本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與蛋雞蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（pcr-sscp）是先用pcr擴(kuò)增出目的基因dna，目的基因的dna序列經(jīng)變性作用，但兩條互補(bǔ)單鏈dna依然由堿基之間的作用力維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以當(dāng)單個(gè)堿基發(fā)生突變時(shí)，即使dna長(zhǎng)度相同也能其導(dǎo)致空間構(gòu)象改變，因而在中性聚丙烯酰胺電泳中因分子量、電荷、分子形狀等不同而引起電泳遷移率的改變，從而實(shí)現(xiàn)多態(tài)性的判斷。這種技術(shù)適用于直接進(jìn)行點(diǎn)突變的檢測(cè)；具有靈敏度高、分析簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)帶型即可進(jìn)行判型，適合大樣本的篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與蛋雞蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供與蛋雞蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其位于雞ocx-36基因上，具體核苷酸序列包括序列表中seqidno.1和seqidno.3；

在序列表seqidno.1（即引物擴(kuò)增的第五外顯子部分序列）的核苷酸序列中，第144bp處的堿基為a時(shí)，與蛋雞高品質(zhì)蛋相關(guān)，如果該堿基為g，則與蛋雞低品質(zhì)蛋相關(guān)；

和/或

在序列表seqidno.3（即引物擴(kuò)增的第七外顯子部分序列）的核苷酸序列中，第169bp處的堿基為a，且第221bp處的堿基為g時(shí)，與蛋雞高品質(zhì)蛋相關(guān)；如果第169bp處的堿基為g，且第221bp處的堿基為a時(shí)，則與蛋雞低品質(zhì)蛋相關(guān)。

作為優(yōu)選，所述序列表seqidno.1中，第144bp處的堿基為a時(shí)，蛋雞蛋重、蛋白重、蛋黃重和蛋殼重較第144bp處的堿基為g時(shí)重。

作為優(yōu)選，所述序列表seqidno.3中，第169bp處的堿基為a，且第221bp處的堿基為g時(shí)，雞蛋哈氏單位含量高且蛋白高度高。

本發(fā)明還提供用于檢測(cè)上述的與蛋雞蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記的引物對(duì)，包括用于擴(kuò)增序列表中seqidno.1的引物對(duì)p5和用于擴(kuò)增序列表中seqidno.3的引物對(duì)p7；

所述p5為：f:gtgtggacagtgggggt；

r:gggcagatttcaggctt；

所述p7為：f:gagatgtgggtgctcggtg；

r:gtgatggggttggaggttg。

本發(fā)明還提供上述的與蛋雞蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記在鑒定蛋雞蛋品質(zhì)中的應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）提取待測(cè)雞的基因組dna；

（2）以待測(cè)雞的基因組dna為模板，利用權(quán)利要求2中所述的引物對(duì)p5和p7，分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

（3）檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，如果利用引物對(duì)p5擴(kuò)增的序列中，第144bp處的堿基為a；和/或利用引物對(duì)p7擴(kuò)增的序列中，第169bp處的堿基為a，第221bp處的堿基為g，則待測(cè)雞為蛋雞蛋品質(zhì)性狀優(yōu)的雞品種；如果利用引物對(duì)p5擴(kuò)增的序列中，第144bp處的堿基為g；且利用引物對(duì)p7擴(kuò)增的序列中，第169bp處的堿基為g，第221bp處的堿基為a，則待測(cè)雞為蛋雞蛋品質(zhì)性狀差的雞品種。

作為優(yōu)選，步驟（2）中pcr反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以20μl計(jì)為：10×pcrbuffer(mg²⁺+plus)3μl，10mmol/ldntpmix1.5μl，5u/μltaqdnapolymerase0.25μl，模板dna1μl，上下游引物各1μl，ddh2o12.25μl。

作為優(yōu)選，步驟（2）中，pcr反應(yīng)使用的條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃30s，退火30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃保存。

作為優(yōu)選，步驟（3）中，所述檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物采用sscp檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，凝膠電泳后染色，得到sscp電泳帶型圖，根據(jù)圖譜中條帶的類型和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果對(duì)待測(cè)樣本的蛋雞蛋品質(zhì)性狀進(jìn)行判斷。

步驟（3）中，也可以用其他方法來(lái)檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，比如直接進(jìn)行測(cè)序，并不限于本發(fā)明中所述方法。

