本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種在鎘誘導(dǎo)下，利用蕓薹屬植物抑制鎘等重金屬吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因（簡稱“抑鎘基因”）mrna的表達(dá)變化篩選抑鎘能力強(qiáng)的蕓薹屬植物的方法，該方法可以用于低積累鎘蕓薹屬植物的種質(zhì)資源的篩選和鑒定。
背景技術(shù)：
隨著礦山的采冶，肥料和農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致了目前許多土壤受到不同程度的鎘污染。輕度污染的土壤大規(guī)模休耕不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，為了保證輕度鎘污染土壤的安全生產(chǎn)利用，選擇低積累重金屬的植物是一條極其重要的途徑。已有的研究表明植物對重金屬鎘的富集能力存在種間差異，且同一物種內(nèi)不同的品系也有顯著的差別。蕓薹屬植物是我國的主要油料作物和蔬菜的來源，為了保證食用油和蔬菜的供給，輕度污染土壤不能完全休耕，因此選擇能在輕度污染土壤上種植、且體內(nèi)重金屬含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)的蕓薹屬植物種質(zhì)資源是食用油和蔬菜安全生產(chǎn)的重要保證。蕓薹屬植物種質(zhì)資源豐富，分布廣，其中某些品種或品系在是低積累鎘的。我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，一些低積累鎘的蕓薹屬植物在鎘脅迫下，一些抑鎘基因mrna表達(dá)量與鎘處理濃度正相關(guān)，植物通過加強(qiáng)這些基因的表達(dá)來降低對鎘的吸收，因此，可以利用這些基因的表達(dá)變化來評價植物的抑鎘能力，通過定量pcr來檢測植物在鎘誘導(dǎo)下這些基因的表達(dá)變化來評價植物對鎘吸收的抑制能力，從而到達(dá)快速選擇低積累鎘植物的目的。全基因組測序表明了蕓薹屬各物種（如：白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜等）之間基因序列的相似性比較高，因此，在一定鎘濃度的處理下，可以利用定量pcr來測定蕓薹屬植物中抑鎘基因表達(dá)變化來選擇鎘積累能力弱的蕓薹屬植物，為重金屬輕度污染土壤上安全種植蕓薹屬植物提供支持。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對蕓薹屬植物鎘抑制吸收的分子機(jī)制相關(guān)信息較少，提供一種早期鎘脅迫下利用抑鎘基因的mrna表達(dá)變化篩選低積累鎘的蕓薹屬植物的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案：一種快速判斷低積累鎘蕓薹屬植物的基因，其引物的具體序列如下：
d-鎘-1：f:5'-catctttcttctttgtggtaaactg-3'r:5'-cagtttaccacaaagaagaaagatg-3'
d-鎘-2:f:5'-tcttcaccatccaacggctca-3'r:5'-cctccaccgtatccgacctca-3'
d-鎘-3:f:5'-ggcaagtcaaccttctccaaa-3'r:5'-agcaagactaaccgtttcagc-3'
d-鎘-4:f:5'-tctcaccaggagcatccgaagt-3'r:5'-tagaccagcggtgtcccatcc-3'
d-鎘-5:f:5'-ctgccacgaaacggcttgacc-3'r:5'-ctccctcgtcgctacgctcat-3'
所述f為基因上游引物,r為基因下游引物。
一種快速判斷低積累鎘蕓薹屬植物的方法，包括如下步驟:
1）選取芥菜型油菜的種子為材料，表面滅菌后接種于ms固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，設(shè)置對照和處理，處理組含鎘，對照組不含鎘，置于溫室中生長多天，然后提取處理和對照組芥菜型油菜的根和葉的總rna，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測序，通過數(shù)據(jù)分析，得出差異表達(dá)的mrna序列，獲得表達(dá)量在根和葉中同時增加了2.00倍以上mrna序列，結(jié)合擬南芥、白菜、甘藍(lán)型油菜等十字花科植物已公布的同源基因的序列和功能，分析這些表達(dá)量增加了2.00倍以上mrna序列的功能，從中篩選能抑制鎘等重金屬吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，即抑鎘基因；在基因保守區(qū)設(shè)計引物，同時以actin基因?yàn)楸磉_(dá)參照基因。
2）定量pcr分析所述抑鎘基因表達(dá)量變化與鎘處理濃度的相關(guān)性：取上述芥菜型油菜的種子，表面滅菌后，接種于不同鎘濃度的常規(guī)ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后取各培養(yǎng)基上的植株，分別提取根部和葉片的總rna，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量pcr實(shí)驗(yàn)，同時以actin基因?yàn)閰⒄栈?，重?fù)多次；
