與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼rna clmat1及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA?CLMAT1及其應(yīng)用。所述的長(zhǎng)鏈非編碼RNA?CLMAT1，位于第14號(hào)染色體chr14：101379770-101381326，hg19，基因序列長(zhǎng)度為1557bp。相比正常腸組織，腸癌中CLMAT1高表達(dá)與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，且患者預(yù)后不良，也間接提示患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的可能性較高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA CLMAT1及其應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 用來(lái)診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，可評(píng)估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，并從長(zhǎng)鏈非編碼 RNA的角度揭示結(jié)直腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，尤其在北京、上海等城市，已居消化道腫瘤的第1 位。肝臟是結(jié)直腸癌血行轉(zhuǎn)移最主要的靶器官，也是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的主要因素。15%? 25%的結(jié)直腸癌病人在確診時(shí)即合并肝轉(zhuǎn)移，而另有15%?25%的病人在結(jié)直腸癌原發(fā) 灶根治術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（colorectal liver metastasis,CLM)也是結(jié)直 腸癌患者最主要的死亡原因，肝轉(zhuǎn)移灶未經(jīng)治療的病人其中位生存期僅6. 9個(gè)月，無(wú)法切 除病人的5年存活率接近0%。目前認(rèn)為根治性手術(shù)切除是CLM患者獲得治愈的有效手段， 但臨床實(shí)際中，絕大多數(shù)（80%?90% )的患者肝轉(zhuǎn)移灶因未能早期發(fā)現(xiàn)而失去根治性手 術(shù)切除的機(jī)會(huì)。因此，早期預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，并給予積極的綜合治療，可提高結(jié)直腸癌患者 的生存時(shí)間和生存質(zhì)量。
[0003] 在目前工作中，我們?nèi)跃窒抻谕ㄟ^(guò)血清學(xué)檢測(cè)（如CEA、CA199等）或影像學(xué)檢查 (如B超、CT和MRI)去發(fā)現(xiàn)CLM，前者敏感性和特異性不高，而后者只能檢測(cè)出直徑lcm以 上病灶，無(wú)法做到早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)測(cè)。課題組前期曾對(duì)收治在本單位的1613例CLM病人進(jìn)行 回顧性臨床病理分析，發(fā)現(xiàn)部分結(jié)直腸癌患者即使原發(fā)灶無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至腫瘤僅僅侵 犯黏膜下層或肌層卻也發(fā)生肝轉(zhuǎn)移?？梢?jiàn)從微觀角度去深入了解CLM發(fā)生機(jī)制并獲得其早 期診斷標(biāo)志物是十分必要的，這需要從基因組或轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方面針對(duì)CLM開(kāi)展基礎(chǔ)研究。
[0004] 人類(lèi)基因組測(cè)序完成后的分析結(jié)果表明，人類(lèi)基因組中能編碼蛋白的DNA只占整 個(gè)基因組的3?5%，眾多DNA僅僅轉(zhuǎn)錄成RNA，而不編碼蛋白質(zhì)，都屬于非編碼RNA，它們 的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于編碼蛋白質(zhì)的mRNA。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷更新日益彰顯出非編 碼RNA并不是所謂的"轉(zhuǎn)錄噪音"，它們?cè)诨蜣D(zhuǎn)錄后調(diào)控、剪切和修飾具有十分重要的功 能，與疾病各方面有密切的關(guān)系。目前針對(duì)非編碼RNA的研究已成為分子生物學(xué)最熱門(mén)的 前沿研究領(lǐng)域之一，并取得了一定成果，但大部分研究都集中在小RNA(如miRNA)，而忽視 了另外一類(lèi)數(shù)量更多（被轉(zhuǎn)錄最多）且序列比較長(zhǎng)的非編碼RNA，即長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, IncRNA)〇