本發(fā)明還提供含有上述引物對(duì)的用于檢測(cè)蛋雞蛋品質(zhì)的試劑盒。

本發(fā)明還提供與蛋雞蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記在雞分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明利用pcr-sscp方法對(duì)海蘭褐蛋雞的蛋品質(zhì)性狀相關(guān)候選基因ocx36進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，探尋候選基因的等位基因及其基因型在蛋雞中的分布情況，并期望篩選出與蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的基因型作為遺傳標(biāo)記，為今后的標(biāo)記輔助選擇提供理論和技術(shù)上的參考。

附圖說明

附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為蛋雞蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記的檢測(cè)過程示意圖；

圖2為基因組dna電泳圖；

圖3為ocx36第五外顯子pcr產(chǎn)物；

圖4為ocx36第七外顯子pcr產(chǎn)物；

圖5為ocx36第五外顯子引物sscp電泳圖；

圖6為ocx36第七外顯子引物sscp電泳圖；

圖7為ocx36第五外顯子引物部分測(cè)序結(jié)果；

圖8為ocx36第七外顯子引物部分測(cè)序結(jié)果；

圖9為ocx36第七外顯子引物部分測(cè)序結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說明，均為市售。

實(shí)施例1

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取產(chǎn)蛋率90%左右、32周齡的父母代海蘭褐蛋雞，飼養(yǎng)于石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)站，取236只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。單籠同舍飼養(yǎng)，依籠編號(hào)，且按照海蘭褐蛋雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.1.2主要試劑

taqdna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer(不含鎂離子)以及dnamarkerⅰ、瓊脂糖凝膠、dna回收試劑盒，pgem–teasy載體，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、tris堿、過硫酸銨（aps）購(gòu)自上海生工公司。

氯化鈉、十二烷基磺酸鈉(sds)、乙二胺四乙酸二鈉、氯仿、異戊醇、醋酸銨、嗅化乙錠、無(wú)水乙醇、硼酸、二甲苯氰、溴酚藍(lán)等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3主要儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備：dna/rna濃度測(cè)定儀（美國(guó)thermoscientific公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)backman公司生產(chǎn)，型號(hào)microfuge18）；梯度pcr儀（biometra，德國(guó)）；凝膠成像分析系統(tǒng)μvp（biospectrμm，美國(guó)）；hhs型電熱恒溫水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、dyy-iii24a型電泳槽、ptc-100tm型pcr儀、dyy-4型電泳儀、磁力加熱攪拌器、制冰機(jī)、wd-9406型膠片觀察燈、wd-9405b型水平搖床、紫外凝膠成像分析儀器、超凈工作臺(tái)。

1.1.4試劑配置

(1)tris-hcl（1mol/l,1000ml,ph=7.5）：tris-堿121.1g，濃hcl65ml，加水定容至1000ml，高壓滅菌備用。

(2)edta(0.5mol/l,100ml,ph=8.0)：na2edta·2h2o稱取18.61g加水溶解，用約2gnaoh，調(diào)節(jié)ph至8.0，定容至100ml。

(3)sds(10%,50ml)：5gsds溶解于40ml水，68℃水浴使其完全溶解，用濃hcl調(diào)節(jié)ph至7.2。

(4)30%丙烯酰胺：1g甲叉酰胺，29g聚丙烯酰胺，溶于100ml去離子水。

(5)5×tbe：tris-base54g，硼酸27.5g，加800ml蒸餾水溶解，加20mledta(ph=8.0)，定容至1000ml。

(6)10%過硫酸銨：1g過硫酸銨溶解于5ml去離子水，定容至10ml。

(7)固定液：無(wú)水乙醇50ml，冰乙酸2.5ml，定容至500ml。

(8)染色液：硝酸銀1g，無(wú)水乙醇50ml，冰乙酸2.5ml，1g硝酸銀溶于水，加入50ml無(wú)水乙醇，2.5ml冰乙酸，定容至500ml。

(9)顯影液：37%甲醛溶液2.5ml，氫氧化鈉15g，將15g氫氧化鈉溶于水，溶解后加入2.5ml37%甲醛溶液，定容至500ml。

(10)變性劑：去離子甲酰胺9.8ml,edta(ph=8.0),溴酚藍(lán)10mg，二甲苯菁10mg。

克隆試劑的配制：

①lb液體培養(yǎng)基：稱取10g胰蛋白脈，5g酵母浸出物，i0gnacl，溶于800ml雙蒸水中，完全溶解后，用1mol/lnaoh和1mol/lhcl調(diào)ph值至7.0-7.2，定容至1000ml，高壓滅菌后備用。

