本發(fā)明屬于基因工程與酶工程領(lǐng)域，涉及一種用于催化合成辛伐他汀的?；D(zhuǎn)移酶及其突變體。

背景技術(shù)：

辛伐他汀，商品名為舒降之（zocor），英文名為simvastatin，辛伐他汀是他汀類（statin）的降血脂藥物，為羥甲基戊二酰輔酶a（hmg-coa）還原酶抑制劑，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，為血脂調(diào)節(jié)劑。文獻(xiàn)資料表明，有降低高脂血癥家兔血清、肝臟、主動(dòng)脈中總膽固醇（tc的含量，）降低極低密度脂蛋白膽固醇（vldl-c），低密度脂蛋白膽固醇（ldl-c）水平的作用。臨床用于治療高膽固醇血癥、冠心病，控制血液中蛋白醇的含量以及預(yù)防血管疾病。

辛伐他汀由美國默克公司開發(fā)，該品于1988年首次上市，1991年12月獲美國fda批準(zhǔn)。2000年美國默克的舒降之（zocor）在全球銷售榜上排在第二名，銷售額為52.8億美元，2001年達(dá)到66.7億美元的巔峰，2002年為55.8億美元，具有巨大的市場需求。

目前工業(yè)界生產(chǎn)辛伐他汀的方法主要為化學(xué)合成法，發(fā)酵法和生產(chǎn)轉(zhuǎn)化法，主要中間體可以通過發(fā)酵獲得紅麴素j（又稱紅曲素、monacolinj，cas號：132748-10-8）。

化學(xué)合成法，由中間體紅麴素j（又稱紅曲素、monacolinj）出發(fā)，通過化學(xué)催化的保護(hù)、脫保護(hù)、水解、酯化等一系列反應(yīng)獲得辛伐他汀，顯而易見的是，該類方法受限于步驟繁多，試劑種類多消耗大，產(chǎn)品分離復(fù)雜等缺陷，并非生產(chǎn)辛伐他汀的最佳方法。

發(fā)酵法主要采用構(gòu)建的基因工程改造的土曲霉菌株，采用發(fā)酵法生產(chǎn)辛伐他汀，但辛伐他汀的產(chǎn)量與傳統(tǒng)的發(fā)酵方法比較并沒有表現(xiàn)出明顯的效果。

生物轉(zhuǎn)化法，目前利用已有的商品化酯酶催化的反應(yīng)區(qū)域選擇性較低，仍然會造成反應(yīng)的產(chǎn)物的純化步驟復(fù)雜等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上問題，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種催化合成辛伐他汀的?；D(zhuǎn)移酶。

本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種編碼所述催化合成辛伐他汀的?；D(zhuǎn)移本科的核苷酸序列。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種催化合成辛伐他汀的酰基轉(zhuǎn)移酶的突變體。

本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種編碼所述催化合成辛伐他汀的酰基轉(zhuǎn)移酶的突變體的核苷酸序列。

本發(fā)明第五個(gè)目的是提供一種制備催化合成辛伐他汀的酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的方法。

本發(fā)明第六個(gè)目的是提供采用酰基轉(zhuǎn)移酶催化合成辛伐他汀的方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下：

一種催化合成辛伐他汀的?；D(zhuǎn)移酶，所述?；D(zhuǎn)移酶為seqidno：2所示的氨基酸序列。

一種如上述的催化合成辛伐他汀的?；D(zhuǎn)移酶，其核苷酸序列如seqno：1所示。

一種如上述的催化合成辛伐他汀的?；D(zhuǎn)移酶的突變體，該突變體的氨基酸序列如seqidno.4所示；與氨基酸序列seqidno.2相比，在所述氨基酸序列seqidno：4中攜帶d161n、y163f、g180s、a235s四個(gè)突變體；其中，d161n代表第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成天冬酰胺，y163f代表第163位氨基酸殘基從酪氨酸變成苯丙氨酸，g180s代表第180位氨基酸殘基從甘氨酸變成絲氨酸，a235s代表第235位氨基酸殘基從丙氨酸變成絲氨酸。

