本發(fā)明涉及生物分析技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于依賴解旋酶dna恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)microrna的方法。

背景技術(shù)：

microrna是近年來在多種真核細(xì)胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼單鏈rna，長(zhǎng)度為21～25nt的短序列，在進(jìn)化上具有高度的保守性，能夠通過與靶mrna特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mrna降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。由于microrna序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認(rèn)為microrna的功能是參與生命的一些基本過程，如發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、應(yīng)激反應(yīng)和脂肪代謝等。

因此，microrna被認(rèn)為是一種潛在的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)microrna的選擇性靈敏定量檢測(cè)對(duì)于理解其生物功能和臨床應(yīng)用都具有很重要的價(jià)值。

由于microrna分子只有21～25nt左右大小，檢測(cè)較為困難?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法中，核酸印跡分析作為microrna分析的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法存在著靈敏度較低(高于1納摩爾每升)、操作耗時(shí)以及樣品消耗量大等缺點(diǎn)，因此該方法并不適于低豐度microrna的分析測(cè)定。

為了提高檢測(cè)靈敏度，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)和恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的microrna檢測(cè)方法逐漸發(fā)展起來?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的方法實(shí)現(xiàn)了檢出限的大幅降低(達(dá)到100飛摩爾每升左右)，但該方法所必需的反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)增加了探針設(shè)計(jì)的難度；此外，為了實(shí)現(xiàn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)所需的精確溫度循環(huán)過程，需要使用價(jià)格昂貴而操作復(fù)雜的熱循環(huán)儀，這也限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

滾環(huán)擴(kuò)增(rca)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(lamp)以及指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(expar)等恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展使得microrna的檢測(cè)可以在某一特定溫度下進(jìn)行，達(dá)到了較高的靈敏度，但大多數(shù)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)機(jī)理較為復(fù)雜，難以滿足臨床檢測(cè)的需求。例如，為了達(dá)到10飛摩爾每升的檢出限，分支滾環(huán)擴(kuò)增(rca)需要長(zhǎng)達(dá)8個(gè)小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，而恒溫指數(shù)擴(kuò)增(expar)需要設(shè)計(jì)帶有限制性核酸內(nèi)切酶特異性識(shí)別位點(diǎn)的核酸模板。

依賴解旋酶輔助的恒溫?cái)U(kuò)增(hda)技術(shù)是核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的一種，該技術(shù)模擬自然界生物體內(nèi)dna復(fù)制的自然過程，在恒溫條件下利用解旋酶解開dna雙鏈，同時(shí)dna單鏈結(jié)合蛋白(ssb)穩(wěn)定解開的單鏈為引物提供結(jié)合模板，然后由dna聚合酶催化合成互補(bǔ)鏈。新合成的雙鏈在解旋酶作用下又解成單鏈，并作為下一輪合成的模板進(jìn)入上述循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)式增長(zhǎng)。目前有關(guān)hda檢測(cè)方法的報(bào)道較少，相關(guān)研究主要是利用hda技術(shù)對(duì)一些病原菌進(jìn)行檢測(cè)，但尚未見采用hda方法檢測(cè)microrna的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于依賴解旋酶dna恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)microrna的方法。本發(fā)明將hda技術(shù)引入到microrna檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)microrna的超高靈敏檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種基于依賴解旋酶dna恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)microrna的方法，步驟如下：

(1)提取樣品中的總rna；

(2)向提取的總rna中加入單鏈dna探針和過量的核酸外切酶i，在反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行孵育，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)microrna與單鏈dna探針的特異性結(jié)合，利用過量的核酸外切酶i將多余的單鏈dna探針消除；

(3)向步驟(2)的反應(yīng)體系中加入上游引物、下游引物、單鏈結(jié)合蛋白和解旋酶，對(duì)目標(biāo)microrna進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，通過熒光信號(hào)檢測(cè)目標(biāo)microrna的表達(dá)。

優(yōu)選的，步驟(1)中，提取樣品中的總rna采用的方法為：利用總rna提取試劑盒對(duì)樣品中的rna進(jìn)行抽提與純化。

優(yōu)選的，步驟(2)中，所述單鏈dna探針中包含hda擴(kuò)增的模板序列，并且所述單鏈dna探針的3’末端與待檢測(cè)的目標(biāo)microrna完全互補(bǔ)。