②lb固體培養(yǎng)基：按上述方法配制液體培養(yǎng)基，每l00ml加入1.5g瓊脂粉，高壓滅菌后在無(wú)菌狀態(tài)下鋪平板，冷卻后備用。

③氨芐青霉素(amp)：用滅菌雙蒸水溶解，儲(chǔ)存濃度為500mg/ml，-20℃保存。

1.1.5引物設(shè)計(jì)

根據(jù)genbank登陸的原雞ocx-36（登錄號(hào)：nc_006107.4），利用軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增第五外顯子、第七外顯子序列，引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1ocx-36引物序列信息

1.2主要的實(shí)驗(yàn)方法與步驟

主要的實(shí)驗(yàn)方法為：采集正常蛋雞血液，對(duì)候選基因進(jìn)行pcr-sscp多態(tài)性分析；取正常蛋雞連續(xù)15天的雞蛋，進(jìn)行蛋品質(zhì)性狀的檢測(cè)；將檢測(cè)結(jié)果與pcr-sscp結(jié)果相對(duì)應(yīng)，尋找調(diào)控蛋品質(zhì)性狀的優(yōu)勢(shì)基因型，鑒定優(yōu)勢(shì)基因型，蛋品質(zhì)性狀的測(cè)定，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，找到與蛋品質(zhì)性狀顯著或極顯著的基因型。

1.2.1血樣采集

通過edta-k2真空采血管翅下靜脈采集血液，每只雞約采集1ml，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2基因組dna提取

（1）將冷凍血解凍后取30μl全血于ependorf管中，加入500μlste,100μlsds,5μl蛋白酶k(l0mg/ml)，混勻置55℃水浴16-18h；

（2）取出，冷卻至室溫，加入飽和酚500μl抽提，來(lái)回緩慢顛倒10min，12000r/min離心15min；

（3）取上清，加入酚：氯仿：異戊醇(體積比為25：24：1)500μl抽提一次；

（4）取上清，加入氯仿：異戊醇(體積比為24：1)500μl再抽提一次；

（5）取上清，加入10mmol/l醋酸銨50μl，混勻；再加無(wú)水酒精1000μl，緩慢顛倒混勻，此時(shí)可見白色絮狀沉淀，4℃放置10min，10000r/min離心15min；

（6）棄上清，加入75%酒精500μl，混勻，10000r/min離心15min；

（7）棄上清，于通風(fēng)處倒置30-40min風(fēng)干至管內(nèi)無(wú)酒精味，加100-200μite溶解，4℃保存。

1.2.3dna質(zhì)量檢測(cè)

dna提取后用1.2%tbe瓊脂糖凝膠電泳，向瓊脂糖膠的點(diǎn)樣孔處依次加入3μldna的te溶解液與5μl溴酚藍(lán)的混合樣品。點(diǎn)樣完成后打開電泳儀調(diào)制130v電泳3分鐘后將電泳調(diào)制100v持續(xù)電泳，以肉眼可見得藍(lán)色條帶跑至膠的下半部分時(shí)停止電泳。將電泳好的凝膠置于紫外下成像檢測(cè)是否合格。不合格的樣品重新提取，直至合格。將合格的凝膠照相并將圖片標(biāo)號(hào)保存，同時(shí)檢測(cè)合格的dna樣品放入-20℃冰箱保存待用。

1.2.4pcr反應(yīng)體系

pcr擴(kuò)增體系（20μl）:10×pcrbuffer(mg²⁺+plus)3μl，10mmol/ldntpmix1.5μl，5u/μltaqdnapolymerase0.25μl，模板dna1μl，上下游引物各1μl，ddh2o12.25μl。

1.2.5pcr反應(yīng)程序

95℃預(yù)變性5min，95℃30s，退火30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃保存。退火溫度根據(jù)具體的引物序列的擴(kuò)增條件而定。

1.2.6pcr產(chǎn)物檢測(cè)

（1）用0.5×tbe電泳緩沖液配置1.2%的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mleb)；