3）根據(jù)定量pcr檢測基因mrna表達(dá)量測定的結(jié)果，與對照相比，找到在所有的處理組根和葉中表達(dá)量都增加了2.00倍以上的基因，確定這些基因?yàn)橐宙k基因，擴(kuò)增這些基因的引物序列如下：
d-鎘-1：f:5'-catctttcttctttgtggtaaactg-3'r:5'-cagtttaccacaaagaagaaagatg-3'
d-鎘-2:f:5'-tcttcaccatccaacggctca-3'r:5'-cctccaccgtatccgacctca-3'
d-鎘-3:f:5'-ggcaagtcaaccttctccaaa-3'r:5'-agcaagactaaccgtttcagc-3'
d-鎘-4:f:5'-tctcaccaggagcatccgaagt-3'r:5'-tagaccagcggtgtcccatcc-3'
d-鎘-5:f:5'-ctgccacgaaacggcttgacc-3'r:5'-ctccctcgtcgctacgctcat-3'
所述f為基因上游引物,r為基因下游引物。
4）利用抑鎘基因的引物檢測蕓薹屬植物在ms培養(yǎng)基中、鎘濃度為5-25mg·kg-1的誘導(dǎo)下的根和葉中基因表達(dá)的變化，分別提取植株根部和葉片的總rna，反轉(zhuǎn)錄后，以actin基因的表達(dá)為參照，進(jìn)行定量pcr實(shí)驗(yàn)，重復(fù)多次，取平均數(shù)，定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件和結(jié)果分析按常規(guī)的方法進(jìn)行；
5）作出結(jié)論:如果抑鎘基因在處理組油菜根部和葉片比對照組都顯著增加2.00倍以上，則可以判定該蕓薹屬植物是具有很強(qiáng)的抑制鎘吸收的能力，可以作為鎘的低積累植物。
作為優(yōu)選，步驟（1）中處理組和對照組于溫室中生長30天，處理組鎘濃度為15mg·kg-1，日夜長比為16/8h，日夜溫為22/16℃，光照強(qiáng)度為250μmolm-2s-1。
作為優(yōu)選，步驟（2）中常規(guī)ms固體培養(yǎng)基的鎘濃度分別為0、5、10、15、20、25mg·kg-1，日夜長比為16/8h，日夜溫為22/16℃，光照強(qiáng)度為200μmolm–2s–1培養(yǎng)15天。
作為優(yōu)選，步驟（4）中所述蕓薹屬植物的植株在ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天，日夜長比為16/8h,日夜溫為22/16℃,光照強(qiáng)度為200μmolm–2s–1。
作為優(yōu)選，步驟（1）中利用原子光譜吸收法確定低積累鎘芥菜型油菜；采用高通量測序技術(shù)平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測序；利用軟件primerpremier5.0在基因保守區(qū)設(shè)計引物。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明以鎘誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)的抑鎘基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計引物，建立了反轉(zhuǎn)錄-定量pcr技術(shù)體系，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，建立了利用鎘誘導(dǎo)下抑鎘基因mrna的變化選擇低積累鎘的蕓薹屬植物的方法，此方法快速、敏感和特異性強(qiáng)，大大節(jié)約了鑒定的時間和費(fèi)用，提高了蕓薹屬植物低積累鎘性狀的鑒定效率，具有很好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
確定鎘誘導(dǎo)下芥菜型油菜根和葉中表達(dá)量同時增加的抑鎘基因的引物。
選取已確定的低積累鎘的芥菜型油菜為材料，取飽滿的種子，用升汞表面滅菌后，用無菌吸水紙吸干種子表面的水分，接種于常規(guī)ms固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基上。設(shè)置對照和處理，處理組鎘濃度為15mg·kg-1，對照組不含鎘，日夜長比為16/8h，日夜溫為22/16℃，光照強(qiáng)度為250μmolm-2s-1，在溫室中生長30天。
提取處理和對照組芥菜型油菜的根和葉的總rna,采用高通量測序技術(shù)平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測序，去除平均質(zhì)量值小于20的讀段，得到可用讀段，然后對可用讀段進(jìn)行denovo拼接后組裝得到芥菜型油菜混合轉(zhuǎn)錄組庫，通過數(shù)據(jù)分析，得出差異表達(dá)的mrna序列，選取表達(dá)量在根和葉中同時上調(diào)2.00倍以上mrna序列。結(jié)合擬南芥、白菜、甘藍(lán)型油菜等十字花科植物已公布的同源基因的序列和功能，分析這些表達(dá)量增加了2.00倍以上mrna序列的功能，從中篩選能抑制鎘等重金屬吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，即抑鎘基因；在基因保守區(qū)設(shè)計引物，同時以actin基因?yàn)閰⒄栈虿⒃O(shè)計引物，引物序列為：正向引物5'-agatgcctgatggacaagtga-3'，反向引物：5'-ccaatcatagactgctggtaaag-3'。