根據(jù)上述催化合成辛伐他汀的?；D(zhuǎn)移酶的突變體，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

一種制備上述催化合成辛伐他汀的?；D(zhuǎn)移酶突變體的方法，包括如下步驟：

（1）首先構(gòu)建?；D(zhuǎn)移酶的基因工程菌株，將全基因合成的seqidno：1核苷酸序列的生物酶基因片段克隆到高效表達(dá)載體中pet29a（+），構(gòu)建酰基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌株，將該?；D(zhuǎn)移酶經(jīng)酶切重組到表達(dá)載體pet29a（+），轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞bl21（de3）中；

（2）將陽性克隆挑入lb液體培養(yǎng)基中活化后轉(zhuǎn)入lb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，最后經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體細(xì)胞；

（3）破碎菌體細(xì)胞，得到所述的?；D(zhuǎn)移酶。

作為優(yōu)選，所述的酶切重組為以引物f1和r1分別為正反向引物，進(jìn)行易錯(cuò)pcr，構(gòu)建突變體庫，該引物核苷酸序列如下：f1:5'-ggaattccatatgcaggatatcgaac-3'；r1：5'-cccaagctttcagtcgttgcgcagt-3'，該引物兩端分別帶有ndei和hindiii限制性酶切位點(diǎn)。

一種采用上述酰基轉(zhuǎn)移酶制備辛伐他汀的方法：步驟包括：

（1）合成辛伐他汀側(cè)鏈：向反應(yīng)釜中加入3-巰基丙酸甲酯、乙酸乙酯、三乙胺、上述制備的?；D(zhuǎn)移酶；開啟攪拌，降溫至0～5℃，滴加2,2-二甲基丁酰氯，合成辛伐他汀側(cè)鏈；

（2）?；D(zhuǎn)移酶催化合成反應(yīng)：向反應(yīng)釜中加入莫那克林酸、上述步驟中所述的辛伐他汀側(cè)鏈、酸性溶液，控制反應(yīng)體系ph值在9.0～10.0；加入上述的?；D(zhuǎn)移酶，溫度控制在25～45℃，攪拌反應(yīng)48～60h；將反應(yīng)液過濾；過濾完畢，溫度控制在30～50℃，減壓，真空度≤-0.09mpa，干燥，得中間體；

（3）辛伐他汀粗品制備：將上述步驟制得的中間體加入二氯甲烷中溶解；溫度控制在0～25℃下，往濾液中滴加入二氯甲烷與甲烷磺酸混合溶液；滴加完畢，溫度控制在0～25℃攪拌1～4h；反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液溫度調(diào)至25～45℃，減壓濃縮至固體，得到辛伐他汀粗品。

作為優(yōu)選，所述酸性溶液為鹽酸、硫酸、醋酸中的一種。

有益的效果：本發(fā)明采用新型?；D(zhuǎn)移酶的生物酶活為野生型酶的12倍，合成轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%。該?；D(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性更好，活性高，將該酶應(yīng)用于生產(chǎn)辛伐他汀，而且反應(yīng)環(huán)境友好，生產(chǎn)成本低，轉(zhuǎn)化時(shí)間短、工藝操作簡單，反應(yīng)體系雜質(zhì)含量低，提高產(chǎn)率，易后處理，具有大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的廣泛前景。

具體實(shí)施方法

實(shí)施例1?；D(zhuǎn)移酶的篩選

以已報(bào)道的酰基轉(zhuǎn)移酶lovd（來源于a.terreus）為模板，在ncbi上進(jìn)行blast比對，從中選擇相似性在40-70%之間的序列來進(jìn)行基因合成和誘導(dǎo)表達(dá)，并用于辛伐他汀的酶法篩選。篩選體系如下：反應(yīng)體系（底物濃度1g/l）

