一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法。本發(fā)明使用生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)工藝代替現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原，該方法可以大量降低生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)量，相比轉(zhuǎn)瓶工藝單位抗原成本降低80％～90％，生產(chǎn)周期減少7天，產(chǎn)量提高3～10倍；因?yàn)槠淇梢远啻问斋@抗原，因而較傳統(tǒng)反應(yīng)器培養(yǎng)工藝單位抗原成本降低40％～50％，產(chǎn)量提高3～5倍，此發(fā)明生產(chǎn)的抗原無(wú)血清殘留，生產(chǎn)的疫苗安全性更高，同時(shí)制品的批間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定易于控制，可明顯提高制品的產(chǎn)量及質(zhì)量。
【專利說明】一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型疫苗抗原的方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)疫苗抗原生產(chǎn)主要采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，少數(shù)采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)半成品抗原病毒含量較低，僅為104_5~6 °TCID50/ml，不能提供 穩(wěn)定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量應(yīng)≥105_ 5TCID50)，需要進(jìn)行高倍濃縮。且轉(zhuǎn)瓶工藝勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)一批需要100~200個(gè)轉(zhuǎn)瓶，需多人同時(shí)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的消化傳代操作，增加污染風(fēng)險(xiǎn)；生產(chǎn)周期長(zhǎng)，需要10天；效率較低，每次培養(yǎng)只能收獲一次；培養(yǎng)基中含有一定濃度的牛血清，抗原雜蛋白比較多，易造成應(yīng)激反應(yīng)；生產(chǎn)成本較高，人工、場(chǎng)地及原料費(fèi)用大；對(duì)環(huán)境要求較高，需要較大的場(chǎng)地和GMP廠房；不同生產(chǎn)批次及同一生產(chǎn)批次的轉(zhuǎn)瓶之間存在較大差異，容易造成批內(nèi)及批間的抗原質(zhì)量差異，進(jìn)而影響疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)瓶清洗需要大量水，并且產(chǎn)生的含毒廢水需要專門處理，容易對(duì)環(huán)境造成污染，如處理不當(dāng)會(huì)造成生物安全和公共衛(wèi)生問題。而普通細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)工藝，較轉(zhuǎn)瓶工藝雖有提高，但仍存在較大改進(jìn)空間，傳統(tǒng)微載體懸浮培養(yǎng)工藝，其生產(chǎn)周期仍需6~7天，且每次培養(yǎng)只能收獲I次；仍依靠轉(zhuǎn)瓶提供帶毒細(xì)胞，無(wú)法避免轉(zhuǎn)瓶清洗產(chǎn)生的帶毒廢水，另傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝及傳統(tǒng)反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)工藝，其生產(chǎn)的抗原中存在較高含量的血清，所產(chǎn)疫苗，會(huì)使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法及傳統(tǒng)細(xì)胞懸浮微載體培養(yǎng)法的不足之處，提供一種應(yīng)用反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型疫苗抗原的方法。該方法可以大量降低生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)量，相比轉(zhuǎn)瓶工藝單位抗原成本降低80%~90%，生產(chǎn)周期減少7天，產(chǎn)量提高3~10倍；較傳統(tǒng)反應(yīng)器培養(yǎng)工藝單位抗原成本降低40%~50%，產(chǎn)量提高3~5倍，因?yàn)槠淇梢允斋@抗原多次。且該工藝占地小，可迅速進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，對(duì)環(huán)境要求較低，自動(dòng)化程度高，人工成本少，生產(chǎn)批間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定易于控制，可明顯提高產(chǎn)品的產(chǎn)量及質(zhì)量。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述指標(biāo)，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案:
[0005]一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，該方法包括如下步驟:
