本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因遺傳變異的檢測(cè)，特別涉及一種tnni1基因輔助檢測(cè)牛生長(zhǎng)和胴體性狀的方法及專用試劑盒。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和信息技術(shù)的發(fā)展，國(guó)際上的動(dòng)物育種已經(jīng)逐漸進(jìn)入分子水平。動(dòng)物分子育種是以分子遺傳學(xué)和分子數(shù)量學(xué)為理論，利用分子生物學(xué)技術(shù)來改良畜禽品種的一種新興學(xué)科。根據(jù)英、美等西方發(fā)達(dá)國(guó)家和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織的預(yù)測(cè)，21世紀(jì)全球畜牧業(yè)的90％畜禽品種將會(huì)應(yīng)用分子育種技術(shù)。分子育種幾乎涉及遺傳資源的保護(hù)和開發(fā)利用、選種選配、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)、數(shù)量性狀基因座(qtl)的檢測(cè)與利用等育種的所有領(lǐng)域。

分子育種技術(shù)正在對(duì)未來肉牛的育種和生產(chǎn)產(chǎn)生巨大的影響。由于牛的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，因此早期有效的檢測(cè)和利用影響肉牛生產(chǎn)性狀及抗病能力的主效基因或與之緊密連鎖的分子標(biāo)記，結(jié)合標(biāo)記輔助選擇(mas)方法將大大提高肉牛育種的進(jìn)展。標(biāo)記輔助選擇由于充分利用了表型、系譜和遺傳標(biāo)記的信息，與常規(guī)選種方法相比，具有更大的信息量。同時(shí)由于這種選擇方法不易受環(huán)境因素的影響，且沒有性別、年齡的限制，因而可進(jìn)行早期選擇，縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，進(jìn)而提高選擇效率和準(zhǔn)確性，尤其是對(duì)于限性性狀、低遺傳力性狀及難以測(cè)量的屠宰性狀。目前國(guó)外肉牛育種已經(jīng)運(yùn)用的分子標(biāo)記基因，包括先天性缺陷(maplesyrupurine，mannosidosis)、肌肉品質(zhì)(cast，thyr，leptin)、生長(zhǎng)和體軀結(jié)構(gòu)(myostatin)等。新西蘭已經(jīng)利用腐蹄病基因(mhc-dqa)診斷試劑盒檢測(cè)大規(guī)模隨機(jī)牛群的腐蹄病。但從目前的研究結(jié)果和應(yīng)用效果來看，mas雖然有不少成功的事例，總體上仍處于試驗(yàn)研究階段，要真正有效地用于牛的育種，尚有不少需要解決的問題。

我國(guó)地方牛品種資源豐富，是世界上牛種最多的國(guó)家。盡管品種很多，但相對(duì)國(guó)外優(yōu)質(zhì)牛品種，我國(guó)的牛品種體格偏小、后驅(qū)不發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)速度慢、屠宰率和凈肉率偏低，滿足不了現(xiàn)代肉牛生產(chǎn)規(guī)?；l(fā)展的要求。因此，對(duì)我國(guó)地方優(yōu)良牛生長(zhǎng)性狀的選育勢(shì)在必行，只有達(dá)到了高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)相統(tǒng)一，才能使我國(guó)的肉牛品種趕超歐美等國(guó)的優(yōu)質(zhì)肉牛品種。

近年來，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(pcr-sscp)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(pcr-rflp)和pcr產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)等。pcr-sscp可以發(fā)現(xiàn)靶dna片段中未知位置的堿基突變；另外，pcr-sscp可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈dna進(jìn)行分離，并且還可以進(jìn)一步提純；然而該方法制膠繁瑣，電泳時(shí)溫度需保持在4℃，電泳結(jié)果重復(fù)性相對(duì)較差。pcr-rflp的基本原理是用pcr擴(kuò)增目的dna，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小的片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的dna片段條帶。此項(xiàng)技術(shù)大大提高了目的dna的含量和相對(duì)特異性，而且方法簡(jiǎn)便，分型時(shí)間短。

肌鈣蛋白(troponin，tn)屬于鈣離子結(jié)合蛋白多基因家族的成員，在肌肉收縮時(shí)起關(guān)鍵作用并影響家畜肉質(zhì)性狀，由肌鈣蛋白c，肌鈣蛋白i和肌鈣蛋白t三個(gè)部分組成。其中，肌鈣蛋白i(tni)基因家族包括慢肌型(tnni1)、快肌型(tnni2)和心肌型(tnni3)三種亞型。

