強(qiáng)化植物修復(fù)土壤重金屬污染的光合菌制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是屬于一種功能性微生物制劑與農(nóng)業(yè)和環(huán)境污染治理技術(shù)領(lǐng)域，具體的說 是涉及到一種用于強(qiáng)化植物修復(fù)土壤重金屬污染的復(fù)合光合菌制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于重金屬在土壤中難降解、難遷移、危害期長(zhǎng)，土壤重金屬污染已成為國(guó)內(nèi)外普 遍關(guān)注的環(huán)境問題之一，世界各國(guó)對(duì)重金屬污染及其治理給予了高度重視。但常用的化學(xué) 和物理化學(xué)修復(fù)方法一般投資昂貴、設(shè)備復(fù)雜且易導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)破壞；而植物提取修復(fù)技 術(shù)則因?yàn)槌e累植物通常矮小、生長(zhǎng)緩慢、生物量低，對(duì)固定的相的鉛、鎘無法吸收富集等 缺點(diǎn)而限制了在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0003] 生物修復(fù)是利用微生物或植物的生命代謝活動(dòng)，對(duì)土壤中的重金屬進(jìn)行富集或提 取。生物修復(fù)技術(shù)主要包括植物修復(fù)和微生物修復(fù)。植物修復(fù)是指用植物吸收土壤中的重 金屬，最終達(dá)到清除土壤中重金屬的一類技術(shù)總稱，植物修復(fù)法具有成本低，綠色凈化、不 破壞土壤生態(tài)環(huán)境、無需進(jìn)行二次處理等優(yōu)點(diǎn)，是未來修復(fù)技術(shù)的主要發(fā)展方向。用來進(jìn)行 植物修復(fù)的植物可以包括高等植物界的一切植物，如草、樹木、作物等。其中，有一類植物的 重金屬吸收明顯超過其他普通植物，即超富集植物。
[0004] 植物修復(fù)也具有一定的缺陷，例如：重金屬富集植物通常生物量低，生長(zhǎng)比較慢； 對(duì)金屬有先擇性，不適合多種重金屬?gòu)?fù)合污染的治理；植物對(duì)重金屬的吸收能力往往受到 土壤環(huán)境和氣候條件的限制；此外污染物可能通過落葉重新回到土壤中。提高重金屬的有 效性，從而提高修復(fù)效率是解決這一個(gè)問題的關(guān)鍵，這些都限制了植物修復(fù)技術(shù)在重金屬 污染土壤治理方面的應(yīng)用。為了，研究人員考慮采用多種方式來彌補(bǔ)其不足之處。近幾年， 采用重金屬抗性微生物來提升植物對(duì)重金屬的吸收能力逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，微生 物強(qiáng)化植物對(duì)重金屬的吸收，其原理主要基于以下兩個(gè)方面：一是促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收，增強(qiáng) 植物抗逆性，借助增加生物量的手段提高修復(fù)能力。如菌根真菌可以溶解轉(zhuǎn)運(yùn)土壤中的無 機(jī)礦物元素；根瘤菌進(jìn)行生物固氮等促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收；根部多種微生物的存在所形成的 穩(wěn)定根部微環(huán)境，增強(qiáng)了植物抗逆性等，這些都直接或間接地增加了植物的生物量，提高了 植物修復(fù)能力。二是增加植物根部重金屬濃度，促進(jìn)重金屬的吸收或固定。微生物不僅通 過其自己身的組成成分如菌根外菌絲、幾丁質(zhì)、色素類物質(zhì)，EPS等吸附重金屬，而通過其分 泌的各種有機(jī)酸或特殊物質(zhì)來活化重金屬，增加其在植物根部濃度。通過某些植物體內(nèi)存 在的對(duì)特定重金屬具有轉(zhuǎn)運(yùn)作用的蛋白，將富集在植物根部的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)到植物體內(nèi)；或 使土壤中重金屬吸附于根際，降低其流動(dòng)性，從而減少其進(jìn)入食物鏈的可能，并且在移除植 物體時(shí)降低土壤中重金屬的濃度，借此達(dá)到植物吸收和固定的目的。因此，采用根際接種耐 鎘微生物的方式，促進(jìn)植物對(duì)鎘的吸收能力，強(qiáng)化其土壤修復(fù)效果是一種可能行的方式，具 有極大的開發(fā)潛力。
[0005] 桃紅莢硫菌與莢膜紅假單胞菌單個(gè)細(xì)胞外通常有一層粘的莢膜，為多糖物質(zhì)，能 夠耐受較高濃度的重金屬離子；桃紅莢硫菌是一種硫氧化細(xì)菌，可通過直接作用和間接 作用兩種方式對(duì)重金屬活性產(chǎn)生影響：通過其分泌的胞外多聚物直接吸附在金屬硫化物 (MS)表面，通過細(xì)胞內(nèi)特有的氧化酶系統(tǒng)直接氧化金屬硫化物，生成可溶性的硫酸鹽：硫 與還原硫化物被微生物氧化為硫酸，降低溶液pH值，改變重金屬的有效性。