（2）取pcr產(chǎn)物5μl，混合2μl溴酚藍(lán)上樣，以dnamarker進(jìn)行分子量對(duì)照；

（3）以0.5×tbe電泳緩沖液，電泳90v(5v/cm)30min；

（4）將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)，拍照保存。

1.2.7非變性聚丙烯酰胺凝膠配制

根據(jù)pcr產(chǎn)物大小的不同選擇不同濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠。本實(shí)驗(yàn)選用膠濃度為：200bp以內(nèi)的目的條帶選用8%的凝膠；小于或等于300bp選用10%的凝膠；小于或等于400bp的目的條帶選用12%的凝膠。凝膠制作方法參考分子克隆指南第三版。

表2非變性聚丙烯酰胺凝膠配制

1.2.8sscp實(shí)驗(yàn)方法

（1）page封底膠的制備，用0.5×tbe電泳緩沖液制備濃度為2%瓊脂糖膠封底。

（2）將玻璃板清洗干凈，并用蒸餾水沖洗后放入干燥箱中烘干。將烘干的玻璃板取出放入封底膠槽內(nèi)，用夾子的固定在膠架上，將制好的封底膠倒入封底槽中。待封底膠凝固后，再進(jìn)行下一步操作。

（3）依據(jù)所跑片段的大小選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠。在兩玻璃板內(nèi)注入配好的聚丙烯酰胺凝膠。將配置好的膠緩慢倒入傾斜的玻板之間，以免所制備的膠中有氣泡生成，插入所需孔數(shù)的梳子等待凝固。

（4）pcr目的片段的變性，取pcr產(chǎn)物3ul于一新的pcr管中，與8ul的變性劑混勻離心，在pcr儀器上設(shè)置98℃10min的條件進(jìn)行變性，10min后迅速取出置于提前制好的冰盒上冷卻以防復(fù)性。

（5）在凝固好的聚丙烯酰胺凝膠膠架上，用手術(shù)刀片整齊的割除多余的封底膠，取下梳子，放置于電泳槽上，迅速加入1×tbe的電泳液，將梳孔中的殘留的氣泡趕出后，向點(diǎn)樣孔中依次加入10ul變性產(chǎn)物。

（6）打開電泳儀，先在300v電壓條件下電泳5分鐘將條帶跑出膠孔，后改為100v電壓過夜進(jìn)行電泳。

（7）關(guān)閉電泳儀，取下夾子并將玻璃板從電泳槽中取出，小心將兩玻璃板分開后，用刀片將膠切出并放入漂洗槽中，先用蒸餾水沖洗兩次后，倒入可以完全浸沒凝膠的固定液于搖床上，固定10分鐘。

（8）回收固定液，用蒸餾水漂洗膠兩次，倒入染色液，置于搖床上染色20分鐘。

（9）回收染色液，用蒸餾水漂洗膠，加入顯影液，置于搖床上進(jìn)行顯影反映，直至顯影完成。

（10）回收顯影液，用蒸餾水漂洗膠，根據(jù)顯影情況選擇是否需要再次固定。

（11）將膠放置與凝膠成像分析儀上進(jìn)行觀察、照相。

1.2.9pcr產(chǎn)物的純化回收

按普通瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒的說明書要求進(jìn)行操作。首先柱平衡，向吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液bl，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將切下的單一目的條帶放入滅菌ep管中，加入3倍體積溶膠液pn，50℃水浴放置10min，并溫和翻轉(zhuǎn)離心管，使膠塊充分溶解。將降至室溫的混合溶液加入平衡過的ca2中，室溫放置2min，12000rpm離心50s，棄廢液；向ca2中加入700μl漂洗液pw，12000rpm離心50s，棄廢液。再向ca2中加入500μl漂洗液pw，12000rpm離心50s，棄廢液。將ca2放回收集管中，12000rpm離心2min，以除盡漂洗液。將ca2于室溫放置10min，徹底晾干。最后將ca2放到新的ep管中，向吸附膜中央位置懸空滴加40μl緩沖液eb，室溫放置2min。12000rpm離心2min，回收液即為目的dna溶液。