人類的肌鈣蛋白i(tni)基因中，tnni1、tnni2和tnni3分別在骨骼肌快肌、慢肌和心肌中進(jìn)行組織分布和特異性表達(dá)。在骨骼肌形成過程，tnni1和tnni2基因只在早起發(fā)育階段共同表達(dá)，之后則分別在骨骼肌纖維中各自表達(dá)(myersetal.1996)。

楊華等(2009)對(duì)豬tni家族基因在大白和梅山豬胚胎65天、出生后3天、35天、60天、120天和180天6個(gè)時(shí)期的背最長(zhǎng)肌、半腱肌和心肌中進(jìn)行了表達(dá)規(guī)律分析，在出生后tnni1和tnni2在快收縮為主的背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)顯著高于在以慢肌為主的半腱肌。無論是在背最長(zhǎng)肌中還是在半腱肌中，tnni2的相對(duì)表達(dá)量一直高于tnni1，但是在心肌中的表達(dá)，兩者則是相反的。組織表達(dá)譜分析表明，三者在被檢測(cè)組織中均廣泛表達(dá)，其中tnni1和tnni2在骨骼肌中表達(dá)量最高，tnni3在心臟中表達(dá)量最高。吳婷婷等(2013)利用實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr技術(shù)分析tnni1基因在天府肉羊部分組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明：tnni1基因在所選擇的天府肉羊12個(gè)組織中，腹肌表達(dá)量最高，股二頭肌其次，與其他組織差異極顯著(p<0.01)；在腹肌組織中tnni1基因的表達(dá)量隨年齡的增長(zhǎng)而減少。賀花等(2014)采集了胎牛、新生牛和成年牛3個(gè)不同時(shí)期的秦川牛的8或9個(gè)組織，進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析，從定量結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)了肌肉組織中特異性表達(dá)的基因tnni1，這個(gè)基因僅在肌肉組織中高表達(dá)，其他組織幾乎不表達(dá)或表達(dá)量很低；此外，還發(fā)現(xiàn)tnni1基因在胎牛時(shí)期表達(dá)水平最低，新生牛時(shí)期表達(dá)水平急劇升高，成年牛時(shí)期表達(dá)水平達(dá)到最高。但是tnni1基因在肌肉組織中的表達(dá)與牛生產(chǎn)性狀的表觀差異性是否存在關(guān)聯(lián)還無法確認(rèn)。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)家畜上tnni1基因研究的報(bào)道很少，特別是關(guān)于牛的相關(guān)性研究還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種tnni1基因輔助檢測(cè)牛生長(zhǎng)和胴體性狀的方法及專用試劑盒，其通過尋找與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的單核苷酸變異(snv)作為分子標(biāo)記，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀牛種群的建立。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)牛tnni1基因遺傳變異的方法，包括以下步驟：以待測(cè)牛全基因組dna為模板，以引物對(duì)t為引物，pcr擴(kuò)增牛tnni1基因部分片段，用限制性內(nèi)切酶aatii酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定牛tnni1基因上單核苷酸變異位點(diǎn)(tnni1基因內(nèi)含子4第185位的遺傳變異)的基因型；

所述的引物對(duì)t為：

上游引物：5’-cagcgaggtgagtgaga-3’；

下游引物：5’-aacctcaggaccaccttcagggaaggacgtcacacac-3’。

所述的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

所述瓊脂糖凝膠電泳所用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為4％。

所述牛tnni1基因上單核苷酸變異位點(diǎn)具有cc、ct和tt三種基因型，酶切后的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果為：cc基因型表現(xiàn)為194bp和26bp的兩條電泳條帶，ct基因型表現(xiàn)為220bp、194bp和26bp的三條電泳條帶，tt基因型表現(xiàn)為220bp的一條電泳條帶。

一種tnni1基因輔助檢測(cè)牛生長(zhǎng)和胴體性狀的試劑盒，該試劑盒包括用于tnni1基因上單核苷酸變異位點(diǎn)(tnni1基因內(nèi)含子4第185位的遺傳變異)基因型鑒定的pcr-rflp檢測(cè)試劑，其中，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系包括上述引物對(duì)t。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益技術(shù)效果：

