miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法，包括以下步驟：（1）胃癌干細(xì)胞的分離與鑒定；（2）胃癌干細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜分析及靶基因預(yù)測。本發(fā)明采用基因芯片分析胃癌干細(xì)胞miRNAs的特異性表達(dá)譜，并預(yù)測靶基因，該分析方法將推動miRNAs在胃癌干細(xì)胞方面的應(yīng)用，為進(jìn)一步了解胃癌干細(xì)胞本身的分子調(diào)控機制以及胃癌干細(xì)胞的分子靶向治療提供新的依據(jù)與思路。
【專利說明】miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌。近十幾年來，由 于內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展與普及，早期胃癌檢出率得到提高，胃癌死亡率有所下降，但進(jìn)展期胃癌 的預(yù)后仍然很差，5年生存率僅為20-25%，中位生存期約24個月。外科手術(shù)仍是胃癌標(biāo)準(zhǔn) 的治療方法，但治療結(jié)果并不令人滿意，即使是R0切除，其復(fù)發(fā)率仍然高達(dá)70%，術(shù)后放化 療或圍手術(shù)期化療也只能降低1〇%-15%的復(fù)發(fā)風(fēng)險。
[0003] 長期W來，人們一直認(rèn)為，腫瘤組織由各種異質(zhì)化的腫瘤細(xì)胞組成，該些細(xì)胞都具 有無限增殖和形成腫瘤的能力。近來研究結(jié)果表明腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs) 是腫瘤的根源，它決定腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、放化療抵抗W及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此，只有針對腫瘤干 細(xì)胞的治療才能為最終根治腫瘤帶來希望。目前，各種實體腫瘤中已相繼成功分離出了腫 瘤干細(xì)胞，該些腫瘤有乳癌、腦癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、肝癌、膜腺癌、頭頸部癌等。 2009年化kaishi S等采用流式細(xì)胞儀分選法（FACS)在含CD44+細(xì)胞的胃癌細(xì)胞株中成功 分離出胃癌干細(xì)胞，2011年Song Z等采用息浮球培養(yǎng)法（tumors地ere culturing)在胃 癌細(xì)胞株及人胃癌新鮮標(biāo)本組織中成功培養(yǎng)出息浮球，該些息浮球細(xì)胞類似于胃癌干細(xì)胞 (cancer stem-like cells，CSLCs)。
[0004] 然而，腫瘤干細(xì)胞本身在分子水平確切的調(diào)控機制尚不清楚。
[0005] microRNAs(miRNAs, miRs)是一類?？谡{(diào)控基因表達(dá)的高度保守的的非編碼小分 子RNA,含21 - 25個核巧酸，通過與3'-非編碼區(qū)（3'UTR)不完全結(jié)合誘導(dǎo)mRNA降 解或抑制其轉(zhuǎn)錄。miRNAs雖然小但卻廣泛參與細(xì)胞的發(fā)生、增殖及調(diào)亡等生物學(xué)調(diào)控過 程。早期研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞巧SC)的自我更新和分化，最近的研究顯 示miRNAs在調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性與功能方面發(fā)揮重要作用?；疐等研究乳腺癌 干細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)let-7在乳腺癌干細(xì)胞表達(dá)明顯下調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)let-7調(diào) 節(jié)干細(xì)胞的自我更新與分化，let-7a過表達(dá)會抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖、微球體形成、腫瘤 的形成與轉(zhuǎn)移。Liu C等研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌干細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜顯示miR-34a及l(fā)et-化 表達(dá)下調(diào)，miR-34a過表達(dá)能明顯抑制前列腺癌的生長與轉(zhuǎn)移。
