本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及種結(jié)直腸癌診斷和治療效果評價(jià)相關(guān)的基因。
背景技術(shù)：
：中醫(yī)證候是對疾病的高度概括，是一系列復(fù)雜臨床癥狀和體征的集中描述。在這些表象背后，應(yīng)該有其特定的生物學(xué)基礎(chǔ)。也就是說，每個(gè)證候群的背后都有支持它的相應(yīng)基因組學(xué)背景，證候復(fù)雜多樣性的表現(xiàn)很可能就是基因多態(tài)性和不同功能基因異常表達(dá)的表型。因此，從基因的表達(dá)差異方面尋找證的相關(guān)基因，就有可能使對證本質(zhì)的認(rèn)識提高到一個(gè)新的高度。結(jié)直腸癌(colorectalcancer，crc)是最常見的惡性腫瘤之一，我們在前期對結(jié)直腸癌中醫(yī)證型的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，脾氣虧虛證是最常見的單純虛證，與濕熱內(nèi)蘊(yùn)證及肝腎虧虛證的病因病機(jī)、臨床表現(xiàn)有明顯差異，因而本研究選擇以此二型為對照探討結(jié)直腸癌脾氣虧虛證在基因水平上可能的發(fā)生機(jī)制，為探討脾氣虧虛證的本質(zhì)提供參考。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種通過檢測ccin基因或蛋白表達(dá)差異來對結(jié)直腸癌進(jìn)行診斷或?qū)χ委熜ЧM(jìn)行評價(jià)的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了檢測ccin基因或ccin蛋白的產(chǎn)品在制備脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者診斷或治療效果評價(jià)工具中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述檢測ccin基因或ccin蛋白的產(chǎn)品包括檢測ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合ccin基因的核酸或者能夠結(jié)合ccin蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ccin基因的表達(dá)水平；所述物質(zhì)能夠檢測ccin蛋白的表達(dá)水平。本發(fā)明的檢測ccin基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點(diǎn)雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。上面所述的核酸包括擴(kuò)增ccin基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過化學(xué)合成來制備。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述核酸為qpcr實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。上面所述的核酸還可包括探針，與ccin基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個(gè)堿基對或更長，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個(gè)堿基對，最長一般不超過30個(gè)堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個(gè)堿基對最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對，以免影響雜交效率。本發(fā)明的檢測ccin蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學(xué)法、western印跡等。本發(fā)明的檢測ccin蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合ccin蛋白的抗體。所述chka蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述ccin蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能夠保留與ccin蛋白的結(jié)合能力即可。抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免疫動(dòng)物后，從經(jīng)過免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的ccin蛋白或其部分對獲得的抗體實(shí)施抗原特異性純化來獲得針對ccin蛋白的單克隆抗體。可以如下制備多克隆抗體：用與上文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實(shí)施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實(shí)施。例如，可以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準(zhǔn)備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-nh2、生物素標(biāo)記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-nh2、過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標(biāo)記試劑盒諸如熒光素標(biāo)記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標(biāo)記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標(biāo)記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標(biāo)記試劑盒、qdot(tm)抗體標(biāo)記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標(biāo)記的抗體或其片段。進(jìn)一步，所述檢測ccin基因或ccin蛋白的產(chǎn)品可以是檢測ccin基因或ccin蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。