[0006] 桃紅莢硫菌與莢膜紅假單胞菌屬于光合細(xì)菌的一種，作為菌肥，桃紅莢硫菌與莢 膜紅假單日胞菌能促進(jìn)土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力，促進(jìn)作物生長(zhǎng)。如四 川大學(xué)的馮甦對(duì)紫硫細(xì)菌中的桃紅莢硫菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用進(jìn)行了研究，他認(rèn)為桃紅莢硫菌 對(duì)青菜生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用，也可明顯提高青菜的品質(zhì)。但要投入實(shí)際運(yùn)用，首要 要解決的問題是，該菌的生長(zhǎng)速度緩慢，一般要培養(yǎng)兩周以后才會(huì)有明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì)，培養(yǎng) 20-40天才能做為菌劑使用，且0D650的值不高于1，活菌含量低于1億/毫升，較長(zhǎng)的生長(zhǎng) 周期不利于大規(guī)模的應(yīng)用。而到目前為止，還未見有關(guān)桃紅莢硫菌制備方法技術(shù)方案公開。 也未見有關(guān)桃紅莢硫菌與莢膜紅假單胞菌混合發(fā)酵的技術(shù)方案公開，也未有其強(qiáng)化植物修 復(fù)土壤重金屬的技術(shù)方案進(jìn)行公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種桃紅莢硫菌與莢膜紅假單胞菌混合培養(yǎng)， 菌體生長(zhǎng)速度快，菌體含量高，培養(yǎng)時(shí)間短，菌肥活性高、穩(wěn)定性高、具有強(qiáng)化植物修復(fù)土壤 重金屬的復(fù)合光合細(xì)菌制劑及其制備方法。該復(fù)合光合菌制劑可以用于強(qiáng)化植物修復(fù)土壤 重金屬污染，桃紅莢硫菌作為硫氧化細(xì)菌，能氧化比較穩(wěn)定的重金屬的硫化物，促進(jìn)土壤硫 循環(huán)，降低土壤PH，提高重金屬在土壤中的活性，桃紅莢硫菌與莢膜紅假單胞菌作為菌肥， 能夠促進(jìn)土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，提高富集重金屬植 物的生物量，從而強(qiáng)化植物修復(fù)土壤重金屬的效率。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 采用紫硫光合細(xì)菌中的桃紅莢硫菌菌種與紫色非硫光合細(xì)菌中的莢膜紅假單胞菌按 以下步驟進(jìn)行培養(yǎng)： :、桃紅莢硫菌半固體種子活化培養(yǎng)：將桃紅莢硫菌種穿刺在半固體桃紅莢硫菌培養(yǎng) 基中，25_30°C光照培養(yǎng)7-10天，待穿刺的菌線變紅并長(zhǎng)出菌苔，即可為活化的桃紅莢硫菌 種； 〇)、莢膜紅假單胞菌平板活化：將莢膜紅假單胞菌菌種在平板上劃線活化，溫度 25-35°C活化培養(yǎng)3-5天，挑取大個(gè)菌落作為活化種子； 1?、桃紅莢硫菌種子培養(yǎng)：將活化的菌種接種至桃紅莢硫菌種子液體培養(yǎng)基中，溫度 25-35°C，光照強(qiáng)度為：1000-30001ux，光照厭氧培養(yǎng)7-10天，檢測(cè)種子的0D650彡1.2,活 菌數(shù)> 6億個(gè)/毫升即為種子培養(yǎng)液； 出、莢膜紅假單胞菌種子培養(yǎng)：將挑取大個(gè)莢膜紅假單胞菌菌落作為活化種子接種到 種子培養(yǎng)基中，溫度25-35°C，光照強(qiáng)度為：1000-30001ux，光照靜置培養(yǎng)3-5天，檢測(cè)種子 的0D660 > 2,活菌數(shù)> 15億個(gè)/毫升即為種子培養(yǎng)液； 6)、發(fā)酵培養(yǎng)：將桃紅莢硫菌種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基以I :3_1 :5的接種量接種，同 時(shí)將莢膜紅假單胞菌種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按I :10-1 :20的接種量接入，在光照培養(yǎng)罐 中厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-35°C，光照強(qiáng)度為：1000-40001ux，攪拌速度為120轉(zhuǎn)/分鐘，待 培養(yǎng)至第二天，開始流加100 g/L的硫代硫酸鈉至硫代硫酸鈉的濃度至1-2 g/L，培養(yǎng)5-7 天，待檢測(cè)其OD650 > 6,活菌數(shù)> 50億個(gè)/毫升，其中桃紅莢硫菌不低于25億/毫升，莢 膜紅假單胞菌不低于20億/毫升，即可放罐，灌裝，包裝成品。
[0009] 其中，所述的半固體桃紅莢硫菌培養(yǎng)基為：硫酸銨l_2g/L，磷酸二氫鉀0. 5-lg/L， 二水氯化鈣0. 05-0. 2g/L，硫酸鎂0. 1-0. 5g/L，醋酸鈉2-5 g/L，果糖2-5g/L，九水硫化鈉 0. Ι-lg/L，瓊脂8-10g/L，氯化鈉0. 5-4g/L，121°C滅菌15分鐘，用蘋果酸調(diào)PH至7. 0-7. 2， 其中九水硫化鈉先配制成0. lg/mL單獨(dú)滅菌 其中，所述的桃紅莢硫菌種子液體培養(yǎng)基為：硫酸銨l_2g/L，磷酸二氫鉀0. 5-lg/L， 二水氯化鈣0. 05-0. 2g/L，硫酸鎂0. 1-0. 5g/L，醋酸