本發(fā)明根據(jù)篩查得到的目的基因tnni1上的遺傳突變，使用pcr-rflp技術(shù)進(jìn)行遺傳突變分型，最終從dna水平上鑒別tnni1基因上snv位點(diǎn)的突變dna序列(基因型)和突變頻率，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，不需要特殊儀器的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)所檢測(cè)的tnni1基因snv與牛生長(zhǎng)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，tnni1基因在該snv位點(diǎn)的不同基因型對(duì)牛的生長(zhǎng)和胴體性狀有顯著或極顯著影響(p<0.05或p<0.01)，即tnni1基因上的該位點(diǎn)能夠作為提高牛生長(zhǎng)和胴體性狀的分子標(biāo)記，使得檢測(cè)牛tnni1基因在該位點(diǎn)的遺傳變異的方法可以用于中國(guó)牛優(yōu)質(zhì)肉用生長(zhǎng)和胴體性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的牛種群。

本發(fā)明利用pcr-rflp技術(shù)首次對(duì)牛tnni1基因進(jìn)行了遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)tnni1基因上特定snv位點(diǎn)的不同基因型對(duì)牛生長(zhǎng)和胴體性狀有顯著或極顯著影響(p<0.05或p<0.01)，表明tnni1基因可以作為牛生長(zhǎng)和胴體性狀有效的選擇標(biāo)記。結(jié)合此發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出了用于tnni1基因輔助檢測(cè)牛生長(zhǎng)和胴體性狀的試劑盒，方便檢測(cè)牛tnni1基因在該位點(diǎn)的遺傳變異，提高檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性。

本發(fā)明提供的牛tnni1基因遺傳變異檢測(cè)方法，針對(duì)第4內(nèi)含子第185位單核苷酸由c突變?yōu)閠，通過在設(shè)計(jì)的下游引物的3’端引入堿基錯(cuò)配，人工創(chuàng)造出限制性內(nèi)切酶aatii所識(shí)別的切割位點(diǎn)：gacgt↓c。當(dāng)沒有引入錯(cuò)配堿基t時(shí)，pcr擴(kuò)增tnni1基因后在錯(cuò)配位置附近無法形成限制性內(nèi)切酶aatii識(shí)別位點(diǎn)；而當(dāng)引入錯(cuò)配堿基t時(shí)，pcr擴(kuò)增tnni1基因后可在特定等位基因存在時(shí)形成aatii識(shí)別位點(diǎn)。通過電泳可以準(zhǔn)確、快速、方便的檢測(cè)tnni1基因此位點(diǎn)的突變。

附圖說明

圖1是本發(fā)明用來檢測(cè)各樣本遺傳變異情況的酶切后的電泳結(jié)果：自左至右泳道分別代表基因型cc、tt、cc、cc、cc、cc、ct、cc電泳帶型和dnamarkeri。

圖2是本發(fā)明不同基因型對(duì)應(yīng)的測(cè)序圖譜：自上而下分別是cc、ct和tt基因型測(cè)序圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明首先根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布牛tnni1基因(ncbireferencesequence:ac_000173.1)的序列設(shè)計(jì)引物，以中國(guó)荷斯坦奶牛和秦川牛的基因組dna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，隨機(jī)等量混合5～10個(gè)個(gè)體的pcr產(chǎn)物為1個(gè)(混合)樣品并對(duì)其進(jìn)行純化，測(cè)序。其次，根據(jù)樣品測(cè)序結(jié)果和ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的序列，使用blast軟件比對(duì)后篩查出snv位點(diǎn)。之后，對(duì)待測(cè)群體進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)的pcr-rflp檢測(cè)。最后，根據(jù)檢測(cè)到的不同基因型，進(jìn)行群體遺傳統(tǒng)計(jì)分析和生長(zhǎng)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與牛生長(zhǎng)和胴體性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記。

i、牛tnni1基因dna序列snv

本發(fā)明根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布牛tnni1基因(ncbireferencesequence:ac_000173.1)的序列設(shè)計(jì)引物，以2個(gè)牛品種的基因組dna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，將測(cè)序后得到的牛tnni1基因的dna序列與ncbi公布的dna序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在tnni1基因內(nèi)含子4第185位存在單核苷酸突變。