利用所述產(chǎn)品檢測晚期結(jié)腸癌患者血液中的ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平，如果與非脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者相比，血液中ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平顯著降低，則診斷所述晚期結(jié)腸癌患者為脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者，如果藥物干預(yù)治療后，脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者血液中ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)且與非脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者血液中ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平基本持平，則評價(jià)該脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者的脾氣虧虛證已經(jīng)痊愈，不需繼續(xù)服用藥物，反之，則評價(jià)該患者治療效果不好，需要繼續(xù)服用藥物。作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣本，可以使用例如自活檢患者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣本來自患者的血液。本發(fā)明還提供了一種用于脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者診斷或治療效果評價(jià)的工具，所述工具能夠檢測晚期結(jié)直腸癌患者樣本中ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平。所述工具包括能夠結(jié)合ccin基因的核酸或者能夠結(jié)合ccin蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ccin基因的表達(dá)水平；所述物質(zhì)能夠檢測ccin蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。進(jìn)一步，所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和對照人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知ccin基因的異常與晚期結(jié)直腸癌的脾氣虧虛證相關(guān)也屬于ccin基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測ccin基因轉(zhuǎn)錄水平的針對ccin基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的ccin蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測包括ccin基因在內(nèi)的多個(gè)基因的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測包括ccin蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與多個(gè)其他標(biāo)志物同時(shí)檢測，可大大提高診斷準(zhǔn)確率。本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗ccin抗體的其他性質(zhì)同前面所述。進(jìn)一步，所述患者樣本可以使用例如自活檢患者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣本來自患者的血液。本發(fā)明還提供了一種用于脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者診斷或治療效果評價(jià)的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取晚期結(jié)直腸癌患者的樣品；(2)檢測樣品中ccin基因或蛋白的表達(dá)水平；(3)如果與非脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者相比，血液中ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平顯著降低，則診斷所述晚期結(jié)腸癌患者為脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者，如果藥物干預(yù)治療后，脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者血液中ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)且與非脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者血液中ccin基因或ccin蛋白的表達(dá)水平基本持平，則評價(jià)該脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者的脾氣虧虛證已經(jīng)痊愈，不需繼續(xù)服用藥物，反之，則評價(jià)該患者治療效果不好，需要繼續(xù)服用藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種診斷脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者或者評價(jià)脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者治療效果的分子標(biāo)志物，利用該分子標(biāo)志物對脾氣虧虛型晚期結(jié)腸癌患者進(jìn)行診斷或者評價(jià)其治療效果的方法，是一種無創(chuàng)、快速、高效的方法，利于在臨床上推廣。附圖說明圖1顯示利用基因芯片檢測ccin基因的異常表達(dá)情況的統(tǒng)計(jì)圖；圖2顯示利用qpcr檢測ccin基因的異常表達(dá)情況的統(tǒng)計(jì)圖。具體的實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1ccin基因的差異表達(dá)1、病例收集收集醫(yī)院腫瘤科經(jīng)病理明確診斷的iii-iv期結(jié)直腸癌患者；選擇脾氣虧虛證5例作為實(shí)驗(yàn)組，非脾氣虧虛證5例作為對照組；僅接受純中醫(yī)治療。1.1結(jié)直腸癌的診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司2010年10月編著的《結(jié)直腸癌診療規(guī)范》，2011nccn腫瘤臨床實(shí)踐指南(中國版)第一版tnm分期標(biāo)準(zhǔn)。1.2中醫(yī)癥候的診斷標(biāo)準(zhǔn)脾氣虧虛證：主證：腹部隱痛，大便不暢或雖有便意解之困難，便溏；次證：神疲乏力，食欲不振，食后作脹，面色萎黃，舌淡胖，苔白，脈沉細(xì)。具備主證1項(xiàng)，次證3項(xiàng)可診斷。1.3納入、排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)漢族iii-iv期結(jié)直腸癌患者，有病理診斷，僅接受純中醫(yī)治療；(2)kps評分≥60；(3)年齡18-75歲之間(包含18歲和75歲)；(4)預(yù)計(jì)生存期在3個(gè)月以上；(5)依從性好，簽署知情同意書自愿參與實(shí)驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有嚴(yán)重的或需要治療的心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)疾病；(2)孕婦、哺乳期及精神病患者；(3)有明顯的復(fù)合證患者。