[0005] LncRNA作為一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度在200nt?lOOkb之間的RNA，其本身并不編碼蛋白， 而是以RNA的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平。相對(duì)于蛋白編碼序列以及小分子 RNA，IncRNA的研究雖還僅僅處于起步階段，但其已展現(xiàn)出繁多的分子生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄模式，調(diào)控蛋白活性，改變RNA的剪切模式等等。2011年《Nature》《Cell》等雜志均多 篇幅報(bào)道了 IncRNA研究的必要性及重要意義，癌癥遺傳學(xué)家Pandolfi在針對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 機(jī)制所提出的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA假說(shuō)中，也認(rèn)為IncRNA是揭開(kāi)RNA "語(yǔ)言"秘密的關(guān)鍵一員。 可見(jiàn)，IncRNA為人們提供了一個(gè)從未涉足的調(diào)控領(lǐng)域，也預(yù)示其在不同的組織細(xì)胞中可能 有不同的表達(dá)譜，并且這種表達(dá)譜差異可能與許多生物學(xué)過(guò)程有密切聯(lián)系。
[0006] 眾多研究證實(shí)，IncRNA在乳腺癌、肝癌、肺癌等腫瘤組織或細(xì)胞中存在異常表達(dá)， 且與患者預(yù)后相關(guān)。腫瘤中IncRNA表達(dá)水平的變化甚至能夠作為腫瘤診斷的標(biāo)記，如 lncRNA-DD3在大約90%的前列腺癌病例中存在高表達(dá)，從而被作為特異性標(biāo)記用于臨床 診斷；lncRNA-MALATl與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移密切關(guān)聯(lián)也使其成為肺癌患者診斷的標(biāo)志。最 近新報(bào)道的IncRNA，如SChLAPl、AK050349及AFAP1-AS1分別在前列腺癌、肝癌及食道鱗癌 轉(zhuǎn)移中起到一定作用，進(jìn)一步預(yù)示了 IncRNA與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。就腸癌尤其CLM來(lái) 說(shuō)，已有零星文獻(xiàn)證實(shí)lncRNA-H19、HULC、H0TAIR、CCATl等與CLM存在關(guān)聯(lián)，如IncRNA-HULC 被發(fā)現(xiàn)在腸癌肝轉(zhuǎn)移灶上存在高表達(dá)，且可從外周循環(huán)中測(cè)得該IncRNA的表達(dá)。然而迄今 為止，IncRNA與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)報(bào)道仍停留在單個(gè)IncRNA表達(dá)驗(yàn)證的水平上，尚無(wú)文 獻(xiàn)直接針對(duì)CLM相關(guān)IncRNA表達(dá)譜及其功能等系統(tǒng)研究進(jìn)行報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是利用高通量IncRNA芯片技術(shù)首先在不同肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織 及正常腸組織進(jìn)行IncRNA表達(dá)譜的系統(tǒng)篩查，接著通過(guò)逐步擴(kuò)大臨床樣本驗(yàn)證，確定可能 與CLM相關(guān)的目標(biāo)IncRNA。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)目標(biāo)IncRNA結(jié)合臨床病理資料分析，并進(jìn)行 細(xì)胞體外功能實(shí)驗(yàn)、裸鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及初步機(jī)制研究，以揭示目標(biāo)IncRNA對(duì)腸癌轉(zhuǎn)移的 影響與潛在的調(diào)控途徑。本發(fā)明可為CLM早期診斷提供新的線(xiàn)索，并有助于豐富CLM發(fā)生 的分子機(jī)制。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA CLMATl(lncRNA-CLMATl)， 位于第14號(hào)染色體chrl4 :101379770-101381326, hgl9,基因序列長(zhǎng)度為1557bp。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述的長(zhǎng)鏈非編碼RNA CLMAT1在制備預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后、肝 轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的試劑、試劑盒或基因芯片中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后、肝轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的定量PCR 檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括用于檢測(cè)上述的長(zhǎng)鏈非編碼RNA CLMAT1的正向引物： TACACTGACCCCACAGCCTATG 和反向引物：CATTTCCCAAGCAGGTTTCC。