優(yōu)選的，步驟(2)中，所述反應(yīng)緩沖液中含有：1毫摩爾每升的二硫蘇糖醇(dtt)、1×核酸外切酶i(exoi)反應(yīng)緩沖液、20個(gè)單位的rna酶抑制劑、10毫摩爾每升的氯化鈉以及10毫摩爾每升的ph8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)緩沖液。

優(yōu)選的，步驟(2)中，孵育的溫度為95℃，孵育的時(shí)間為5min。

優(yōu)選的，步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)的溫度為60-70℃，擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間為30min。

優(yōu)選的，步驟(3)中，所述上游引物與單鏈dna探針的3’端互補(bǔ)；所述“下游引物”與單鏈dna探針的5’端一致，可保證hda擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。

作為本申請(qǐng)的一種優(yōu)選的實(shí)施方案，所檢測(cè)的目標(biāo)microrna為mir-21；用于檢測(cè)mir-21的單鏈dna探針序列如seqidno.1所示；用于檢測(cè)mir-21的上游引物和下游引物的序列分別如seqidno.2和seqidno.3所示；具體如下：

單鏈dna探針：5’-aatattttccaacaacgcttctgcaatcggatattggcctctcaatgctttttcgtaccaacttatcaaatcatcctcagtcaacatcagtctgataagcta-3’；(seqidno.1)

上游引物：5’-tagcttatcagactgatgttgactgagg-3’；(seqidno.2)

下游引物：5’-aatattttccaacaacgcttctgcaat-3’；(seqidno.3)

本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測(cè)microrna的試劑和/或試劑盒，包括：?jiǎn)捂渄na探針、上游引物和下游引物；

所述單鏈dna探針中包含hda擴(kuò)增的模板序列，并且所述單鏈dna探針的3’末端與待檢測(cè)的目標(biāo)microrna完全互補(bǔ)；

所述上游引物與單鏈dna探針的3’端互補(bǔ)；所述“下游引物”與單鏈dna探針的5’端一致，可保證hda擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。

優(yōu)選的，所述試劑和/或試劑盒中還包括：核酸外切酶i、單鏈結(jié)合蛋白和解旋酶。

作為本申請(qǐng)的一種優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種檢測(cè)mir-21的試劑和/或試劑盒，包括：?jiǎn)捂渄na探針、上游引物、下游引物、核酸外切酶i、單鏈結(jié)合蛋白和解旋酶；

所述單鏈dna探針的序列如seqidno.1所示；所述上游引物和下游引物的序列分別如seqidno.2和seqidno.3所示。

本發(fā)明的第三方面，提供上述試劑和/或試劑盒在非疾病的診斷目的的檢測(cè)microrna中的用途。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種借助核酸外切酶i(exoi)的消化以降低背景、利用解旋酶輔助的恒溫?cái)U(kuò)增(hda)反應(yīng)以放大信號(hào)的快速檢測(cè)microrna的免標(biāo)記熒光定量方法。

當(dāng)靶microrna(即目標(biāo)microrna)存在時(shí)，可以與單鏈dna探針的3’末端特異性結(jié)合形成microrna-dna探針異源雙鏈核酸分子，從而保護(hù)該dna探針免受核酸外切酶i(exoi)的消化，未與靶microrna特異性結(jié)合的單鏈dna探針則被核酸外切酶i(exoi)直接消化以降低背景信號(hào)；隨后加入的上游引物將靶microrna從microrna-dna探針雜交雙鏈上競(jìng)爭(zhēng)下來，并在dna聚合酶的作用下延伸為完整的雙鏈dna結(jié)構(gòu)；在單鏈dna結(jié)合蛋白(ssb)和解旋酶的共同作用下，此雙鏈dna通過解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。最后，以sybrgold作為熒光指示劑，短時(shí)間內(nèi)即可產(chǎn)生可用于實(shí)時(shí)定量測(cè)定的熒光信號(hào)，相比基于滾環(huán)擴(kuò)增(rca)的方法需要6-8小時(shí)的擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)間，本發(fā)明中解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)在30分鐘內(nèi)即可達(dá)到較高的擴(kuò)增效率，實(shí)現(xiàn)microrna的快速高效檢測(cè)。

(2)本發(fā)明通過使用核酸外切酶i(exoi)，消化了未特異性結(jié)合靶microrna的單鏈dna探針，大幅降低了背景信號(hào)；在解旋酶與單鏈dna結(jié)合蛋白(ssb)共同作用下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)放大信號(hào)的效率也很高；此外，結(jié)合作為熒光指示劑的sybrgold，可以產(chǎn)生用于實(shí)時(shí)定量測(cè)定的熒光信號(hào)，因此，本發(fā)明的檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度較高，檢出限低至12.8飛摩爾每升，同時(shí)具有較寬的線性范圍(100飛摩爾每升到10納摩爾每升)。