1、牛全血樣本采集

本發(fā)明具體以2個(gè)牛品種的種群作為檢測(cè)對(duì)象，具體采集樣本見表1：中國(guó)荷斯坦奶牛(150頭)，中國(guó)地方黃牛秦川牛(426頭)；

表1.牛全血樣本的采集(2013-10至2015-7)

2、基因組dna的提取

血液基因組dna提取過程具體步驟如下：

(1)吸取1ml半凍融狀態(tài)下的血樣，于2ml的滅菌離心管中；

(2)向滅菌管中加入pbs緩沖液1ml，使總體積達(dá)到2ml，上下顛倒混勻，10min后放入預(yù)冷的高速離心機(jī)中(4℃)，12000rpm離心10min；

(3)棄上清，重復(fù)上面的步驟2～3次，直到上清液變清亮；

(4)先后分別加入dna抽提液800μl和蛋白酶k15μl，混勻后，放入恒溫水浴箱中56℃過夜消化蛋白質(zhì)等，當(dāng)溶液變得澄清透明時(shí)，便可拿出；

(5)放置室溫10min，加入1mltris飽和酚，放在冰上溫和搖動(dòng)10min；之后放入預(yù)冷的高速離心機(jī)中(4℃)，12000rpm離心10min；用移液器小心吸取上清液到滅菌離心管中；

(6)加入500μl的tris飽和酚和500μl的氯仿，放在冰上溫和搖動(dòng)10min；之后放入預(yù)冷的高速離心機(jī)中(4℃)，12000rpm離心10min；用移液器小心吸取上清液到另一個(gè)滅菌的離心管中；

(7)加入1ml的氯仿，放在冰上溫和搖動(dòng)10min；之后放入預(yù)冷的高速離心機(jī)中(4℃)，12000rpm離心10min；用移液器小心吸取上清液到另一個(gè)滅菌的離心管中；

(8)加入至少2倍體積的無水乙醇，上下顛倒數(shù)次使dna析出；之后放入預(yù)冷的高速離心機(jī)中(4℃)，12000rpm離心10min，棄去乙醇；

(9)加入70％的乙醇1ml，溫和搖動(dòng)10min；之后放入預(yù)冷的高速離心機(jī)中(4℃)，12000rpm離心10min，棄去乙醇；

(10)室溫下讓乙醇揮發(fā)干凈，加入一定量滅菌水溶解dna，完全溶解后測(cè)定濃度和純度。

3、引物設(shè)計(jì)

以ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已公布的牛tnni1基因(ncbireferencesequence:ac_000173.1)為參考序列，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)pcr引物對(duì)t，其上、下游引物擴(kuò)增了牛tnni1基因第4內(nèi)含子區(qū)域。

引物對(duì)t序列如下：

上游引物：5’-cagcgaggtgagtgaga-3’；

下游引物：5’-aacctcaggaccaccttcagggaaggacgtcacacac-3’；

4、pcr擴(kuò)增

pcr反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的pcr反應(yīng)的個(gè)數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個(gè)1.5ml離心管中，混勻后離心，再分裝到每個(gè)0.2mlpcr管中，然后加入模板dna，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系見表2：

表2.pcr反應(yīng)體系

pcr反應(yīng)程序：

5、pcr產(chǎn)物純化和測(cè)序

pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行目的條帶的切膠回收及純化。在紫外燈下，從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠塊，放入1.5ml離心管中，然后用pcr產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化pcr產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作。把以上2個(gè)品種pcr擴(kuò)增產(chǎn)物各自混合后送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與ncbi公布的序列進(jìn)行比對(duì)，篩查到秦川牛tnni1基因的1個(gè)snv位點(diǎn)，該變異位于牛tnni1基因第4內(nèi)含子第185位；中國(guó)荷斯坦奶牛沒有篩查到任何snv位點(diǎn)。

ii、牛tnni1基因遺傳變異的pcr-rflp檢測(cè)

1、pcr反應(yīng)條件

pcr擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件如i部分的內(nèi)容所述，pcr擴(kuò)增后產(chǎn)物按1(產(chǎn)物):1(內(nèi)切酶)質(zhì)量比例直接加入限制性內(nèi)切酶aatii進(jìn)行酶切。酶切時(shí)放入37℃的恒溫水浴鍋或培養(yǎng)箱中進(jìn)行過夜消化，如果發(fā)現(xiàn)pcr產(chǎn)物未消化完全可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，消化時(shí)間一般為12-18h。酶切體系為：內(nèi)切酶1.0μl、10×tbuffer2.0μl、0.1％bsa2.0μl、pcr產(chǎn)物0.5μg、滅菌水補(bǔ)至20μl。