在t4dna連接酶作用下，經(jīng)16℃連接pmd19-tvector載體16h，將5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，吸取上清液加入8μliptg和40μlx-gal，再吸取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物到lb培養(yǎng)基板，涂板后在37℃倒置平板培養(yǎng)過夜，用取菌環(huán)在過夜培養(yǎng)的平皿中挑取單克隆，將挑出的單克隆放在lb液體培養(yǎng)基中再培養(yǎng)6-8h，加入40%的滅菌甘油，送華大基因測(cè)序。

1.3數(shù)據(jù)處理及分析

1.3.1統(tǒng)計(jì)基因頻率和基因型頻率

基因頻率可以作為反映遺傳結(jié)構(gòu)和群體特征的指標(biāo)，用來(lái)進(jìn)行同一地區(qū)不同品種家畜群體遺傳結(jié)構(gòu)的比較。

pi=[2(ii)+(ij1)+(ij2)+……+(ijn)]/2n

pi:第i個(gè)等位基因的頻率；ⅰ:純合復(fù)等位基因；

j1,j2……jn:與i共顯性的第1到第n個(gè)等位基因。

基因型頻率=基因型個(gè)體數(shù)/測(cè)定群體所有基因型的總數(shù)。

1.3.2群體中基因頻率和基因型頻率的差異顯著性檢驗(yàn)(χ²獨(dú)立性檢驗(yàn))

χ²值的計(jì)算是以計(jì)算基因型的理論值為前提的，各種基因型頻率的理論值要根據(jù)所統(tǒng)計(jì)的群體的基因頻率來(lái)計(jì)算。

基因位點(diǎn)的hardy-weinberg平衡性檢測(cè)采用χ²統(tǒng)計(jì)量，其計(jì)算公式為：

其中：m為某一遺傳位點(diǎn)基因型應(yīng)有個(gè)數(shù)；fi代表第i個(gè)基因型的實(shí)際個(gè)體數(shù)量；i為基因型序號(hào)；n為樣本數(shù)量；pi代表第i個(gè)基因型的理論頻率。

若自由度為df=2，且某些基因型的理論值小于5時(shí)，可采用校正公式：

其中：ei為理論值，oi為實(shí)際觀察值，n為基因型數(shù)。

1.3.3群體遺傳雜合度和遺傳純合度

平均雜合度是衡量群體內(nèi)遺傳變異的有效指標(biāo)。平均雜合度和遺傳變異程度呈正相關(guān)的關(guān)系。一個(gè)群體的基因變異，通?？捎盟鄳B(tài)性位點(diǎn)的百分比和每個(gè)位點(diǎn)的平均雜合度來(lái)衡量。

群體內(nèi)某一基因位點(diǎn)純合度的公式為：

平均雜合度公式為：

其中：h為某一位點(diǎn)的雜合度，pi為某一位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因的基因頻率，n為某一位點(diǎn)的等位基因的數(shù)目。

1.3.4多態(tài)信息含量

pic（polymorphicinformationcontent），多態(tài)信息含量，是dna變異程度的衡量指標(biāo)。用于對(duì)標(biāo)記基因多態(tài)性的估測(cè)。一般規(guī)定，pic＞0.5時(shí)，該多態(tài)位點(diǎn)為高度多態(tài)，0.25＜pic＜0.5時(shí)，該多態(tài)位點(diǎn)為中度多態(tài)，pic＜0.25時(shí)，該多態(tài)位點(diǎn)為低度多態(tài)。

pic值是根據(jù)各個(gè)等位基因的基因頻率來(lái)計(jì)算的。其公式為：

其中：n為某位點(diǎn)的等位基因數(shù)目，pi和pj分別為第i和第j個(gè)等位基因在該群體中的基因頻率。

1.3.5有效等位基因數(shù)(effectivenumberofalleles，ne)

有效等位基因數(shù)等于基因純合度的倒數(shù)，是衡量群體遺傳變異的一個(gè)指標(biāo)。等位基因在群體中分布得越均勻，有效等位基因數(shù)越接近實(shí)際檢測(cè)到的等位基因的個(gè)數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)群體遺傳背景一致，飼養(yǎng)管理相同，故構(gòu)建一般線性模型：

yij=μ+gi+fj+eij，式中，yij表示各個(gè)體性狀測(cè)定值；μ為群體均值；gi為基因型效應(yīng)；fj表示家系效應(yīng)（公雞效應(yīng)）；eij表示隨機(jī)誤差。采用sas8.1統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果用“最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2結(jié)果與分析