[0006](I)種子細(xì)胞的制備將無(wú)菌生理鹽水預(yù)熱處理，使用預(yù)熱后的生理鹽水洗滌長(zhǎng)滿單層的健康克隆細(xì)胞PK-15W作為種細(xì)胞，加入20~40ml胰酶進(jìn)行消化，消化期間，時(shí)刻觀察細(xì)胞層變化，待細(xì)胞層呈白色霧狀并部分脫落時(shí)，加入含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的有血清低糖DMEM的細(xì)胞生長(zhǎng)液，種子細(xì)胞終止消化，迅速搖動(dòng)轉(zhuǎn)瓶，使壁上細(xì)胞脫落，反復(fù)吹打分散細(xì)胞后，按照1:3至1:5的傳代比例分瓶；
[0007](2)制苗細(xì)胞的制備根據(jù)最終培養(yǎng)體積稱取Cytodex-1微載體，使其終濃度為5~10g/L，用PBS進(jìn)行浸泡清洗，滅菌后，在攪拌式生物反應(yīng)器中使用細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行平衡，備用；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的種子細(xì)胞接種生物反應(yīng)器，接種密度為I~5X105個(gè)/ml ;
[0008](3)接毒隨后，以最終培養(yǎng)體積的3%~8%接種PCV2種毒；接種后，設(shè)定反應(yīng)器控制條件為:ΡΗ7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為80~120r/min ；
[0009](4)病毒的收獲和含量測(cè)定待細(xì)胞在前述條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)液中培養(yǎng)48~72h后靜置，排出上清，加入含有伴刀豆球蛋白A和水解酪蛋白的無(wú)血清低糖DMEM細(xì)胞維持液，調(diào)整反應(yīng)器控制條件為:pH7.0~7.4，DO為20 %~80 %，攪拌速度為100r/min~180r/min，繼續(xù)維持48~72h后靜置,進(jìn)行第一次上清收獲，觀察細(xì)胞狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)良好則補(bǔ)加與收獲上清等量的新鮮細(xì)胞維持液，在PH7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為IOOr/min~180r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h后靜置，進(jìn)行第二次上清收獲，重復(fù)此過程直至微載體上的細(xì)胞全部脫落，結(jié)束整個(gè)培養(yǎng)過程，收獲上清后，將微載體進(jìn)行回收處理，并將收獲的抗原反復(fù)凍融3次后作為半成品，進(jìn)行病毒含量測(cè)定。
[0010](5)用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗。
[0011](6)用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗的方法，包括:將PCV2株在PK-15W細(xì)胞中大量增殖，經(jīng)甲醛滅活后加入常用佐劑進(jìn)行乳化，制備常規(guī)的佐劑疫苗。
【具體實(shí)施方式】
[0012]采用生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)設(shè)備、微載體作為支持細(xì)胞生長(zhǎng)的載體、克隆細(xì)胞PK-15W(原名PK-15B1，CCTCC N0.C200936)作為制苗細(xì)胞、PCV2作為制苗種毒；采用含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的低糖DMEM作為制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液；采用含有伴刀豆球蛋白A和水解酪蛋白的無(wú)血清低糖DMEM作為制苗細(xì)胞維持液；并包括如下步驟:
[0013](I)種子細(xì)胞培養(yǎng)
[0014]利用預(yù)熱的無(wú)菌生理鹽水將長(zhǎng)滿的種子細(xì)胞單層洗滌一次，加入20~40ml胰酶消化液消化，不斷轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)瓶直至細(xì)胞全部脫落，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液終止消化，混勻，按照1:3至1:5的傳代比例分瓶；
[0015](2)種子細(xì)胞制備接毒
[0016]I)生物反應(yīng)器的準(zhǔn)備根據(jù)培養(yǎng)的體積選擇合適的生物反應(yīng)器，連接好各種管道、補(bǔ)料和輔助罐，換液接口，接上溫度、pH、DO電極，進(jìn)行電極的校正；
[0017]2)微載體的準(zhǔn)備根據(jù)培養(yǎng)的體積和微載體濃度稱取Cytodex-1微載體于已娃化處理的玻璃瓶中，加入40~50倍微載體質(zhì)量的PBS緩沖液浸泡lh，此后更換新鮮的PBS緩沖液繼續(xù)浸泡過夜；更換30倍體積的PBS緩沖液于玻璃瓶或生物反應(yīng)器中準(zhǔn)備滅菌；
[0018]3)滅菌滅菌前認(rèn)真檢查各管道和接頭確保連接完好后進(jìn)行氣密性測(cè)試，測(cè)試合格后方可準(zhǔn)備進(jìn)行滅菌；根據(jù)生物反應(yīng)器的規(guī)模，IOL以下離線滅菌，在高壓鍋中121°C高壓30min，滅菌結(jié)束后自然冷卻；10L以上的反應(yīng)器采用在位滅菌的方式。