取上述芥菜型油菜的種子，用升汞表面滅菌后，用無菌吸水紙吸干種子表面的水分，接種于常規(guī)ms固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基上。取在常規(guī)ms培養(yǎng)基上，鎘濃度水平分別為0、5、10、15、20、25mg·kg-1，日夜長比為16/8h,日夜溫為22/16℃,光照強(qiáng)度為200μmolm–2s–1培養(yǎng)15天的植株。分別提取這些植株根部和葉片的總rna，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量pcr實(shí)驗(yàn)，同時以actin基因?yàn)閰⒄栈?，重?fù)3次。
根據(jù)定量pcr檢測基因mrna表達(dá)量的結(jié)果，與對照相比，確定了5個基因在所有的處理組中根和葉中表達(dá)量都顯著增加2.00倍以上，因此確定這些基因?yàn)橐宙k基因，以這些基因表達(dá)是否上調(diào)2.00倍以上來評價蕓薹屬植物的抑制鎘吸收的能力。
所述芥菜油菜鎘誘導(dǎo)下在根和葉中表達(dá)量顯著上調(diào)5個抑鎘基因的引物（上游引物簡稱f,下游引物簡稱r）具體序列如下：
d-鎘-1：f:5'-catctttcttctttgtggtaaactg-3'r:5'-cagtttaccacaaagaagaaagatg-3'
d-鎘-2:f:5'-tcttcaccatccaacggctca-3'r:5'-cctccaccgtatccgacctca-3'
d-鎘-3:f:5'-ggcaagtcaaccttctccaaa-3'r:5'-agcaagactaaccgtttcagc-3'
d-鎘-4:f:5'-tctcaccaggagcatccgaagt-3'r:5'-tagaccagcggtgtcccatcc-3'
d-鎘-5:f:5'-ctgccacgaaacggcttgacc-3'r:5'-ctccctcgtcgctacgctcat-3'
實(shí)施例2
取以原子吸收光譜測定確定的低積累鎘的芥菜型油菜材料的種子，用升汞表面滅菌后，用無菌吸水紙吸干種子表面的水分，接種于常規(guī)ms固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，設(shè)置對照組和處理組，鎘濃度分別為0、20mg·kg-1。在日夜長比為16/8h,日夜溫為22/16℃,光照強(qiáng)度為200μmolm–2s–1的條件下培養(yǎng)15天，提取上述芥菜型油菜根部和葉片的總rna，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量pcr實(shí)驗(yàn)，同時以actin基因?yàn)閰⒄栈?，重?fù)3次，取平均數(shù)。定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件和結(jié)果分析按常規(guī)的方法進(jìn)行。
基因表達(dá)變化分析。采用定量pcr對實(shí)施例1中的提供的引物進(jìn)行基因表達(dá)的檢測，結(jié)果如表2。
表220mg·kg-1鎘處理對芥菜型油菜抑鎘基因表達(dá)量的影響
當(dāng)ms培養(yǎng)基中鎘濃度為20mg·kg-1，與對照相比，低積累鎘的芥菜型油菜在鎘誘導(dǎo)下5個抑鎘基因的表達(dá)量在根和葉中都上調(diào)了2.00倍以上。
實(shí)施例3
以原子吸收光譜測定法確定的低積累鎘的甘藍(lán)型油菜的種子為材料。種子表面滅菌后，用無菌吸水紙吸干種子表面的水分，接種于常規(guī)ms固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，設(shè)置對照組和處理組，鎘濃度分別為0、25mg·kg-1。在日夜長比為16/8h,日夜溫為22/16℃,光照強(qiáng)度為200μmolm–2s–1的條件下培養(yǎng)15天，提取上述甘藍(lán)型油菜根部和葉片的總rna，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量pcr實(shí)驗(yàn)，同時以actin基因?yàn)閰⒄栈颍貜?fù)3次，取平均數(shù)。定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件和結(jié)果分析按常規(guī)的方法進(jìn)行。采用定量pcr對實(shí)施例1中的提供的引物進(jìn)行基因表達(dá)的檢測，結(jié)果如表3。
表325mg·kg-1鎘處理對甘藍(lán)型油菜抑鎘基因表達(dá)量的影響
根據(jù)表3的結(jié)果，當(dāng)ms培養(yǎng)基中鎘濃度為25mg·kg-1，所選擇的低積累鎘的甘藍(lán)型油菜的根和葉中這5個抑鎘基因的表達(dá)量比對照的上調(diào)了2.00倍以上。
實(shí)施例4
以湖南某礦區(qū)鎘輕度污染菜地生長的白菜的種子為材料，利用原子吸收光譜測定法確定該材料具有低積累鎘的特點(diǎn)。種子表面滅菌后，用無菌吸水紙吸干種子表面的水分，接種于常規(guī)ms固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，設(shè)置對照組和處理組，鎘濃度分別為0、5mg·kg-1。在日夜長比為16/8h,日夜溫為22/16℃,光照強(qiáng)度為200μmolm–2s–1的條件下培養(yǎng)15天，提取上述白菜根部和葉片的總rna，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量pcr實(shí)驗(yàn)，同時以actin基因?yàn)閰⒄栈?，重?fù)3次，取平均數(shù)。定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件和結(jié)果分析按常規(guī)的方法進(jìn)行。采用定量pcr對實(shí)施例1中的提供的引物進(jìn)行基因表達(dá)的檢測，結(jié)果如表4。