2.1基因組dna提取及檢測(cè)

提取樣本基因組dna，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，基因組dna條帶明亮單一，完整性好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，結(jié)果見圖2。

2.2ocx36外顯子區(qū)pcr產(chǎn)物擴(kuò)增片段的檢測(cè)

經(jīng)檢測(cè)基因ocx36根據(jù)外顯子5、7設(shè)計(jì)的2對(duì)pcr引物均符合要求。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶單一清晰，條帶位置與makerⅰ標(biāo)記位置一致，具有百分之百的擴(kuò)增效率，可用于后續(xù)的sscp分析，結(jié)果見圖3、4。

2.3ocx36基因多態(tài)性的檢測(cè)

2.3.1ocx36第五外顯子sscp檢測(cè)結(jié)果

圖5為第五外顯子引物sscp電泳帶型圖，分別取aa、ag、gg帶型所對(duì)應(yīng)dna樣本測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖7，依次為aa、ag、gg帶型的測(cè)序結(jié)果。與genbank上的ocx36已知序列進(jìn)行同源性比較，突變位點(diǎn)位于ocx36序列第2472bp位置（即突變位點(diǎn)位于序列表seqidno.1中第144bp位置），發(fā)生了a/g的突變，即由a突變?yōu)間。見圖5。aa帶型所對(duì)應(yīng)的ocx36序列第2472bp的位置為a，gg帶型所對(duì)應(yīng)的ocx36序列第2472bp的位置為g，ag帶型所對(duì)應(yīng)的ocx36序列第2472bp的位置由a突變?yōu)間。

引物p5擴(kuò)增的核苷酸序列為：

上述序列中，第144bp處的r為等位基因a/g。

2.3.2ocx36第七外顯子sscp檢測(cè)結(jié)果

圖6為第七外顯子引物sscp電泳帶型圖，分別取aa、ab、bb、ac、ad帶型所對(duì)應(yīng)dna樣本測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖8和圖9，圖8依次為aa、ab、bb帶型的測(cè)序結(jié)果，圖9依次為ac、ad帶型的測(cè)序結(jié)果。與genbank上的ocx36已知序列進(jìn)行同源性比較，第一突變位點(diǎn)位于ocx36序列第3287bp位置，發(fā)生了g/a的突變?nèi)鐖D4，第二突變位點(diǎn)位于ocx36序列第3339bp位置，發(fā)生了g/a的突變（即第一突變位點(diǎn)位于序列表seqidno.3中第169bp位置，第二突變位點(diǎn)位于序列表seqidno.3中第221bp位置，均由g突變?yōu)閍），見圖6。

其中，

aa所對(duì)應(yīng)的ocx36序列第3287bp的位置為a(該位點(diǎn)發(fā)生突變，由g突變?yōu)閍)，ocx36序列第3339bp的位置為g；

ab所對(duì)應(yīng)的ocx36序列第3287bp的位置為g，ocx36序列第3339bp的位置為g；

bb所對(duì)應(yīng)的ocx36序列第3287bp的位置為a，ocx36序列第3339bp的位置為g；

ac所對(duì)應(yīng)的ocx36序列第3287bp的位置為g，ocx36序列第3339bp的位置為a(該位點(diǎn)發(fā)生突變，由g突變?yōu)閍)；

ad所對(duì)應(yīng)的ocx36序列第3287bp的位置為g，ocx36序列第3339bp的位置為g。

引物p7擴(kuò)增的核苷酸序列為：

上述序列中，第169bp處的r為等位基因g/a，第221bp處的m為等位基因g/a。

2.4ocx36多態(tài)性與蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

蛋雞ocx36基因第五顯子中的aa基因型在蛋重、蛋白重、蛋黃重和蛋殼重性狀較其余基因型分別高出9.56g、9.31g、6.17g、1.66g，且均達(dá)到極顯著影響（p＜0.01），aa基因型可作為調(diào)控蛋重、蛋白重、蛋黃重和蛋殼重的標(biāo)記基因型，見表1。

表1ocx36第五顯子多態(tài)性與蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析（最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

由表1可知，當(dāng)ocx36序列第2472bp位置為a時(shí)，蛋重、蛋白重、蛋黃重和蛋殼重性狀高。

蛋雞ocx36基因第七顯子的aa型在調(diào)控哈氏單位、蛋白高度較其他基因型極顯著（p＜0.01）高出34.02、2.56mm；aa型可作為調(diào)控哈氏單位和蛋白高度的標(biāo)記基因型，見表2。