[0019]4)制苗細(xì)胞培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中將Cytodex-1微載體的濃度設(shè)定為5~10g/L，并使用制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行平衡備用；挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的種子細(xì)胞接種生物反應(yīng)器，接種密度為I~5X105個(gè)/ml，37°C培養(yǎng)(見圖2中的圖A)。
[0020](3)接毒
[0021] 約在細(xì)胞接入反應(yīng)罐培養(yǎng)8~10小時(shí)，取樣鏡檢可見接入細(xì)胞全部貼在微載體上時(shí)(見圖2中的圖B)，按照細(xì)胞培養(yǎng)液體積的3%~5%接種接入豬圓環(huán)病毒2型種毒；接種后采用制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液在37°C、pH 7.0~7.4、D02 0%~80%、攪拌轉(zhuǎn)速80~120r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
[0022](4)病毒的收獲和含量測(cè)定
[0023]待細(xì)胞在前述制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液，pH 7.0~7.4，DO 20 %~80 %，攪拌轉(zhuǎn)速80~120r/min的條件下培養(yǎng)48~72h(見圖2中圖C和圖D)后，靜置，放出上清，更換制苗細(xì)胞維持液，在pH 7.0~7.4，DO 50%~70%，攪拌轉(zhuǎn)速100~180r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，靜置后，放出上清收獲，觀察若細(xì)胞大部分已脫落則連同微載體一起全部收獲，若細(xì)胞狀態(tài)良好則繼續(xù)收獲上清，并再次加入制苗細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)48~72h后靜置，吸出上清收獲，重復(fù)此過程直至大部分細(xì)胞從微載體上脫落，將收獲的抗原反復(fù)凍融2~3次后作為半成品，進(jìn)行病毒含量測(cè)定。
[0024]病毒含量測(cè)定采用IFA測(cè)定法，即將PCV2病毒液作KT1到10_8倍比稀釋后用維持液分別接種于長(zhǎng)滿單層的PK15-W細(xì)胞，每個(gè)稀釋度4個(gè)孔，每孔0.2ml,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，37°C含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)48h后，無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，用間接免疫熒光(IFA)測(cè)定每個(gè)稀釋度含有PCV2陽(yáng)性細(xì)胞(呈綠色熒光)的孔數(shù)，按Karber氏法計(jì)算病毒的TCID50。
[0025]用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗
[0026]用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原制備疫苗的方法，包括:將PCV2株在PK-15W細(xì)胞中大量增殖，經(jīng)甲醛滅活加入佐劑進(jìn)行乳化，制備佐劑滅活疫苗。
[0027]以上所述的生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度參數(shù)，適用于微載體培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，容積為2L~1000L ;所述的微載體為Cytodex-1，微載體的使用濃度為5~10g/L，培養(yǎng)溫度30~38°C、pH7.0~7.4、溶氧20%~80%、攪拌速度80~180r/min，微載體生物反應(yīng)器在使用前需要進(jìn)行電極校正，準(zhǔn)備，滅菌。
[0028]本發(fā)明所述種子細(xì)胞生長(zhǎng)液的成份(V/V)為:低糖DMEM (AXF4246IDCHYCL0NE) 89 %~94 %，初生牛血清(NBCS，130502浙江天杭生物科技有限公司)5 %~10 %，雙抗1%。
[0029]本發(fā)明所述胰酶消化液中胰酶的濃度0.25%，EDTA的濃度0.02%。
[0030]本發(fā)明所述制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液的成份(V/V)為:低糖DMEM85%~92%，NBCS5%~10%，雙抗1%，0-氨基葡萄糖(C4875 SIGMA)0.5%~2%，伴刀豆球蛋白A(C5275SIGMA)0.5%~2%。
[0031]本發(fā)明所述制苗細(xì)胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM95%~98%，伴刀豆球蛋白 A0.5 % ~2 %，水解酪蛋白(BCBL0573V 瑞士 FLUKA) 0.5 % ~2 %，雙抗 I %。
[0032]本發(fā)明所述雙抗為含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的鏈霉素溶液。
[0033]本發(fā)明所述生理鹽水的成份與含量為=NaCl 0.9g/L，pH為7.0~7.4