2、治療方法脾氣虧虛證5例使用四君子顆粒(吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))進(jìn)行干預(yù)，每次15g，水沖服，3次/d，治療時(shí)間為21d，期間患者不接受其他中醫(yī)藥治療。3、總mrna提取對照患者，療前和治療后患者清晨空腹采集外周靜脈血5ml，以紅細(xì)胞裂解液分離出白細(xì)胞，加入細(xì)胞20倍體積的trizol，用移液器進(jìn)行反復(fù)抽打細(xì)胞直至無成團(tuán)細(xì)胞塊，使之充分溶解于trizol中形成清亮不黏稠的液體，置-80℃冰箱中保存。trizol一步法抽提總mrna?？俶rna純度及完整性分析：采用分光光度計(jì)在260nm和280nm處分別測定吸光度(a)值，a260/a280比值1.8-2.0為較純的mrna；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測：28s條帶亮度約是18s條帶的2倍表明所提取rna完整性較好，可用于芯片檢測。4、agilent表達(dá)譜芯片雜交rna質(zhì)檢合格后，參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行樣本標(biāo)記、芯片雜交以及洗脫。首先，總rna反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cdna，再進(jìn)一步合成以cyanine-3-ctp(cy3)標(biāo)記的crna。將標(biāo)記好的crna和芯片雜交，洗脫后利用agilentscannerg2505c(美國安捷倫科技有限公司)掃描得到原始圖像。5、數(shù)據(jù)處理采用featureextraction軟件(version10.7.1.1，agilenttechnologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用genespring軟件(version12.5：agilenttechnologies)進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，在用于比較的每組樣本中至少有一組100％標(biāo)記為detected的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。利用t檢驗(yàn)得到的差異顯著性p值和標(biāo)準(zhǔn)化信號值的差異倍數(shù)foldchange值進(jìn)行差異基因篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且p<0.05。6、結(jié)果結(jié)果顯示，脾氣虧虛證與對照組相比共篩選出126條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的71條，下調(diào)的55條。經(jīng)四君子顆粒干預(yù)后與干預(yù)前相比，篩選出15條差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)有12條，下調(diào)有3條。其中，ccin基因是差異表達(dá)基因，表達(dá)結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例2差異表達(dá)基因的驗(yàn)證選擇差異表達(dá)的ccin基因進(jìn)行大樣本驗(yàn)證。1、病例收集按照實(shí)施例1的方法收集脾氣虧虛型晚期結(jié)直腸癌患者50例、非脾氣虧虛型晚期結(jié)直腸癌患者50例作為對照。2、治療方法同實(shí)施例1。3、在mrna水平上進(jìn)行驗(yàn)證3.1提取血液總rna步驟同實(shí)施例1。3.2逆轉(zhuǎn)錄用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。3.3qpcr(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)genbank中ccin基因和gapdh基因的編碼序列設(shè)計(jì)qpcr擴(kuò)增引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：ccin基因：正向引物為5’-ttcttcaattacatcaatctca-3’(seqidno.1)；反向引物為5’-atcaggacactctcaatc-3’(seqidno.2),gapdh基因：正向引物為5’-gaaggtgaaggtcggagt-3’(seqidno.3)；反向引物為5’-catgggtggaatcatattggaa-3’(seqidno.4)。(2)按照表1配制pcr反應(yīng)體系：其中，sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購自invitrogen公司。表1pcr反應(yīng)體系試劑體積正向引物1μl反向引物1μlsybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl模板2μl去離子水補(bǔ)足25μl(3)pcr反應(yīng)條件：95℃5min，(95℃10s，60℃40s)*45個(gè)循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對定量。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5、結(jié)果結(jié)果如圖2所示，與非脾氣虧虛型晚期結(jié)直腸癌患者相比，脾氣虧虛型晚期結(jié)直腸癌患者血液中ccin基因的mrna水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。脾氣虧虛型晚期結(jié)直腸癌患者經(jīng)四君子顆粒干預(yù)后與干預(yù)前相比，ccin基因的mrna水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，基本與對照組持平，無顯著差異。上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院；西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院；烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院）<120>一種結(jié)直腸癌診斷和治療效果評價(jià)相關(guān)的基因<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1ttcttcaattacatcaatctca22<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2atcaggacactctcaatc18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3gaaggtgaaggtcggagt18<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4catgggtggaatcatattggaa22當(dāng)前第1頁12