表2ocx36第七顯子多態(tài)性與蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析（最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

注：肩標(biāo)字母相同表示差異不顯著(p＞0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(p＜0.01)。

由表2可知，當(dāng)ocx36序列第3287bp位置由g突變?yōu)閍，且第3339bp位置仍為g時(shí)，雞蛋哈氏單位、蛋白高度高。

實(shí)施例2

蛋雞蛋品質(zhì)性狀檢測(cè)試劑盒，包括：

1、引物對(duì)

p5：

f:gtgtggacagtgggggt；

r:gggcagatttcaggctt；

p7：

f:gagatgtgggtgctcggtg；

r:gtgatggggttggaggttg。

2、pcr檢測(cè)試劑

以20μl計(jì)為：10×pcrbuffer(mg²⁺+plus)3μl，10mmol/ldntpmix1.5μl，5u/μltaqdnapolymerase0.25μl，模板dna1μl，上下游引物各1μl，ddh2o12.25μl。

3陽(yáng)性對(duì)照

以單鏈的序列表seqidno.1中的核苷酸序列作為陽(yáng)性對(duì)照一，以單鏈的序列表seqidno.2中的核苷酸序列作為陽(yáng)性對(duì)照二，以單鏈的序列表seqidno.3中的核苷酸序列作為陽(yáng)性對(duì)照三，以單鏈的序列表seqidno.4中的核苷酸序列作為陽(yáng)性對(duì)照四，以單鏈的序列表seqidno.5中的核苷酸序列作為陽(yáng)性對(duì)照五。

該試劑盒的使用方法參照實(shí)施例1。

將待測(cè)樣本的sscp電泳帶型圖與陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，對(duì)待測(cè)樣本的蛋雞蛋品質(zhì)性狀進(jìn)行判斷。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>石河子大學(xué)

<120>與蛋雞蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>181

<212>dna

<213>ocx36第五外顯子等位基因

<400>1

gtgtggacagtgggggtcttctgctctgctgcagtgcccgggagctgttggtttttggcc60

ctcatacattcccttttgttttcttccctcctttccagcttactgtccctgtcagtgcat120

gacatggtgttcagccacctgacagcaactctgcctggtttggtaagcctgaaatctgcc180

c181

<210>2

<211>181

<212>dna

<213>ocx36第五外顯子等位基因

<400>2

gtgtggacagtgggggtcttctgctctgctgcagtgcccgggagctgttggtttttggcc60

ctcatacattcccttttgttttcttccctcctttccagcttactgtccctgtcagtgcat120

gacatggtgttcagccacctgacggcaactctgcctggtttggtaagcctgaaatctgcc180

c181

<210>3

<211>329

<212>dna

<213>ocx36第七外顯子等位基因

<400>3

gagatgtgggtgctcggtgcgtgctgctccctctgctggaacctggggcaggaggagctc60

tgtgttccctgaccatcaccaatggctttcccatgcagtggtgatgccagtcggcttgaa120

ggggatggttcactaccacctggtcggcccaccattcacctccggttcatccctgatgat180

ggatttagatgtaagtgaaccctggctatcagtaccatgcgcaccccgggcttctttcag240

cacaaccaaacagaagggctgtgctgatgagctgttctggggctgccagctaaacgtgcc300

agcccctgtccaacctccaaccccatcac329

<210>4

<211>329

<212>dna

<213>ocx36第七外顯子等位基因

<400>4

gagatgtgggtgctcggtgcgtgctgctccctctgctggaacctggggcaggaggagctc60

tgtgttccctgaccatcaccaatggctttcccatgcagtggtgatgccagtcggcttgaa120

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cacaaccaaacagaagggctgtgctgatgagctgttctggggctgccagctaaacgtgcc300

agcccctgtccaacctccaaccccatcac329

<210>5

<211>329

<212>dna

<213>ocx36第七外顯子等位基因

<400>5

gagatgtgggtgctcggtgcgtgctgctccctctgctggaacctggggcaggaggagctc60

tgtgttccctgaccatcaccaatggctttcccatgcagtggtgatgccagtcggcttgaa120

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agcccctgtccaacctccaaccccatcac329