[0006] 然而有關(guān)miRNAs與胃癌干細(xì)胞的研究報道極為罕見，miRNAs在胃癌干細(xì)胞中的 表達(dá)譜尚未有相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有研究領(lǐng)域中的不足，提供一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞 中表達(dá)譜的分析方法，推動miRNAs在胃癌干細(xì)胞方面的研究。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)；一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞 中表達(dá)譜的分析方法，包括W下步驟： (1) 胃癌干細(xì)胞的分離鑒定；選取H種或H種W上胃癌細(xì)胞株，采用息浮球培養(yǎng)法分離 出球體細(xì)胞；收集球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞，檢測干性基因CD44、Sox2、0ct3/4和Nanog表 達(dá)，檢測化療耐受性及裸鼠成瘤能力； (2) 胃癌干細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜分析及祀基因預(yù)測；收集息浮球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì) 胞，基因芯片分析息浮球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞的miRNAs的差異表達(dá)譜；PCR進(jìn)一步檢測 驗證球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs ;采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測祀基因，并分 析其生物學(xué)功能。
[0009] 進(jìn)一步的，所述步驟（1)具體包括W下步驟： ① 選取至少H株胃癌細(xì)胞株分別進(jìn)行培養(yǎng)； ② 收集貼壁細(xì)胞置于含無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液96孔超低粘附板中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中 含濃度1% N-2添加劑，濃度2% B-27添加劑，濃度為1%青鏈霉素，20 ng/ml成纖維細(xì)胞 生長因子2 (FGF-2)和100 ng/ml表皮生長因子（EGF)，觀察息浮球形成球體的情況； ③ 第一代球體細(xì)胞培養(yǎng)到二周，將球體細(xì)胞吹散，重新置于RPMI-1640培養(yǎng)液96孔超 低粘附板中培養(yǎng)，二周W后觀察球體形成情況；重復(fù)上述方法連續(xù)培養(yǎng)并傳代6代W上，提 取球體細(xì)胞； ④ 將收集的球體細(xì)胞分成H份，通過球體細(xì)胞干性基因的檢測、裸鼠活體致瘤實驗和 化療抵抗試驗測定其干細(xì)胞特性。
[0010] 進(jìn)一步的，所述步驟（1)的①中選取的胃癌細(xì)胞株為MKN-45、BGC823、NCI-N87 W 及 SGC7901。
[0011] 進(jìn)一步的，步驟（2)中差異表達(dá)miRNA的驗證具體為：選擇10個有差異表達(dá)的 miRNAs作進(jìn)一步的qRT-PCR驗證。
[0012] 進(jìn)一步的，所述步驟（2)中選擇的10個有差異表達(dá)的miRNAs分別為： miR-29a-；3p、miR-181a_5p、miR-21_5p、miR-27a-；3p、miR-22_3p、miR-4270、miR-483_5p、 miR-16-5p、let-7b-3p 和 miR-34a-5p。
[0013] 進(jìn)一步的，步驟（2)中差異表達(dá)miRNA的生物信息學(xué)分析具體為： (a) 分析目標(biāo) 根據(jù)息浮球細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞差異表達(dá)的microRNAs的結(jié)果及驗證分析結(jié)果，預(yù)測 該些microRNAs對應(yīng)的祀基因，并對該些祀基因的可能功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，從系統(tǒng)生物學(xué) 水平推測胃癌干細(xì)胞中microRNAs所調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性分子和網(wǎng)絡(luò)； (b) 分析方法 對于10個有差異表達(dá)的miRNAs,采用MiRanda, TargetScan W及PictarH個在線 數(shù)據(jù)庫的交集，對10個miRNAs的祀基因作預(yù)測，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；H個在線數(shù)據(jù)庫 的網(wǎng)址分別是：miRanda ：http://microrna. sanger. ac. uk ；TargetScan :http:// www. targetscan. org ；PicTar:http://www. ncrna. org/KnowledgeBase/link-Database/mirna_target_database D