[0034]本發(fā)明所述PBS緩沖液的成份與含量為:NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L ；KH2PO40.24g/L ；Na2HPO4.12H20 3.65g/L, pH 為 7.2 ~7.4。
[0035]本發(fā)明中所用生物材料和試劑除已注明來(lái)源外，其他均商品化的產(chǎn)品，購(gòu)自國(guó)內(nèi)試劑商店。
[0036]本發(fā)明的有益效果
[0037] 本發(fā)明涉及一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法。本發(fā)明使用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝代替現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原，該方法可以大量降低生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)量，相比轉(zhuǎn)瓶工藝單位抗原成本降低80%~90%，生產(chǎn)周期減少7天，產(chǎn)量提高3~10倍；因?yàn)槠淇梢远啻问斋@抗原，因而較傳統(tǒng)反應(yīng)器培養(yǎng)工藝單位抗原成本降低40%~50%，產(chǎn)量提高3~5倍，其制品的批間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定易于控制，可明顯提高制品的產(chǎn)量及質(zhì)量。
[0038](I)本發(fā)明用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝代替現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原，可解決生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒含量低、降低成本、減少成品苗應(yīng)激反應(yīng)的問題，通過生產(chǎn)技術(shù)和工藝的改變，全面提升疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量，提高疫苗的安全性。
[0039](2)本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，較轉(zhuǎn)瓶工藝自動(dòng)化水平高，降低人工成本，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便易擴(kuò)大，較傳統(tǒng)生物反應(yīng)器工藝，減少細(xì)胞傳代次數(shù)，降低胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷，無(wú)血清培養(yǎng)，提高病毒收獲次數(shù)，并在制苗細(xì)胞維持液中添加伴刀豆球蛋白A，提高了病毒含量，進(jìn)而提高了抗原的產(chǎn)量及滴度，進(jìn)一步降低制苗成本。
[0040](3)本發(fā)明的產(chǎn)品病毒含量比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法提高10~30倍，病毒含量可以穩(wěn)定在IO6 5~7_°TCID5(l/ml之間；抗原質(zhì)量穩(wěn)定，每罐收獲的病毒抗原均一，易于規(guī)?；a(chǎn)，且整個(gè)生產(chǎn)工藝過程帶毒部分均完全在密閉的罐體和管道中進(jìn)行，為不開放狀態(tài)，不涉及傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝及傳統(tǒng)反應(yīng)器生產(chǎn)工藝所存在的其他生物安全和公共衛(wèi)生問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1:本發(fā)明的制 備工藝流程圖
[0042]圖2:制苗細(xì)胞接入反應(yīng)罐后生長(zhǎng)情況圖中A圖是剛把細(xì)胞接入培養(yǎng)罐中細(xì)胞懸浮在微載體間的培養(yǎng)液中；圖8培養(yǎng)了 8-10h后細(xì)胞已在載體上貼壁，溶液中沒有游離細(xì)胞；圖C細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)的狀態(tài)；圖D72小時(shí)已有少量細(xì)胞從載體上脫落，此時(shí)換液。
[0043]實(shí)施例
[0044]以下實(shí)施例為進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述，但這些實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
[0045]實(shí)施例1
[0046]—種大規(guī)模高密度生產(chǎn)PCV2抗原的方法，包括如下步驟:
[0047](I)種子細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶上的培養(yǎng)
[0048]利用預(yù)熱的無(wú)菌生理鹽水將長(zhǎng)滿單層的克隆細(xì)胞PK_15W(原名PK-15B1，CCTCCN0.C200936,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授提供)種子細(xì)胞洗滌一次，加入30ml胰酶消化液消化，不斷轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)瓶直至細(xì)胞全部脫落，加入種子細(xì)胞生長(zhǎng)液終止消化，混勻，按照1:3的傳代比例分瓶；
[0049](2)種子細(xì)胞在生物反應(yīng)器上的接毒培養(yǎng)