(3)本發(fā)明對(duì)探針的設(shè)計(jì)是基于沃森-克里克堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，避免了單鏈dna探針與非靶rna的非特異性結(jié)合；本發(fā)明中所使用的核酸外切酶i(exoi)基本可完全消化未特異性結(jié)合靶microrna的單鏈dna探針，避免了后續(xù)非特異性擴(kuò)增可能產(chǎn)生的干擾信號(hào)，此外，我們對(duì)各項(xiàng)反應(yīng)條件也做了細(xì)致的優(yōu)化，因此發(fā)明的檢測(cè)方法的特異性較高。

附圖說明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說明書附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。

圖1：本發(fā)明的基于依賴解旋酶dna恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)microrna的原理圖；

圖2：(a)對(duì)解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果。曲線2為50納摩爾每升的mir-21存在時(shí)的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化；曲線1為沒有mir-21存在時(shí)的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。(b)對(duì)解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)產(chǎn)物的凝膠電泳分析。泳道1是沒有mir-21時(shí)的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物表征；泳道2是有50納摩爾每升的mir-21存在時(shí)的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物表征，泳道m(xù)為dnamarker。

圖3：(a)不同mir-21濃度下的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果。(b)δpoi值與mir-21濃度對(duì)數(shù)的線性關(guān)系圖。誤差棒表示的是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖4：(a)不同種類microrna存在時(shí)核酸外切酶i(exoi)消化產(chǎn)物的凝膠電泳分析結(jié)果。泳道m(xù)是dnamarker；泳道1是1微摩爾每升的mir-21與1微摩爾每升的單鏈dna探針存在時(shí)的無酶切產(chǎn)物表征；泳道2是1微摩爾每升的mir-21與1微摩爾每升的單鏈dna探針存在時(shí)，加入20個(gè)單位核酸外切酶i的酶切產(chǎn)物表征；泳道3是1微摩爾每升的mir-141與1微摩爾每升的單鏈dna探針存在時(shí)的無酶切產(chǎn)物表征；泳道4是1微摩爾每升的mir-141與1微摩爾每升的單鏈dna探針存在時(shí)，加入20個(gè)單位核酸外切酶i的酶切產(chǎn)物表征；泳道5是1微摩爾每升的let-7a與1微摩爾每升的單鏈dna探針存在時(shí)的無酶切產(chǎn)物表征；泳道6是1微摩爾每升的let-7a與1微摩爾每升的單鏈dna探針存在時(shí)，加入20個(gè)單位核酸外切酶i的酶切產(chǎn)物表征。(b)不同種類microrna存在時(shí)δpoi值的對(duì)比圖。blank表示的是沒有任何microrna存在時(shí)的δpoi值；mir-21、mir-141和let-7a的濃度均為1納摩爾每升；誤差棒表示的是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中尚未見采用hda方法檢測(cè)microrna的報(bào)道。基于此，本發(fā)明提出了一種基于依賴解旋酶dna恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)microrna的方法。

本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思在于：首先設(shè)計(jì)了一個(gè)簡(jiǎn)單的單鏈dna探針，靶microrna可通過沃森-克里克堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與此單鏈dna探針的3’末端特異性結(jié)合形成microrna-dna探針異源雙鏈核酸分子，因?yàn)楹怂嵬馇忻竔(exoi)是一種可以由3’末端向5’末端方向高效降解單鏈dna分子的的核酸外切酶，因此靶microrna與dna探針的特異性結(jié)合會(huì)保護(hù)探針免受核酸外切酶i(exoi)的消化，未與靶microrna特異性結(jié)合的單鏈dna探針則會(huì)被外切酶i(exoi)消化以獲得較低的背景信號(hào)；隨后，上游引物的加入會(huì)將microrna從microrna-dna探針雜交雙鏈上競(jìng)爭(zhēng)下來，在dna聚合酶的作用下，上游引物與dna探針延伸為完整的雙鏈dna；接下來，在單鏈dna結(jié)合蛋白(ssb)和解旋酶的共同作用下，此雙鏈的兩端部分解旋為單鏈結(jié)構(gòu)，使得上游引物和下游引物可以同時(shí)分別與其上、下游進(jìn)行雜交結(jié)合，上、下游引物在dna聚合酶的作用下得到延伸進(jìn)而形成兩條新的雙鏈dna，這些雙鏈dna又可作為底物引發(fā)下一輪的擴(kuò)增反應(yīng)，如此往復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)指數(shù)式的擴(kuò)增，獲得大量dna雙鏈結(jié)構(gòu)。最后，以sybrgold作為熒光指示劑，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)此擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與定量。本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理圖如圖1所示。