[0014] 本發(fā)明的有益效果；本發(fā)明的miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法首先 采用息浮球培養(yǎng)法分離胃癌干細(xì)胞并作進(jìn)一步鑒定，然后采用基因芯片分析胃癌干細(xì)胞 miRNAs的特異性表達(dá)譜，并預(yù)測祀基因，該分析方法將推動miRNAs在胃癌干細(xì)胞方面的研 究，為進(jìn)一步了解胃癌干細(xì)胞本身的分子調(diào)控機制W及胃癌干細(xì)胞的分子祀向治療提供新 的依據(jù)與思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明技術(shù)路線的流程圖。
[0016] 圖2為球體細(xì)胞第0, 3, 7, 10, 14, 21天所形成的息浮球體。
[0017] 圖3為球體細(xì)胞和親代貼壁細(xì)胞成球率對比圖。
[0018] 圖4為PCR顯示球體細(xì)胞干性基因（CD44、0ct4、Sox2、Nanog)和親代貼壁細(xì)胞的 表達(dá)對比圖。
[0019] 圖5為Western blot顯不球體細(xì)胞干性基因（〔044、0別4、5〇義2、化]1〇肖）和親代貼 壁細(xì)胞的蛋白表達(dá)對比圖。
[0020] 圖6免疫英光顯示球體細(xì)胞0ct4/CD44, SOX2/CD44, Nanog/CD44的表達(dá)。
[0021] 圖7為裸鼠活體致癌實驗結(jié)果示意圖。
[0022] 圖8為5-FU+DDP作用24小時后球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞存活率的比較. 圖9為5-FU+DDP作用48小時后球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞存活率的比較。
[0023] 圖10為基因芯片檢測的胃癌細(xì)胞株MKN45球體細(xì)胞與貼壁細(xì)胞miRNAs的差異表 達(dá)（部分）。
[0024] 圖11為PCR驗證基因芯片結(jié)果。
[00巧]圖 12 Venn 圖示H種數(shù)據(jù)庫（PicTar, TargetScan, miRanda)所預(yù)測的 miRNAs 對 應(yīng)碑1基因的對數(shù)W及H個數(shù)據(jù)庫的交集數(shù)，圖中a- miRanda，b- PicTar，c- TargetScan。
[0026] 圖13生物信息分析技術(shù)所預(yù)測的microRNAs與祀基因的網(wǎng)絡(luò)圖。

【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)說明。
[0028] 參閱圖1，為miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法的流程圖，包括W下癌干 細(xì)胞的分離鑒定和胃癌干細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜分析及祀基因預(yù)測兩大步驟。
[0029] 實施例1 一、胃癌細(xì)胞株中胃癌干細(xì)胞的分離與鑒定，具體包括W下步驟： (1)選取胃癌細(xì)胞株MKN-45進(jìn)行培養(yǎng)。
[0030] (2)收集貼壁細(xì)胞置于含無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液96孔超低粘附板中培養(yǎng)， 培養(yǎng)液中含濃度1% N-2添加劑，濃度2% B-27添加劑（Invitrogen)，濃度1%青鏈霉素 (Gibco)，20 ng/ml FGF-2 和 100 ng/ml EGF(Qiemicon)，觀察息浮球形成球體的情況。
[0031] (3)第一代球體細(xì)胞培養(yǎng)到二周左右，將球體細(xì)胞吹散，重新置于RPMI-1640培養(yǎng) 液96孔超低粘附板中培養(yǎng)，二周W后觀察球體形成情況。重復(fù)上述方法連續(xù)培養(yǎng)并傳代6 代W上，提取球體細(xì)胞，用于下述實驗。
[0032] 圖2為球體細(xì)胞第0, 3, 7,10,14, 21天所形成的息浮球體。
[0033] 圖3為球體細(xì)胞和親代貼壁細(xì)胞成球率的比較圖，b代表球體細(xì)胞，a代表親代貼 壁細(xì)胞，從中可W看出球體細(xì)胞的成球率比親代貼壁細(xì)胞高。
[0034] (4)將收集的球體細(xì)胞分成H份，通過如下H方面的實驗測定其干細(xì)胞特性： a)球體細(xì)胞干性基因的檢測 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)、免疫印跡分析（western blot)及免疫英光 (immunofluorescence staining)分析球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞干性基因CD44、Sox2, 0ct4和Nanog的表達(dá)差異，其分析方法為常規(guī)方法，不再費述。表1是干性基因的引物序 列。
[00巧]表1干性基因的引物序列

【權(quán)利要求】