[0011] 本發(fā)明利用IncRNA芯片分別在無(wú)肝轉(zhuǎn)移、異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移、同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移的腸癌組 織及正常腸黏膜組織上進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)1332個(gè)CLM差異表達(dá)IncRNA。結(jié)合生物信息學(xué)分 析，從中選擇40個(gè)可能與CLM相關(guān)的IncRNA,經(jīng)擴(kuò)大臨床病例樣本驗(yàn)證，最終確定3個(gè)在 CLM中差異表達(dá)顯著且目前尚未報(bào)道的目標(biāo)IncRNA，并命名為IncRNA-CLMATl?3。結(jié)合 臨床資料分析，其中l(wèi)ncRNA-CLMATl高表達(dá)與腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著相 關(guān)（P < 0. 05);且CLMAT1低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于高表達(dá)組患者（33. 7個(gè) 月vs. 30. 1個(gè)月，P = 0. 04)。提示IncRNA-CLMATl可能與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)，其 商表達(dá)與預(yù)后不佳相關(guān)。
[0012] 本發(fā)明的原理是：
[0013] 結(jié)直腸癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的最大問(wèn)題就 是腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中最常見(jiàn)的就是肝轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)研究結(jié)直腸癌時(shí)，往往根據(jù)?m分期， 籠統(tǒng)地將結(jié)直腸癌歸為非轉(zhuǎn)移性、局部轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而未將遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)化 為肝轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移等；即使對(duì)于CLM，也往往未能根據(jù)肝轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)期、肝轉(zhuǎn)移有無(wú)伴隨 肝外轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移灶是否已獲得根治性切除等情況而區(qū)別對(duì)待；而CLM不同亞類(lèi)別的臨 床診治及生存預(yù)后差異迥異，異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者生存率好于同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移。本發(fā)明充分利 用課題組前期建立的CLM完備的臨床資料和組織標(biāo)本庫(kù)，針對(duì)上述現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，重點(diǎn)關(guān)注所 有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌：將篩選的病例分為局部轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌與單純肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌，并將 后者細(xì)分為同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移與異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移，從而為進(jìn)一步在結(jié)直腸癌臨床樣本中驗(yàn)證目標(biāo) IncRNA的可信性提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[0014] 近年來(lái)隨著研究的不斷深入，愈來(lái)愈多的新IncRNA被發(fā)現(xiàn)，但多存在零散報(bào)道， 一直缺乏在生物信息學(xué)方面對(duì)IncRNA進(jìn)行系統(tǒng)描述。本發(fā)明直接關(guān)注在不同肝轉(zhuǎn)移情況 的腸癌組織上呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的IncRNA，并通過(guò)擴(kuò)大臨床樣本檢測(cè)進(jìn)一步分析其臨床意義， 從而確定可能在CLM中發(fā)揮功能的IncRNA。
[0015] 針對(duì) lncRNA-CLMATl 序列，本發(fā)明的發(fā)明人查閱 UCSC(http ：//www. genome, ucsc. edu/) hgl9 數(shù)據(jù)庫(kù)與 NCBI (http ：//www. ncbi. nlm. nih. gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)，均發(fā)現(xiàn)在其上游 6. 4kb 存在 lncRNA_MEG8。而 Ensemble (http ：//www. ensembl. org/index. html)GRCh37 數(shù) 據(jù)庫(kù)顯示CLMAT1與MEG8基因的剪切異構(gòu)體（ENST00000553421，即MEG8-006)的轉(zhuǎn)錄本序 列位置存在一致，且與MEG8的其他剪切體即MEG8-001及MEG8-005存在部分重疊。設(shè)計(jì)特 異性引物作定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明CLMAT1與MEG8-002或MEG8-005轉(zhuǎn)錄本在腸癌組織上 表達(dá)未見(jiàn)相關(guān)性?？紤]到lncRNA-MEG8雖是已知的IncRNA(又稱(chēng)Rian或Irm)，在胚胎及骨 骼肌上高表達(dá)，但具體功能仍未知，在腫瘤方面迄今也未見(jiàn)正式報(bào)道，而lncRNA-CLMATl在 本發(fā)明中提示與CLM相關(guān)，故值得深入探索。更不能忽視的是，在lncRNA-CLMATl上游鄰近 所存在的lncRNA-MEG3已被公認(rèn)與結(jié)腸癌、腦膜瘤、鼻咽癌、膀胱癌等腫瘤密切相關(guān)，因此 綜上，在后期研究中，重點(diǎn)關(guān)注其在腫瘤中尤其是CLM中可能發(fā)揮的作用及潛在機(jī)制而不 糾結(jié)于CLMAT1是否是MEG8的剪切異構(gòu)體。