表45mg·kg-1鎘處理對白菜抑鎘基因表達(dá)量的影響
根據(jù)表4的結(jié)果，當(dāng)ms培養(yǎng)基中鎘濃度為5mg·kg-1，所選擇的低積累鎘的白菜的根和葉中這5個抑鎘基因的表達(dá)量比對照的上調(diào)了2.00倍以上。
序列表：
<>湖南科技大學(xué)
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>agatgcctgatggacaagtga
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>ccaatcatagactgctggtaaag
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>catctttcttctttgtggtaaactg
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>cagtttaccacaaagaagaaagatg
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>tcttcaccatccaacggctca
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>cctccaccgtatccgacctca
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>ggcaagtcaaccttctccaaa
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>agcaagactaaccgtttcagc
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>tctcaccaggagcatccgaagt
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>tagaccagcggtgtcccatcc
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>ctgccacgaaacggcttgacc
<>dna
<>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<>ctccctcgtcgctacgctcat
<110>湖南科技大學(xué)
<120>一種快速判斷低積累鎘蕓薹屬植物的基因及方法
<160>12
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>1
agatgcctgatggacaagtga21
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>2
ccaatcatagactgctggtaaag23
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>3
catctttcttctttgtggtaaactg25
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>4
cagtttaccacaaagaagaaagatg25
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>5
tcttcaccatccaacggctca21
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>6
cctccaccgtatccgacctca21
<210>7
<211>21
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>7
ggcaagtcaaccttctccaaa21
<210>8
<211>21
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>8
agcaagactaaccgtttcagc21
<210>9
<211>22
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>9
tctcaccaggagcatccgaagt22
<210>10
<211>21
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>10
tagaccagcggtgtcccatcc21
<210>11
<211>21
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>11
ctgccacgaaacggcttgacc21
<210>12
<211>21
<212>dna
<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）
<400>12
ctccctcgtcgctacgctcat21