在本申請(qǐng)的一種實(shí)施方案中，提供了一種基于依賴解旋酶dna恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)mir-21的方法，步驟如下：

(1)利用總rna提取試劑盒對(duì)樣品中的rna進(jìn)行抽提與純化；

(2)向提取的總rna中加入單鏈dna探針和過量的核酸外切酶i，在反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行孵育，實(shí)現(xiàn)mir-21與單鏈dna探針的特異性結(jié)合，利用過量的核酸外切酶i將多余的單鏈dna探針消除；

(3)向步驟(2)的反應(yīng)體系中加入上游引物、下游引物、單鏈結(jié)合蛋白和解旋酶，對(duì)mir-21進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)的溫度為60-70℃，擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間為30min；通過熒光信號(hào)檢測(cè)mir-21的表達(dá)。

步驟(2)中，所述單鏈dna探針的序列如seqidno.1所示。

步驟(2)中，所述反應(yīng)緩沖液中含有：1毫摩爾每升的二硫蘇糖醇(dtt)、1×核酸外切酶i(exoi)反應(yīng)緩沖液、20個(gè)單位的rna酶抑制劑、10毫摩爾每升的氯化鈉以及10毫摩爾每升的ph8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)緩沖液。

步驟(3)中，所述上游引物和下游引物的序列分別如seqidno.2和seqidno.3所示。

為了驗(yàn)證本發(fā)明技術(shù)方案的可行性，我們使用mir-21作為靶microrna模型進(jìn)行了原理驗(yàn)證。在使用核酸外切酶i(exoi)消化后進(jìn)行解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)，并以sybrgold作為指示劑進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。從圖2a中可以看出，mir-21存在時(shí)，熒光強(qiáng)度快速增大并在10分鐘內(nèi)達(dá)到平臺(tái)期(曲線2)；沒有mir-21時(shí)，未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)(曲線1)，這是因?yàn)闆]有mir-21存在時(shí)，所有的單鏈探針都被核酸外切酶i(exoi)完全消化為單個(gè)的核苷酸而無法啟動(dòng)后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)。我們進(jìn)一步使用2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了分析驗(yàn)證，結(jié)果如圖2b所示：在mir-21存在時(shí)，可以看到解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)產(chǎn)物的特征條帶(泳道2)，沒有mir-21時(shí)，特征條帶消失(泳道1)，說明解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)未發(fā)生，因而沒有相應(yīng)產(chǎn)物的存在。以上結(jié)果證明單鏈dna探針可以與靶microrna特異性結(jié)合并因此免受核酸外切酶i(exoi)的消化，從而進(jìn)一步引發(fā)解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)，產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)。因此本技術(shù)方案完全可行。

為了評(píng)估本發(fā)明技術(shù)方案檢測(cè)microrna的靈敏度，我們將poi值作為不同濃度microrna定量的依據(jù)(poi值是指實(shí)時(shí)定量熒光曲線最大斜率處所對(duì)應(yīng)的時(shí)間值)，使用不同濃度的mir-21作為靶microrna模型進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量分析。從圖3a可以看出，不同濃度的mir-21所對(duì)應(yīng)的poi值也不相同，隨著濃度的升高，poi值順次減小。同時(shí)，如圖3b所示，以δpoi值(在相同條件下，有靶microrna的實(shí)驗(yàn)組和無靶microrna的對(duì)照組poi值的差值為δpoi值)對(duì)mir-21濃度的對(duì)數(shù)作圖，在100飛摩爾每升到10納摩爾每升的濃度范圍內(nèi)顯示出了良好的線性關(guān)系，經(jīng)過計(jì)算可以得出檢出限為12.8飛摩爾每升(或640仄摩爾)，高出以往技術(shù)4個(gè)數(shù)量級(jí)之多，這足以說明本技術(shù)方案的檢測(cè)靈敏度之高。