2、pcr-rflp檢測(cè)

當(dāng)dna序列中的堿基發(fā)生突變時(shí)，可形成不同的基因型，可以通過pcr-rflp進(jìn)行判定，如圖1所示，根據(jù)電泳后的目的條帶能夠?qū)⒉煌幕蛐蛥^(qū)分開，從而檢測(cè)其snv(經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，圖2)。電泳條件為：4％瓊脂糖凝膠電泳，室溫下，電壓120v，電泳時(shí)間1-2h。

當(dāng)tnni1基因第4內(nèi)含子第185位點(diǎn)未發(fā)生突變時(shí)，使用引物對(duì)t進(jìn)行pcr擴(kuò)增，可形成限制性內(nèi)切酶aatii的酶切位點(diǎn)；而當(dāng)?shù)?內(nèi)含子第185位點(diǎn)由c突變?yōu)閠時(shí)，使用引物對(duì)t進(jìn)行pcr擴(kuò)增，不會(huì)形成限制性內(nèi)切酶aatii的酶切位點(diǎn)，從而對(duì)該位點(diǎn)snv進(jìn)行檢測(cè)。

當(dāng)限制性內(nèi)切酶aatii對(duì)擴(kuò)增的基因片段進(jìn)行酶切消化時(shí)，如果有限制性內(nèi)切酶aatii的識(shí)別切割位點(diǎn)，則擴(kuò)增的片段將會(huì)被切成兩個(gè)片段。具體而言，cc基因型表現(xiàn)為194bp和26bp的兩條電泳條帶，ct基因型表現(xiàn)為220bp、194bp和26bp三條不同的條帶，tt基因型表現(xiàn)為220bp條帶(因26bp的條帶片段太小，電泳中只看到194bp和220bp的電泳條帶，但不影響分型)。其中，cc基因型是野生純合基因型，ct基因型為雜合基因型，tt基因型是突變純合基因型。

iii、不同基因型和性狀的關(guān)聯(lián)分析

通過對(duì)牛tnni1基因dna序列遺傳變異進(jìn)行分析，以及不同基因型和性狀的關(guān)聯(lián)分析，以確定這些變異對(duì)牛生長(zhǎng)和胴體性狀的影響，為牛優(yōu)良生長(zhǎng)和胴體性狀的標(biāo)記輔助選擇和新的優(yōu)良品種的育種提供重要的研究資料，最終為牛生長(zhǎng)發(fā)育和牛肉品質(zhì)的改善提供科學(xué)依據(jù)。

1、群體中基因型的判定

利用上述的snv檢測(cè)方法對(duì)150頭中國(guó)荷斯坦奶牛和426頭中國(guó)地方黃牛秦川牛dna樣品分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳判定基因型。

2、snv位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率統(tǒng)計(jì)分析

(1)基因頻率：指一個(gè)群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬?duì)比率。實(shí)際上就是純合子基因型頻率加上包含該基因的各種雜合子頻率之和的1/2。公式如下：

pi＝[2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)]/2n

其中：pi：第i個(gè)等位基因的頻率；

ii：第i個(gè)等位基因純合的個(gè)體數(shù)；

ijn：i與jn共顯性等位基因的個(gè)體數(shù)；

n：群體中的個(gè)體數(shù)。

(2)基因型頻率：指一個(gè)群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。因?yàn)閜cr-rflp的檢測(cè)結(jié)果是共顯性等位基因，所以表型頻率和基因型頻率相一致。

paa＝naa/n

其中：pnn代表某一位點(diǎn)的nn基因型頻率；

nnn表示群體中具有nn基因型的個(gè)體數(shù)；

n為檢測(cè)群體的總數(shù)。

具體的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3：

表3.兩個(gè)牛品種tnni1基因snv位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率

3、基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件spss20.0版本，對(duì)30月齡階段秦川牛的不同基因型的個(gè)體與生長(zhǎng)和胴體性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性檢驗(yàn)。(見表4)。

1)測(cè)定的性狀包括：體高、體斜長(zhǎng)、腰角寬、空腹24h宰前活重、胴體重、屠宰率。

2)測(cè)定的群體：秦川牛數(shù)據(jù)資料由實(shí)驗(yàn)室人員和牛場(chǎng)管理人員現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定并記錄。