[0050]在生物反應(yīng)器中將Cytodex-1微載體(GE Healthcare產(chǎn)品)的密度設(shè)定為5g/L，用制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行平衡，使微載體充分浸潤(rùn)在細(xì)胞生長(zhǎng)液中；然后接入(I)培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PK-15W細(xì)胞，接種密度為4X IO5個(gè)/ml，按照細(xì)胞培養(yǎng)液的5% (V/V)接種PCV2種毒(保藏號(hào)為CGMCC N0.2389，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授提供)種子液；接種后采用細(xì)胞生長(zhǎng)液在PH7.2，DO (溶氧)50%，攪拌轉(zhuǎn)速80r/min的條件下培養(yǎng)；
[0051](3)病毒的收獲和含量測(cè)定[0052]待細(xì)胞在前述條件下培養(yǎng)48h經(jīng)靜置后,放出上清液,加入細(xì)胞維持液,調(diào)整反應(yīng)器控制條件為:pH7.2，DO為50%，攪拌速度為120r/min的條件下繼續(xù)維持48h后靜置，進(jìn)行第一次上清收獲，觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)良好，補(bǔ)加與收獲上清等量的新鮮細(xì)胞維持液，在PH7.2，DO為50%，攪拌速度為120r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h后靜置，進(jìn)行第二次上清收獲，觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)良好，補(bǔ)加與收獲上清等量的新鮮細(xì)胞維持液，在PH7.2，DO為50%，攪拌速度為120r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h后靜置，進(jìn)行第三次上清收獲，觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)良好，補(bǔ)加與收獲上清等量的新鮮細(xì)胞維持液，在PH7.2，DO為50%，攪拌速度為120r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h后靜置，觀測(cè)細(xì)胞基本脫落，收獲上清后，將微載體回收處理，并將幾次收獲的抗原混勻反復(fù)凍融3次后，過濾去除細(xì)胞碎片，進(jìn)行病毒含量測(cè)定，-20°C冷凍保存作為半成品。
[0053]半成品檢驗(yàn)
[0054]半成品病毒含量測(cè)定采用IFA測(cè)定法，即將PCV2病毒液作10」到10」倍用維持液比稀釋后分別接種于長(zhǎng)滿單層的PK15-W細(xì)胞，每個(gè)稀釋度4個(gè)孔，每孔0.2ml,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，37°C含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)48h后，無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，用間接免疫熒光(IFA)測(cè)定每個(gè)稀釋度含有PCV2陽(yáng)性細(xì)胞(綠色熒光)的孔數(shù)，按Karber氏法計(jì)算病毒TCID50。
[0055]根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)病毒含量應(yīng)≤105_5TCID5tlAiL此實(shí)施例中豬圓環(huán)病毒2型的半成品病毒含量為IO6.66TCID50M。
[0056]上述技術(shù)方案中，生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、pH、DO (溶氧)、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，容積為7.5L。
[0057]上述技術(shù)方案中，所述種子細(xì)胞生長(zhǎng)液的成份(V/V)為:低糖DMEM 89%, NBCS10%，雙抗 1%。
[0058]上述技術(shù)方案中，所述胰酶消化液中胰酶的濃度0.25%, EDTA的濃度0.02%。
[0059]上述技術(shù)方案中，所述制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液的成份(V/V)為:低糖DMEM 87%, NBCS10%，雙抗1%，D-氨基葡萄糖1%，伴刀豆球蛋白Al %。
[0060]上述技術(shù)方案中，所述制苗細(xì)胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM 97%，伴刀豆球蛋白Al%，水解酪蛋白1%，雙抗1%。
[0061]上述技術(shù)方案中，所述雙抗為含10000IU/ml青霉素和10mg/ml的鏈霉素溶液。
[0062]上述技術(shù)方案中，所述生理鹽水的成份與含量為:NaCl 0.9g/L，所述生理鹽水的pH 為 7.0 ~7.4
[0063]上述技術(shù)方案中，所述PBS緩沖液的成份與含量為:NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L ；KH2PO40.24g/L ；Na2HPO4.12H203.65g/L，所述 PBS 緩沖液的 pH 為 7.2。
[0064]實(shí)施例2
[0065]一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，包括如下步驟:
[0066](I)種子細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶上的培養(yǎng)
[0067]利用預(yù)熱的無(wú)菌生理鹽水將長(zhǎng)滿單層的健康PK-15W細(xì)胞洗滌一次，加入30ml胰酶消化液消化，不斷轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)瓶直至細(xì)胞全部脫落，加入種子細(xì)胞生長(zhǎng)液終止消化，混勻，按照1:3的傳代比例分瓶；
[0068](2)種子細(xì)胞在生物反應(yīng)器上的接毒培養(yǎng)
[0069] 在生物反應(yīng)器中將Cytodex-1微載體的密度設(shè)定為6g/L，用制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行平衡備用；挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PK-15W種子細(xì)胞接種于生物反應(yīng)器中，接種密度為
2.5X IO5個(gè)/ml，按照細(xì)胞培養(yǎng)體積的5%接種PCV2種子液；接種后采用制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液在PH7.2，D050%，攪拌轉(zhuǎn)速80r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
[0070](3)病毒的收獲和含量測(cè)定
[0071]待細(xì)胞在前述條件下培養(yǎng)72h后靜置，排出上清，加入細(xì)胞維持液，調(diào)整反應(yīng)器控制條件為:PH7.2，DO為50%，攪拌速度為150r/min的條件下繼續(xù)維持72h后靜置，進(jìn)行第一次上清收獲，觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)良好，補(bǔ)加與收獲上清等量的新鮮細(xì)胞維持液，在PH7.2，DO為50%，攪拌速度為120r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h后靜置，進(jìn)行第二次上清收獲，觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)良好，補(bǔ)加與收獲上清等量的新鮮細(xì)胞維持液，在PH7.2，DO為
50%，攪拌速度為150r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h后靜置，進(jìn)行第三次上清收獲，觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)良好，補(bǔ)加與收獲上清等量的新鮮細(xì)胞維持液，在pH 7.2，DO為50 %，攪拌速度為150r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h后靜置，觀測(cè)細(xì)胞基本脫落，收獲上清后，將微載體回收處理，并將幾次收獲的上清液混合后反復(fù)凍融3次，過濾去除細(xì)胞碎片后進(jìn)行病毒含量測(cè)定，并置_20°C冷凍保存作為半成品。
[0072]半成品檢驗(yàn)及疫苗制造、成品檢驗(yàn)
[0073]1.半成品病毒含量測(cè)定:根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)病毒含量應(yīng)≥105_5TCID5ciAil，本實(shí)施例中的半成品病毒含量測(cè)定結(jié)果為:107_°TCID5(l/ml。
[0074]2.無(wú)菌檢驗(yàn):按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄301頁(yè)進(jìn)行，無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0075]3.成品檢驗(yàn):成品檢驗(yàn)按《豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(SH株)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》要求進(jìn)行，結(jié)果無(wú)菌，無(wú)支原體，抗體效價(jià)為1:6400,符合要求。
[0076]上述技術(shù)方案中，生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，容積為100L。
[0077]上述技術(shù)方案中，所述種子細(xì)胞生長(zhǎng)液的成份(V/V)為:低糖DMEM 89%, NBCS10%，雙抗 1%。
[0078]上述技術(shù)方案中，所述胰酶消化液中胰酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%, EDTA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)
0.02%。
[0079]上述技術(shù)方案中，所述制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液的成份(V/V)為:低糖DMEM 85%, NBCS10%，雙抗1%，D-氨基葡萄糖2%，伴刀豆球蛋白A2%。
[0080]上述技術(shù)方案中，所述制苗細(xì)胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM為97%，伴刀?球蛋白Al %,水解釀蛋白I %，雙抗為I %。
[0081]上述技術(shù)方案中，所述雙抗為含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的鏈霉素溶液。