[0016] 已知局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率密切相關(guān)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)相比淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移陰性組，lncRNA-CLMATl高表達(dá)的病例更多地分布在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組中，預(yù)示著 CLMAT1可能在腸癌發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起到一定促進(jìn)作用。臨床上，同時(shí)性CLM患者總 體預(yù)后較異時(shí)性CLMA患者差，而后者預(yù)后又較無(wú) CLM患者差，在初步臨床樣本驗(yàn)證中（每 組10例），CLMAT1表達(dá)情況在異時(shí)性與無(wú)肝轉(zhuǎn)移中無(wú)顯著差異，可能與異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組病 例太少有關(guān)；而同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組中CLMAT1顯著較無(wú)肝轉(zhuǎn)移組腸癌組織高表達(dá)，這在連續(xù) 90例結(jié)直腸癌中獲得進(jìn)一步證實(shí)（有肝轉(zhuǎn)移組CLMAT1表達(dá)仍顯著高于非肝轉(zhuǎn)移組），提示 CLMAT1可能在CLM發(fā)生進(jìn)展中起到促進(jìn)作用。
[0017] 使用時(shí)，可以使用常規(guī)定量PCR方法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織樣本與配對(duì)正常腸組織的 lncRNA-CLMATl的相對(duì)表達(dá)差異。相比正常腸組織，腸癌中CLMAT1高表達(dá)與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn) 移成正相關(guān)，且患者預(yù)后不良，也間接提示患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的可能性較高。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0019] 本發(fā)明首次在不同肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中進(jìn)行長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)表達(dá) 譜的系統(tǒng)篩查、分析，獲得了 1332個(gè)腸癌肝轉(zhuǎn)移差異表達(dá)的IncRNAs。首次發(fā)現(xiàn)與腸癌肝轉(zhuǎn) 移相關(guān)的IncRNA，即CLMAT1。本發(fā)明在一系列基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)際臨 床的中，存在一定開(kāi)發(fā)價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1-1 :目標(biāo)IncRNA的篩選流程圖。CLM為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移；NLM為無(wú)肝轉(zhuǎn)移；MLM 為異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移；SLM為同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移。
[0021] 圖1-2 :同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組腸癌原發(fā)灶與配對(duì)正常腸組織的六對(duì)組織樣本RNA提取 的質(zhì)控結(jié)果。A為RNA的濃度、純度表格；B，C為RNA電泳圖。
[0022] 圖1-3 :HTA芯片外觀圖。A為本發(fā)明所用的部分ΗΤΑ芯片外觀圖；B為ΗΤΑ芯片篩 查后產(chǎn)生的掃描圖。
[0023] 圖1-4 :芯片篩查產(chǎn)生的部分聚類(lèi)熱圖。Α為同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移腸癌組與無(wú)肝轉(zhuǎn)移腸癌 組比較的聚類(lèi)圖；B為異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移腸癌組與無(wú)肝轉(zhuǎn)移腸癌組比較的聚類(lèi)圖。圖1-5 :探針 號(hào)為T(mén)R140014124的IncRNA在癌與配對(duì)正常腸組織中及不同肝轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)差異。A為 IncRNA在同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組內(nèi)癌與配對(duì)正常腸組織上定量PCR的表達(dá)差異箱式圖，tumor代 表腸癌，normal代表配對(duì)的正常腸組織。B為IncRNA在不同肝轉(zhuǎn)移組間的腸癌與配對(duì)正常 腸組織表達(dá)差異值的比較，SLM代表同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移，MLM代表異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移，NLM代表無(wú)肝轉(zhuǎn) 移組。