為了評(píng)估本技術(shù)方案檢測(cè)某種特定microrna時(shí)的特異性，我們使用mir-21作為靶microrna，mir-141及l(fā)et-7a作為非靶microrna對(duì)照進(jìn)行了特異性實(shí)驗(yàn)。我們首先使用2％的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)mir-21、mir-141、let-7a分別存在時(shí)核酸外切酶i(exoi)的消化產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果如圖4a所示：當(dāng)mir-21存在時(shí)，其與單鏈dna探針的雜交保護(hù)dna探針免受消化，結(jié)合強(qiáng)度與此前相比也沒有明顯變化(泳道1)；當(dāng)mir-141存在時(shí)，相比未酶切的對(duì)照組(泳道3)，酶切后結(jié)合強(qiáng)度有所下降(泳道4)；類似的，當(dāng)let-7a存在時(shí)，酶切后的結(jié)合強(qiáng)度(泳道6)比未酶切的對(duì)照組(泳道5)下降了很多。此后，我們又進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證，結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳一致，結(jié)果如圖4b所示：mir-21存在時(shí)的δpoi值分別為mir-141和let-7a存在時(shí)的4.07倍、9.89倍。由此可以看出，本技術(shù)方案具有很高的特異性，能夠較好地區(qū)分靶microrna與非靶microrna，可以應(yīng)用于復(fù)雜樣品的檢測(cè)。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本申請(qǐng)的技術(shù)方案。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)材料，均可通過商業(yè)渠道購(gòu)買得到。

實(shí)施例1：

細(xì)胞內(nèi)總rna的提?。喝祟愖訉m頸癌細(xì)胞(hela)的培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dmem)，放在37℃、含有5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用德國(guó)凱杰生物公司的總rna小提試劑盒(貨號(hào)74104)對(duì)細(xì)胞中的總rna進(jìn)行抽提與純化，提取與純化操作嚴(yán)格按照試劑盒所附的說明書進(jìn)行。所得總rna在使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定濃度后用于癌細(xì)胞中microrna的定量檢測(cè)。

核酸外切酶i(exoi)消化：首先配制19微升的反應(yīng)緩沖液，其中含有1毫摩爾每升的二硫蘇糖醇(dtt)、1×核酸外切酶i(exoi)反應(yīng)緩沖液、20個(gè)單位的rna酶抑制劑、10毫摩爾每升的氯化鈉以及10毫摩爾每升的ph8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)緩沖液。接下來，將待測(cè)的microrna樣品與最終濃度為1微摩爾每升的單鏈dna探針加入此反應(yīng)緩沖液中并在95℃下孵育5分鐘，而后緩慢冷卻至室溫以實(shí)現(xiàn)靶microrna與單鏈dna探針的特異性結(jié)合；此后，在上述體系中加入1微升濃度為20單位每微升的核酸外切酶i(exoi)，于37℃孵育20分鐘以消化多余的單鏈dna探針，最后在90℃水浴中停留10分鐘以使核酸外切酶i(exoi)失活而終止消化反應(yīng)。

解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)及實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定：按照說明書將美國(guó)neb公司的isoampii通用恒溫解旋酶輔助擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào)h0110s)中的試劑與5微升核酸外切酶i(exoi)的消化產(chǎn)物配制成50微升反應(yīng)混合液，除核酸外切酶i(exoi)的消化產(chǎn)物外，混合液中還含有5微升10×退火緩沖液ii、2微升100毫摩爾每升的硫酸鎂、4微升500毫摩爾每升的氯化鈉、3.5微升脫氧核糖核苷三磷酸溶液(包含等量的脫氧腺苷三磷酸、脫氧胸腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸)、1微升10微摩爾每升的上游引物和1微升10微摩爾每升的下游引物、1×sybrgold以及3.5微升酶混液(包含完成核酸擴(kuò)增所需的dna聚合酶及解旋酶等)；將此反應(yīng)混合液置于65℃的實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)中進(jìn)行解旋酶輔助的擴(kuò)增反應(yīng)(hda)，每隔30秒讀取一次熒光強(qiáng)度。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東師范大學(xué)

<120>一種基于依賴解旋酶dna恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)microrna的方法

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>102

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aatattttccaacaacgcttctgcaatcggatattggcctctcaatgctttttcgtacca60

acttatcaaatcatcctcagtcaacatcagtctgataagcta102

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tagcttatcagactgatgttgactgagg28

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<212>dna

<213>人工序列

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