[0082]上述技術(shù)方案中，所述生理鹽水的成份與含量為:NaCl 0.9g/L，所述生理鹽水的pH 為 7.0 ~7.4
[0083]上述技術(shù)方案中，所述PBS緩沖液的成份與含量為:NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L ；KH2PO40.24g/L ；Na2HPO4.12H20 3.65g/L，所述 PBS 緩沖液的 pH 為 7.2。
[0084]實(shí)施例3
[0085]——不同工藝方法生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2疫苗抗原的比較
[0086]表1不同工藝方法生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2疫苗抗原的比較
【權(quán)利要求】
1.一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，該方法包括如下步驟: (1)種子細(xì)胞的制備將無(wú)菌生理鹽水預(yù)熱處理，使用預(yù)熱后的生理鹽水洗滌長(zhǎng)滿單層的健康克隆細(xì)胞PK-15W作為種細(xì)胞，加入20~40ml胰酶進(jìn)行消化，消化期間，時(shí)刻觀察細(xì)胞層變化，待細(xì)胞層呈白色霧狀并部分脫落時(shí)，加入含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的有血清低糖DMEM的細(xì)胞生長(zhǎng)液，種子細(xì)胞終止消化，迅速搖動(dòng)轉(zhuǎn)瓶，使壁上細(xì)胞脫落，反復(fù)吹打分散細(xì)胞后，按照1:3至1:5的傳代比例分瓶； (2)制苗細(xì)胞的制備根據(jù)最終培養(yǎng)體積稱取Cytodex-1微載體，使其終濃度為5~10g/L,用PBS進(jìn)行浸泡清洗，滅菌后，在攪拌式生物反應(yīng)器中使用細(xì)胞生長(zhǎng)液進(jìn)行平衡，備用；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的種子細(xì)胞接種生物反應(yīng)器，接種密度為I~5X105個(gè)/ml ; (3)接毒隨后，以最終培養(yǎng)體積的3%~8%接種PCV2種毒；接種后，設(shè)定反應(yīng)器控制條件為:ρΗ7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為80~120r/min ； (4)病毒的收獲和含量測(cè)定待細(xì)胞在前述條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)液中培養(yǎng)48~72h后靜置，排出上清，加入含有伴刀豆蛋白A和水解酪蛋白的無(wú)血清低糖DMEM細(xì)胞維持液，調(diào)整反應(yīng)器控制條件為:pH7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為100r/min~180r/min，繼續(xù)維持48~72h后靜置,進(jìn)行第一次上清收獲,觀察細(xì)胞狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)良好則補(bǔ)加與收獲上清等量的新鮮細(xì)胞維持液，在PH7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為100r/min~180r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h后靜置，進(jìn)行第二次上清收獲，重復(fù)此過程直至微載體上的細(xì)胞全部脫落，結(jié)束整個(gè)培養(yǎng)過程，收獲上清后，將微載體進(jìn)行回收處理，并將收獲的抗原反復(fù)凍融3次后作為半成品，測(cè)定其病毒含量。
2.用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗。
3.用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗的方法，包括:將PCV2株在PK-15W細(xì)胞中大量增殖，經(jīng)甲醛滅活加入佐劑進(jìn)行乳化，制備疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，其特征在于:所述種子細(xì)胞生長(zhǎng)液的成份(V/V)為:低糖DMEM 89%~94%，NBCS 5%~10%，雙抗1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，其特征在于制苗細(xì)胞生長(zhǎng)液的成份(V/V)為:低糖DMEM為85%~92%，NBCS 5%~10%，雙抗1%, D-氨基葡萄糖0.5%~2%，伴刀豆蛋白A0.5%~2%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，其特征在于:所述制苗細(xì)胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM95%~98%，伴刀豆蛋白A0.5%~2%，水解酪蛋白0.5%~2%，雙抗1%。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK104004720SQ201410261474
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】董彥鵬, 孫石靜, 何葉峰, 繆芬芳, 何海蓉, 張志華, 胡芳 申請(qǐng)人:江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司