[0024] 圖1-6 :lncRNA-CLMATl在90例獨(dú)立的連續(xù)結(jié)直腸癌臨床樣本中的表達(dá)分析。A為 CLMAT1在癌與配對(duì)正常腸組織上的表達(dá)差異。B為原發(fā)灶侵犯黏膜層或肌層（T1?2)與侵 犯漿膜層或穿透漿膜層（T3?4)的病例之間CLMAT1表達(dá)的差異。C為原發(fā)灶腸癌局部淋 巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移之間CLMAT1表達(dá)的差異。D為CLMAT1在有肝轉(zhuǎn)移組（with LM)與非肝轉(zhuǎn)移 組（without LM)之間的差異表達(dá)。LM表示肝轉(zhuǎn)移；林表示P < 0. 01 表示P < 0. 0 5。
[0025] 圖1-7 :90例結(jié)直腸癌病例的生存分析結(jié)果。A為CLMAT1高表達(dá)組與低表達(dá)組的 生存分析圖；B為肝轉(zhuǎn)移組與非肝轉(zhuǎn)移組的生存分析圖。HR(hazard ratios)表示危險(xiǎn)比； 95% CI表不95%可信區(qū)間；LM(liver metastasis)表不肝轉(zhuǎn)移。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以?xún)?yōu)選實(shí)施例，并配合附圖作詳細(xì)說(shuō)明如下。
[0027] 本發(fā)明中采用的臨床標(biāo)本滿(mǎn)足以下條件：
[0028] 本發(fā)明所用結(jié)直腸癌組織標(biāo)本均來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腸癌課題組在前期 建立的結(jié)直腸癌及CLM組織標(biāo)本庫(kù)。所有人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本的取材與研究均獲得院醫(yī)學(xué) 倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且患者均已簽署知情同意書(shū)。取材每例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本的癌組織和 癌遠(yuǎn)端正常黏膜（距結(jié)直腸癌病灶> l〇cm)。取材的新鮮標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗3次，并盡量 剔除壞死組織、結(jié)締組織及脂肪組織。
[0029] 納入本研究的標(biāo)準(zhǔn)：
[0030] ?年齡18-75歲之間
[0031] ?所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療、靶向治療及放療處理；
[0032] ?術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)直腸腺癌；且配對(duì)的正常腸組織經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌殘留；
[0033] 令病例有完整的隨訪(fǎng)復(fù)查資料；
[0034] ?患者術(shù)后均接受放化療等正規(guī)治療；
[0035] ?標(biāo)本RNA質(zhì)控合格；
[0036] 排除標(biāo)準(zhǔn)：
[0037] ?家族性腺瘤性息肉及其他結(jié)腸疾病，例如潰蕩性結(jié)腸炎、結(jié)腸結(jié)核、克隆病等病 例
[0038] ?患有身體其他部位惡性腫瘤的病例（結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移除外）；
[0039] ?有身體免疫缺陷疾??；
[0040] ?術(shù)后3個(gè)月內(nèi)因局部腫瘤殘留（術(shù)后3個(gè)月內(nèi)的復(fù)發(fā)視為殘留）或并發(fā)癥死亡 者；
[0041] 本發(fā)明中采用的芯片情況：
[0042] Glue Grant Human Transcriptome Array 是 Affymetrix 公司的芯片產(chǎn)品，簡(jiǎn)稱(chēng) GGHTA芯片。GGHTA芯片探針總數(shù)達(dá)6892960個(gè)，平均每個(gè)外顯子由10個(gè)探針覆蓋，平均每 個(gè)基因大約有119個(gè)探針覆蓋，故芯片數(shù)據(jù)相對(duì)更可靠。其中非編碼RNA :563097個(gè)探針，覆 蓋50783個(gè)RNA，包括約4408個(gè)IncRNA。IncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源廣泛，包括SILVArRNA數(shù)據(jù)庫(kù)； genomic tRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)；snoRNAbase ;Signal Recognition Particle Database ；Noncoding regulatory RNA 數(shù)據(jù)庫(kù)；RNAdb ;N0NC0DE ;fRNAdb ;H_Invitational 數(shù)據(jù)庫(kù)；NATsDB 等。