1. 一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 胃癌干細(xì)胞的分離鑒定：選取三種或三種以上胃癌細(xì)胞株，采用懸浮球培養(yǎng)法分離 出球體細(xì)胞；收集球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞，檢測干性基因CD44、S 〇x2、0ct3/4和Nanog表 達(dá),檢測化療耐受性及裸鼠成瘤能力； (2) 胃癌干細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜分析及靶基因預(yù)測：收集懸浮球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì) 胞，基因芯片分析懸浮球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞的miRNAs的差異表達(dá)譜；PCR進(jìn)一步檢測 驗證球體細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs;采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測靶基因，并分 析其生物學(xué)功能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法，其特征在 于，所述步驟（1)具體包括以下步驟： ① 選取至少三株胃癌細(xì)胞株分別進(jìn)行培養(yǎng)； ② 收集貼壁細(xì)胞置于含無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液96孔超低粘附板中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中 含濃度1%N-2添加劑，濃度2% B-27添加劑，濃度為1%青鏈霉素，20 ng/ml成纖維細(xì)胞 生長因子2 (FGF-2)和100 ng/ml表皮生長因子（EGF)，觀察懸浮球形成球體的情況； ③ 第一代球體細(xì)胞培養(yǎng)到二周，將球體細(xì)胞吹散，重新置于RPMI-1640培養(yǎng)液96孔超 低粘附板中培養(yǎng)，二周以后觀察球體形成情況；重復(fù)上述方法連續(xù)培養(yǎng)并傳代6代以上，提 取球體細(xì)胞； ④ 將收集的球體細(xì)胞分成三份，通過球體細(xì)胞干性基因的檢測、裸鼠活體致瘤實驗和 化療抵抗試驗測定其干細(xì)胞特性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法，其特征在 于：所述步驟（1)的①中選取的胃癌細(xì)胞株為MKN-45、BGC823、NCI-N87以及SGC7901。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法，其特征在 于：步驟（2)中差異表達(dá)miRNA的驗證具體為：選擇10個有差異表達(dá)的miRNAs作進(jìn)一步的 qRT-PCR驗證。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法，其特征在 于：所述步驟（2)中選擇的10個有差異表達(dá)的miRNAs分別為：miR-29a-3p、miR-181a-5p、 miR-21_5p、miR-27a_3p、miR-22_3p、miR-4270、miR-483_5p、miR-16_5p、let_7b_3p和 miR-34a_5p〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)譜的分析方法，其特征在 于：步驟（2)中差異表達(dá)miRNA的生物信息學(xué)分析具體為： (a) 分析目標(biāo) 根據(jù)懸浮球細(xì)胞與親代貼壁細(xì)胞差異表達(dá)的microRNAs的結(jié)果及驗證分析結(jié)果，預(yù)測 這些microRNAs對應(yīng)的靶基因，并對這些靶基因的可能功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，從系統(tǒng)生物學(xué) 水平推測胃癌干細(xì)胞中microRNAs所調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性分子和網(wǎng)絡(luò)； (b) 分析方法 對于10個有差異表達(dá)的miRNAs,采用MiRanda, TargetScan以及Pictar三個在線 數(shù)據(jù)庫的交集，對10個miRNAs的靶基因作預(yù)測，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；三個在線數(shù)據(jù)庫 的網(wǎng)址分別是：miRanda ：http: //microrna. sanger. ac. uk ；TargetScan ：http:// www. targetscan. org ；PicTar:http://www. ncrna. org/KnowledgeBase/link-
【文檔編號】C12Q1/68GK104513852SQ201410261531
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】劉建明, 周友浪, 馬利林, 王志偉 申請人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院