllinesdu145andlncap.bmcgenomics2013,14:323.}【3】nakahoriy,mitanik,yamadam,nakgomey:ahumanychromosomespecificrepeateddnafamily(dyz1)consistsofatandemarrayofpentanucleotides.nucleicacidres1986,14:7569–7580.【4】lahnbt,pearsonnm,jegaliank:thehumanychromosomeinthelightofevolution.natrevgenet2001,2:207–216技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種同卵雙胞胎法醫(yī)檢測(cè)試劑盒，其基于單分子實(shí)時(shí)dna測(cè)序技術(shù)對(duì)人體y染色體dyz1片段進(jìn)行測(cè)序，具體包括：pcr擴(kuò)增引物、ampurexpbeads純化磁珠以及單分子測(cè)序相關(guān)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述pcr擴(kuò)增引物序列如下：正向：3’-cctttcctttcgcttgcattccat-5’反向：3’-cattgactggaaaggctgggtg-5’。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述pcr擴(kuò)增引物序列如下：正向：3’-nnnnnnnnnnnnnnnncctttcctttcgcttgcattccat-5’反向：3’-nnnnnnnnnnnnnnnncattgactggaaaggctgggtg-5’；其中，所述引物序列中的nnnnnnnnnnnnnnnn為barcode序列，共16個(gè)堿基。其是根據(jù)pacbio公司公布的“barcode指南”而獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述ampurexpbeads純化磁珠用于對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。所述單分子測(cè)序相關(guān)試劑包括測(cè)序引物結(jié)合試劑、連接測(cè)序酶試劑以及magbeads純化試劑。本發(fā)明的目的之二是提供一種采用所述同卵雙胞胎法醫(yī)檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法僅用于個(gè)體識(shí)別，具體步驟如下：1)采用所述pcr擴(kuò)增引物擴(kuò)增目的片段dyz1；2)采用ampurexpbeads純化磁珠用于對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；3)單分子測(cè)序建庫(kù)；4)上樣測(cè)序比對(duì)獲得結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單分子測(cè)序建庫(kù)步驟分為：a、結(jié)合測(cè)序引物；b、結(jié)合測(cè)序酶；c、magbeads純化。因此本專利技術(shù)通過(guò)使用單分子實(shí)時(shí)dna測(cè)序技術(shù)平臺(tái)解決了dyz1在作為標(biāo)記基因時(shí)測(cè)序困難的問(wèn)題。第三代基因測(cè)序技術(shù)又被為"singlemoleculerealtime(smrttm)dnasequencing"(單分子實(shí)時(shí)dna測(cè)序技術(shù))，該方法基于納米孔的單分子讀取技術(shù)，可快速讀取序列。其優(yōu)勢(shì)非常明顯，其測(cè)序讀長(zhǎng)很長(zhǎng)：平均測(cè)序讀長(zhǎng)能達(dá)到3000至5000堿基，最長(zhǎng)的序列能達(dá)到20000堿基。而且其準(zhǔn)確率高：對(duì)基因組變異檢測(cè)，可以最高達(dá)到99.999％的準(zhǔn)確率；選用特殊測(cè)序模式，測(cè)序準(zhǔn)確率可以在達(dá)到單個(gè)分子99％準(zhǔn)確率的條件下，讀長(zhǎng)超過(guò)經(jīng)典的sanger測(cè)序法。與sanger測(cè)序相比，pacbio的超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，可以跨越dyz1的重復(fù)區(qū)，測(cè)量出真實(shí)的dyz1序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)dyz1準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便快捷的測(cè)序需要。附圖說(shuō)明圖1：實(shí)施例2中不同引物序列的擴(kuò)增結(jié)果，泳道1-10分別對(duì)應(yīng)組1-10引物序列所擴(kuò)增的引物片段具體實(shí)施方式還可進(jìn)一步通過(guò)實(shí)施例來(lái)理解本發(fā)明，其中所述實(shí)施例說(shuō)明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實(shí)施例不限制本發(fā)明?，F(xiàn)在已知的或進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的本發(fā)明的變化被認(rèn)為落入本文中描述的和以下要求保護(hù)的本發(fā)明范圍之內(nèi)。實(shí)施例1(一)擴(kuò)增目的片段dyz1首先將3對(duì)同卵雙胞胎的基因組樣本進(jìn)行編號(hào)：六個(gè)樣品分別來(lái)自三對(duì)同卵雙胞胎，樣品1、2為一對(duì)，樣品3、4為一對(duì)，樣品5、6為一對(duì)。