[0043] 本發(fā)明的篩選流程見(jiàn)圖1-1，首先選擇不同肝轉(zhuǎn)移情況的腸癌組織及正常腸組織 (Cohortl)進(jìn)行IncRNA芯片篩查，獲得CLM差異性IncRNA表達(dá)譜。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析并 結(jié)合臨床，從中篩選差異顯著的IncRNA在另外獨(dú)立的不同肝轉(zhuǎn)移腸癌組織及配對(duì)正常腸 組織中（Cohort2)做定量PCR驗(yàn)證，以獲得CLM相關(guān)IncRNA。再?gòu)闹羞x擇1?2個(gè)與芯片結(jié) 果符合且差異最顯著的IncRNA，在另一組獨(dú)立的連續(xù)90例結(jié)直腸癌患者組織中（Cohort3) 進(jìn)一步定量PCR檢測(cè)，在明確目標(biāo)IncRNA的同時(shí)，分析其臨床意義。
[0044] 附：不同肝轉(zhuǎn)移情況的腸癌分組：
[0045] ?結(jié)直腸癌無(wú)肝轉(zhuǎn)移組（NLM):原發(fā)結(jié)直腸癌患者；術(shù)前影像學(xué)檢查（B超、腹部 CT等）和術(shù)中探查無(wú)肝轉(zhuǎn)移；結(jié)直腸癌根治術(shù)后隨訪(fǎng)至少3年，影像學(xué)檢查無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。
[0046] ?結(jié)直腸癌同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組（SLM):原發(fā)結(jié)直腸癌患者；術(shù)前影像學(xué)檢查或術(shù)中 探查發(fā)現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，或結(jié)直腸癌根治術(shù)后6個(gè)月內(nèi)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。
[0047] ?結(jié)直腸癌異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組（MLM):原發(fā)結(jié)直腸癌患者；術(shù)前影像學(xué)檢查和術(shù)中 探查無(wú)肝轉(zhuǎn)移；結(jié)直腸癌根治術(shù)后6個(gè)月后影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。
[0048] 本發(fā)明的具體步驟如下：
[0049] 第一步、目標(biāo) IncRNA 的發(fā)現(xiàn)（Discovery phase)
[0050] 1、病例選擇
[0051] 用于芯片篩查的4組病例樣本分別為無(wú)肝轉(zhuǎn)移組的腸癌組織、異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組的 腸癌組織、同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組的腸癌組織及配對(duì)的正常腸組織（考慮另外2組病例在獲取腸 癌組織時(shí)均未伴肝轉(zhuǎn)移），每組樣本均為6例，嚴(yán)格按照病例入選及排除標(biāo)準(zhǔn)。
[0052] 局部轉(zhuǎn)移的腸癌易出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，且淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移決定了患者術(shù)后是否需要進(jìn)一 步輔助化療等。為了避免因原發(fā)灶分期不同或術(shù)后治療方案存在差異而導(dǎo)致患者生存分析 存在偏差，上述病例的腸癌原發(fā)灶均經(jīng)過(guò)病理分析證實(shí)存在局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以最終保證 腸癌原發(fā)灶樣本基礎(chǔ)病理特征一致。
[0053] 用于芯片篩選的3組病例基本情況（表1-2)
[0054] 表1-2 :用于IncRNA芯片篩查的3組病例基本情況
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種長(zhǎng)鏈非編碼 RNA CLMAT1，位于第 14 號(hào)染色體 chrl4 :101379770-101381326, hgl9,基因序列長(zhǎng)度為1557bp。
2. 權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)鏈非編碼RNA CLMAT1在制備預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后、肝轉(zhuǎn)移或 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的試劑、試劑盒或基因芯片中的應(yīng)用。
3. -種預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后、肝轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的定量PCR檢測(cè)試劑盒， 其特征在于，包括用于檢測(cè)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)鏈非編碼RNA CLMAT1的正向引物： TACACTGACCCCACAGCCTATG 和反向引物：CATTTCCCAAGCAGGTTTCC。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104140967SQ201410261644
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】許劍民, 葉樂(lè)馳, 韋燁, 任黎, 鐘蕓詩(shī), 朱德祥, 常文舉, 林奇 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院