本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段鑒定中藥的方法，具體為一種用于鑒定中藥龍葵的引物對(duì)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，具有高發(fā)病率、高死亡率、低治愈率等特點(diǎn)。目前臨床上主要治療模式是以手術(shù)為主，結(jié)合化療、放療、靶向治療、中醫(yī)藥治療的綜合治療方法。全國(guó)名老中醫(yī)藥專(zhuān)家運(yùn)用中藥灌腸方治療腸癌，療效顯著，龍葵作為灌腸方的主要組成藥物之一，具有清熱解毒、利水消腫的功效，其活性單體澳洲茄胺亦是灌腸方的主要有效成分，發(fā)揮了重要的抗腫瘤作用。澳洲茄胺是來(lái)源于茄屬植物的一種甾體生物堿，在我國(guó)主要存在于龍葵的全草中，具有多種藥理活性，其抗腫瘤活性是目前研究的熱點(diǎn)之一。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，澳洲茄胺對(duì)腸癌細(xì)胞，肝癌細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞，宮頸癌細(xì)胞，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，但其作用機(jī)制尚未明確。
不同研究學(xué)者分別采用高效液相色譜法、近紅外光譜法、紫外光譜法等對(duì)不同來(lái)源的龍葵進(jìn)行鑒定，但這些方法比較繁瑣，不利于推廣。近年來(lái)發(fā)展的以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法如位點(diǎn)特異性pcr等克服了藥材傳統(tǒng)鑒別方法克服了藥材傳統(tǒng)鑒別方法準(zhǔn)確度不高、主觀性大等缺點(diǎn)。對(duì)龍葵之間的分子特異性鑒別還尚未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種能夠特異性鑒別龍葵的方法，本發(fā)明提供了一種用于鑒定中藥龍葵的引物對(duì)及其應(yīng)用。
技術(shù)方案：一種用于鑒定中藥龍葵的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
優(yōu)選的，所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為40bp，序列為seqidno.7。
表1引物對(duì)及發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列
所述引物對(duì)在制備鑒定中藥龍葵試劑盒中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。
優(yōu)選的，所述試劑盒鑒定中藥龍葵的步驟包括：
(1)提取龍葵樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋100～1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
優(yōu)選的，所述龍葵樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
有益效果：(1)本發(fā)明對(duì)引物對(duì)進(jìn)行修飾后能夠快速、準(zhǔn)確鑒別龍葵，為實(shí)現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)用提供技術(shù)支撐；(2)本發(fā)明所述引物對(duì)特異性好，靈敏度高。
附圖說(shuō)明
圖1是實(shí)施例1～3pcr鑒定結(jié)果電泳圖；
其中m為分子量為2000的maker；b1為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；b2為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；b3為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種用于鑒定中藥龍葵的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為40bp，序列為seqidno.7。
所述引物對(duì)在制備鑒定中藥龍葵試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。
所述試劑盒鑒定中藥龍葵的步驟包括：
(1)提取龍葵樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述龍葵樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法。
所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
實(shí)施例2
一種用于鑒定中藥龍葵的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為40bp，序列為seqidno.7。
所述引物對(duì)在制備鑒定中藥龍葵試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。
所述試劑盒鑒定中藥龍葵的步驟包括：
(1)提取龍葵樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述龍葵樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法。
所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
實(shí)施例3
一種用于鑒定中藥龍葵的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為40bp，序列為seqidno.7。
所述引物對(duì)在制備鑒定中藥龍葵試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。
所述試劑盒鑒定中藥龍葵的步驟包括：
(1)提取龍葵樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述龍葵樣品的基因組dna的提取方法是ctab法。
所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
如圖1所示，將實(shí)施例1～3的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，條帶清晰可見(jiàn)，產(chǎn)物單一。
sequencelisting
<110>蘇州市李良濟(jì)健康產(chǎn)業(yè)有限公司
<120>一種用于鑒定中藥龍葵的引物對(duì)及其應(yīng)用
<130>
<160>7
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
ggccaaccgcgagaagat18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
cgtcaccggagtccatca18
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
tttgcttcagggtttcatcc20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gccactcggaaaaagaccta20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
ttctcaaggaccaccgcatc20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
gccaagtctggctcgttctc20
<210>7
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40