以其為模板對(duì)其進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列：正向：nnnnnnnnnnnnnnnn(pacbioindex16nt)cctttcctttcgcttgcattccat反向：nnnnnnnnnnnnnnnn(pacbioindex16nt)cattgactggaaaggctgggtgpcr體系(50ul)templatedna10nglataq(takara)0.5ul(2u)forwardprimer2ulreverseprimer2ul10xbuffer(含mg+)5uldntps5ulddh2o補(bǔ)齊50ul體系(二)磁珠法純化dyz1擴(kuò)增產(chǎn)物使用ampurexpbeads純化磁珠。1、結(jié)合：將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物加入振蕩混勻的磁珠結(jié)合液，顛倒混勻。將ep管置于磁力架上進(jìn)行磁分離，棄廢液(吸凈管蓋及管底殘液)。2、洗滌：⑴加入洗滌液(75％乙醇溶液)，點(diǎn)振數(shù)次(若有團(tuán)狀或絲狀物可增加點(diǎn)振次數(shù)及力度)，然后磁分離，將混合物放置于磁力架上，吸凈管蓋及管底的殘液；⑵再次加入洗滌，點(diǎn)振數(shù)次(若有團(tuán)狀或絲狀物可增加點(diǎn)振次數(shù)及力度)，然后磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液；⑶重復(fù)步驟⑵一次；⑷室溫下開(kāi)蓋干燥。3、洗脫：加入洗脫液，室溫孵育5分鐘后，放置于磁力架上使溶液與磁珠分離，小心吸取上清液至新的ep管中，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。(三)pacbio建庫(kù)并進(jìn)行單分子測(cè)序使用pacbio公司smrtbell模板制備試劑盒。由于使用約3000bp的擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，既略過(guò)dna打斷、修復(fù)、補(bǔ)平末端等步驟。文庫(kù)構(gòu)建流程1)平末端連接1、首先按照下表配置連接反應(yīng)體系：成分體積(ul)dna(純化后)31annealbluntadapter(20um)2templateprepbuffer4atplow2ligase1h2o補(bǔ)齊40ul總體積402.混勻后25℃孵育過(guò)夜。3.65℃孵育10分鐘使連接酶失活,混合體系命名為ligateddna，4℃保存.2)去掉連接失敗產(chǎn)物按下表各組分輕柔混合體系37℃孵育1小時(shí),4℃儲(chǔ)存.在此步驟完成后需要純化dna。成分體積(ul)ligateddna40exoiii0.5exovii0.5總體積413)磁珠純化1.加入18.9ul清洗后的ampurexpbeads(即42ul的0.45x)置于振蕩器上2000r/min震蕩10min。2.離心后磁力架上靜置5min，棄上清后加200ul70％乙醇清洗兩次，不要吹打。3.晾干30s，加入50uleb，置于振蕩器上2000r/min振蕩1min，回收上清。4.加入22.5ul清洗后的ampurexpbeads(50ul的0.45x)，置于振蕩器上2000r/min振蕩10min。5.離心后磁力架上靜置5min，棄上清后加入200ul70％乙醇清洗兩次不要吹打6.晾干30s,加入10uleb，置于振蕩器上2000r/min振蕩1min，回收上清。7.利用q-bit測(cè)定文庫(kù)濃度，計(jì)算測(cè)序引物用量。8.利用agilentbioanalyzer2100檢測(cè)文庫(kù)片段大小，也可以用bluepippin切膠回收片段。上機(jī)測(cè)試準(zhǔn)備1)測(cè)序引物結(jié)合稀釋測(cè)序引物成分體積(ul)sequenceprimerv21elutionbuffer32.3總體積33.3置于pcr儀上，80℃反應(yīng)2min，之后冰上放置。在200ul低吸附管內(nèi)混合文庫(kù)與測(cè)序引物，此步驟需要通過(guò)軟件calculator計(jì)算。體系混合好后置于pcr儀上，20℃反應(yīng)30min。成分體積(ul)h2o0.9910xprimerbuffer0.89文庫(kù)6稀釋后引物0.98總體積(產(chǎn)物-1)8.662)結(jié)合測(cè)序酶1、首先對(duì)測(cè)序酶按下表進(jìn)行稀釋。成分體積(ul)sa-dnapolymerasep6(500nmol/l)1.5bindingbuffer13.5總體積152、取新1.5mlep管，然后按下表依次加入以下試劑混勻。置于pcr儀上，30℃，30min；4℃保持。(不需設(shè)置熱蓋)成分體積(ul)dntp1.5dtt13.5bindingbuffer15混合制備好的文庫(kù)(產(chǎn)物-1)8.86稀釋后的酶1.5補(bǔ)水至總體積(產(chǎn)物-2)14.863)magbeads純化1、取新1.5ml離心管，加入下表組分，混合備用成分體積(ul)magbeadbindingbuffer8.5產(chǎn)物-20.5總體積92、取新的1.5ml離心管加入35ulmagbeads，磁力架上靜置5min，棄上清。3、加入35ulmagbeadswashbuffer，震蕩混勻，磁力架上靜置5min，棄上清。4、重復(fù)步驟35、加入9ul步驟2稀釋的樣品，4℃旋轉(zhuǎn)混勻20min6、加入18ulmagbeadsbindingbuffer，磁力架上靜置5分鐘，棄上清7、重復(fù)步驟68、加入45ulmagbeadsbindingbuffer，磁力架上靜置5min，轉(zhuǎn)上清至樣品板，準(zhǔn)備上機(jī)上機(jī)前添加p6intercontrol到樣品中，監(jiān)測(cè)器pipette吸樣，p6加樣方式式擴(kuò)散。