本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測(cè)致病菌的方法，具體為一種用于檢測(cè)草莓炭疽病菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
草莓炭疽病由真菌半知菌亞門毛盤孢屬草莓炭疽菌侵染所致，草莓炭疽病的有性階段為子囊菌亞門小叢殼屬。病菌以分生孢子在發(fā)病組織或落地病殘?bào)w中越冬，同時(shí)，在田間能夠分生孢子借助雨水及帶菌的操作工具、病葉、病果等進(jìn)行傳播。
草莓炭疽菌的侵染最適條件為：氣溫為28～32℃，相對(duì)濕度在90％以上，是典型的高溫高濕型病菌。5月下旬后，當(dāng)氣溫上升到25℃以上，草莓匍匐莖或近地面的幼嫩組織易受病菌侵染；7～9月間在高溫高濕條件下，病菌傳播蔓延迅速，特別是連續(xù)陰雨或陣雨2～5天或臺(tái)風(fēng)過(guò)后的草莓連作田、老殘葉多、氮肥過(guò)量、植株幼嫩及通風(fēng)透光差的苗地發(fā)病嚴(yán)重，可在短時(shí)間內(nèi)造成草莓毀滅性的損失。近幾年來(lái)，該病的發(fā)生有上升趨勢(shì)，尤其是在草莓連作地，給培育壯苗帶來(lái)了嚴(yán)重障礙。
現(xiàn)有草莓炭疽病的防治方法均是采用藥劑進(jìn)行噴灑，如嘧菌酯和嘧酰胺等。這種治療方式不僅效果較差；同時(shí)多頻次、多劑量施用后易造成草莓炭疽病菌產(chǎn)生較高程度的耐藥性，從而導(dǎo)致草莓炭疽病的防治失敗。因此，草莓炭疽病的防治還需盡早在幼苗期發(fā)現(xiàn)，避免其傳播為主。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種能夠準(zhǔn)確檢測(cè)幼苗期草莓炭疽病的方法，有效防治草莓炭疽病的傳播和蔓延，降低草莓耐藥性，本發(fā)明提供了一種一種用于檢測(cè)草莓炭疽病菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
技術(shù)方案：一種用于檢測(cè)草莓炭疽病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾。
表1分子標(biāo)記序列
所述的分子標(biāo)記在制備檢測(cè)草莓炭疽病菌試劑盒中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
優(yōu)選的，所述試劑盒檢測(cè)草莓炭疽病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20～50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
優(yōu)選的，所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。
優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。
有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標(biāo)記能夠針對(duì)幼苗期的草莓，準(zhǔn)確檢測(cè)幼苗炭疽病菌的感染情況；(2)本發(fā)明所述分子標(biāo)記具有檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)成本低和高通量的優(yōu)點(diǎn)；(3)本發(fā)明所述分子標(biāo)記特異性好、靈敏度高、結(jié)果重現(xiàn)性好。
附圖說(shuō)明
圖1是實(shí)施例1～3檢測(cè)結(jié)果圖；
其中，m為分子量為2000bp的maker；1為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；2為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；3為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種用于檢測(cè)草莓炭疽病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾。
所述的分子標(biāo)記在制備檢測(cè)草莓炭疽病菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測(cè)草莓炭疽病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。
實(shí)施例2
一種用于檢測(cè)草莓炭疽病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾。
所述的分子標(biāo)記在制備檢測(cè)草莓炭疽病菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測(cè)草莓炭疽病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋300倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋30倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。
實(shí)施例3
一種用于檢測(cè)草莓炭疽病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾。
所述的分子標(biāo)記在制備檢測(cè)草莓炭疽病菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測(cè)草莓炭疽病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。
sequencelisting
<110>蘇州蔻美新材料有限公司
<120>一種用于檢測(cè)草莓炭疽病菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
<130>
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
cggtgacataatactgagag20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gggcaagttaggcgtagcag20
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gcgatctctggaatcaata19
<210>4
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
ccgtatgacgctgaagtca19
<210>5
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
ggacatcagcaaggagaa18
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
ggtacaactgtccatcctgaa21