3)關(guān)聯(lián)分析時(shí)使用的一般線性模型：調(diào)用spss20.0軟件中的一般線性模型對(duì)不同基因型對(duì)生長(zhǎng)和胴體性狀的影響進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。建立以下統(tǒng)計(jì)模型：

yijk＝μ+mi+gj+eijk

其中：yijk：個(gè)體表型記錄；μ：個(gè)體性狀的總體均值；mi：屠宰月齡效應(yīng)；gj：基因型效應(yīng)；eijk：隨機(jī)誤差。

關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4：秦川牛tnni1基因座ct基因型個(gè)體的30月齡的體高、體斜長(zhǎng)、宰前活重、胴體重顯著或極顯著大于cc和tt基因型個(gè)體(p<0.05或p<0.01)，因此，ct基因型為秦川牛群體中的優(yōu)勢(shì)基因型。由此，在今后的秦川牛早期育種工作中，應(yīng)當(dāng)優(yōu)先選擇ct基因型的個(gè)體，從而加快建立具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的牛種群。

表4.秦川牛tnni1基因不同基因型之間最小二乘均值差異顯著性檢驗(yàn)的關(guān)聯(lián)分析

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±se)；在同一行中小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05).

ⅳ、試劑盒

本發(fā)明利用pcr-rflp技術(shù)首次對(duì)牛tnni1基因進(jìn)行了遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)tnni1基因上特定snv位點(diǎn)的不同基因型對(duì)牛生長(zhǎng)和胴體性狀有顯著或極顯著影響(p<0.05或p<0.01)，表明tnni1基因可以作為牛生長(zhǎng)和胴體性狀有效的選擇標(biāo)記。結(jié)合此發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出了用于tnni1基因輔助檢測(cè)牛生長(zhǎng)和胴體性狀的專用試劑盒。

一、試劑盒成分：

1.1針對(duì)tnni1基因設(shè)計(jì)的基因特異性引物

上游引物：5’-cagcgaggtgagtgaga-3’；

下游引物：5’-aacctcaggaccaccttcagggaaggacgtcacacac-3’；

1.2生化試劑

dnamarkeri(分子量大小依次分別是600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)；

2×estaqmastermix(內(nèi)含mg²⁺、dntps等)；

滅菌超純水。

二、試劑盒操作說明

2.1pcr操作說明

2.1.1pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系

pcr反應(yīng)體系包括：2×estaqmastermix7.5μl；滅菌超純水(ddh2o)6.4μl；上、下游引物各0.3μl；dna模板0.5μl，反應(yīng)體系總共15μl。

2.1.2pcr擴(kuò)增程序

pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共34個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10min，12℃結(jié)束保存。

2.2酶切、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)與基因型判定

擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶aatii過夜消化后，用4％濃度的瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，不同個(gè)體檢測(cè)出cc、ct或tt基因型。

2.3待檢個(gè)體的選擇與淘汰

表4中關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：針對(duì)tnni1基因突變位點(diǎn)，秦川牛ct基因型個(gè)體的30月齡的體高、體斜長(zhǎng)、宰前活重、胴體重顯著或極顯著大于cc和tt基因型個(gè)體(p<0.05或p<0.01)，因此，ct為優(yōu)勢(shì)基因型。由此，在今后的秦川牛早期育種工作中，應(yīng)當(dāng)優(yōu)先選擇ct基因型的個(gè)體留種進(jìn)行擴(kuò)繁，從而加快建立具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的牛種群。

2.4操作時(shí)的注意事項(xiàng)

(1)模板dna(?；蚪Mdna)的提取按照經(jīng)典的苯酚-氯仿法進(jìn)行操作，dna的濃度至少應(yīng)在50ng/μl，若提取效果不佳，需要純化后再進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

(2)pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照說明書操作即可，但要保證擴(kuò)增條帶的特異性和擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，以免影響后續(xù)的試驗(yàn)結(jié)果。

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>一種tnni1基因輔助檢測(cè)牛生長(zhǎng)和胴體性狀的方法及專用試劑盒

<160>2

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

cagcgaggtgagtgaga17

<210>2

<211>37

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

aacctcaggaccaccttcagggaaggacgtcacacac37