4)上樣順序上機(jī)前30min從-20℃冰箱取出試劑板，在4℃避光融化；融化后1000r/min，離心1min，撕膜加墊，將試劑板、mix板、樣品板、酶和油放入測(cè)序儀。放置槍頭smrtcell，點(diǎn)擊“close”，關(guān)閉機(jī)器艙蓋。點(diǎn)擊“scan”，儀器自動(dòng)檢測(cè)放入的加樣板，識(shí)別后點(diǎn)擊“start”，機(jī)器開(kāi)始運(yùn)行。(四)數(shù)據(jù)分析-分析同卵雙胞胎之間測(cè)序結(jié)果的差異。六個(gè)樣品分別來(lái)自三對(duì)同卵雙胞胎，樣品1、2為一對(duì)，樣品3、4為一對(duì)，樣品5、6為一對(duì)。其六個(gè)樣品之間的測(cè)序所得結(jié)果互相比較，所有測(cè)出序列中不存在完全一樣的兩條序列，樣品間兩兩比較得出互相之間的一致性，分別在表中列出已執(zhí)行最低的結(jié)果和一致性最高的結(jié)果。樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5樣品6一致性最低97.21％97.05％96.64％97.02％97.12％97.54％一致性最高99.64％99.58％99.73％99.67％99.58％99.64％我們發(fā)現(xiàn)，同卵雙胞胎之間y染色體的dyz1區(qū)域是存在明顯差異的，這與其常染色體的情況不同，證實(shí)了可以根據(jù)這一位點(diǎn)的序列差異對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。以樣品1為例：1.ccs>3單分子測(cè)序循環(huán)數(shù)在3以上的數(shù)據(jù)：共21,120條能在序列兩端檢索到擴(kuò)增引物的序列15,067條,且不存在序列完全相同的兩條序列。測(cè)序結(jié)果與y染色體參考序列比對(duì)后，14905條序列完全可以比對(duì)上，一致率為81.93～99.61％與y染色體參考序列比對(duì)到28個(gè)位置，一致率在93.92-99.61％。2.ccs>6單分子測(cè)序循環(huán)數(shù)在6以上的數(shù)據(jù)：共12,902條能在序列兩端檢索到擴(kuò)增引物的序列10,327條,且不存在序列完全相同的兩條序列。測(cè)序結(jié)果與y染色體參考序列比對(duì)后，10,254條序列完全可以比對(duì)上，一致率為81.93～99.61％與y染色體參考序列比對(duì)到27個(gè)位置。實(shí)施例2引物設(shè)計(jì)選擇按照實(shí)施例1的步驟一的技術(shù)方案，設(shè)計(jì)不同的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，以評(píng)價(jià)引物特異性，具體引物如下：組1f：ctatacatgactctgccctttcctttcgcttgcattccat組1r：gcgcacgcactacagacattgactggaaaggctgggtg組2f：tactagagtagcactccctttcctttcgcttgcattccat組2r：acactgacgtcgcgaccattgactggaaaggctgggtg組3f：tgtgtatcagtacatgcctttcctttcgcttgcattccat組3r：cgtctatatacgtatacattgactggaaaggctgggtg組4f：acacgcatgacacactcctttcctttcgcttgcattccat組4r：atagagactcagagctcattgactggaaaggctgggtg組5f：gatctctactatatgccttctactgcatacaatttcactcc組5r：tagatgcgagagtagagaataaagtggaatgctacggtctc組6f：acagtctatactgctgcttctactgcatacaatttcactcc組6r：catagcgactatcgtggaataaagtggaatgctacggtctc組7f：atgatgtgctacatctcttctactgcatacaatttcactcc組7r：catcactacgctagatgaataaagtggaatgctacggtctc組8f：ctgcgtgctctacgaccttctactgcatacaatttcactcc組8r：cgcatctgtgcatgcagaataaagtggaatgctacggtctc組9f：gcgcgatacgatgactcttctactgcatacaatttcactcc組9r：tatgtgatcgtctctcgaataaagtggaatgctacggtctc組10f：tcagacgatgcgtcatcttctactgcatacaatttcactcc組10r：cgcgctcagctgatcggaataaagtggaatgctacggtctc上述引物序列中，下劃線部分為barcode序列，除barcode序列外，組1-4序列相同，組5-10序列相同，具體擴(kuò)增結(jié)果參見(jiàn)圖1，從圖1可以看出，組1-4的引物序列條帶大小比較均一，經(jīng)后續(xù)測(cè)序證明所擴(kuò)增片段為dyz1基因位點(diǎn)，引物特異性好。而組5-10引物序列條帶均一性差，擴(kuò)增效果不佳。本
發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說(shuō)明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容中具體記載一樣。當(dāng)前第1頁(yè)12