成功篩選到一個(gè)可用于辛伐他汀酶法合成的酶，該酶為來源于fungalsp.no.14919的某一未知蛋白，其編碼核苷酸序列如seqno：2所示，編碼的氨基酸序列如seqno：1所示。

然而該酶的反應(yīng)活性較低，需要進(jìn)行定向進(jìn)化來滿足工業(yè)化應(yīng)用需求。

實(shí)施例2、突變體庫的建立

以全基因合成的表達(dá)質(zhì)粒（由常州基宇生物技術(shù)有限公司合成，質(zhì)粒上克隆有編碼seqidno：1所示的氨基酸序列、seqidno：2所示的核苷酸序列）為模板，以引物f1和r1分別為正反向引物，進(jìn)行易錯(cuò)pcr，構(gòu)建突變體庫。

引物序列如下：f1:5'-ggaattccatatgcaggatatcgaac-3'；r1：5'-cccaagctttcagtcgttgcgcagt-3'，兩端分別帶有ndei和hindiii限制性酶切位點(diǎn)。

易錯(cuò)pcr反應(yīng)體系如下：10*pcrbuffer2.5μl，10mmdgtp0.5μl，10mmdttp0.5μl，10mmdctp2.5μl，10mmdatp2.5μl，1mmmncl22.5μl，55mmmgcl22.5μl，10μmf11μl，10μmr11μl，template（10ng/μl）1μl，taqdnapolymerase（5u/μl，takara）0.2μl，ddh2o補(bǔ)至25μl。

易錯(cuò)pcr在bio-radt100thermalcycler上進(jìn)行，pcr程序如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃15min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；15℃forever。

將上述pcr反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收1200bp大小的片段（具體操作見天根生化科技（北京）有限公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒操作規(guī)程），并經(jīng)限制性內(nèi)切酶ndei和hindiii酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的pet29a（+）（novagen）載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化bl21（de3）（購自天根生化科技（北京）有限公司），于37℃倒置過夜培養(yǎng)后，即得到?；D(zhuǎn)移酶突變體庫，長出的單克隆用于活性篩選。

實(shí)施例3突變體庫的活化和誘導(dǎo)表達(dá)

從上述培養(yǎng)過夜的平板上挑取單克隆至裝有1ml含終濃度為50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基的96深孔板中，于37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日，從上述過夜培養(yǎng)的96空板中吸取100μl培養(yǎng)液，加入到新鮮的1ml含終濃度為50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基的96深孔板中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)4h后，加入終濃度為1mm的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，隨后在30℃繼續(xù)培養(yǎng)20h。一共挑取了400個(gè)單克隆，用于活性篩選。

將上述誘導(dǎo)后的菌液在4℃、4000rpm離心15min，棄上清。菌體用100μl50mm磷酸鈉緩沖液（ph7.0）懸浮，加入終濃度為0.5g/l的溶菌酶，于37℃處理1h，4℃、4000rpm離心30min，取50μl上清轉(zhuǎn)移至新的96孔板，用作活性篩選的模板。

實(shí)施例4hplc法測定辛伐他汀含量

色譜柱zorbaxsb-c18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇/水（梯度：75%甲醇升至95%甲醇，15min），流速1.0ml/min；檢測波長238nm；柱溫30℃。以monconlinj、dmb-s-mmp和辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品為對照。

實(shí)施例5突變體的活性篩選

在上述含50μl突變體酶上清的96孔板中，依次加入10%dmso，5mmolmonconlinj和10mmoldmb-s-mmp，于30℃反應(yīng)30min，然后在100℃處理10min滅活酶，4000rpm離心10min，取上清稀釋10倍后進(jìn)行hplc檢測，以辛伐他汀的生成量來篩選突變體，野生型酶生成的辛伐他汀作為對照。

經(jīng)hplc分析發(fā)現(xiàn)，有1個(gè)突變體的辛伐他汀的生成量要明顯高于野生型對照，該突變體編號為克隆280號。隨后將這個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以驗(yàn)證其活性是否顯著提高。

實(shí)施例6酶突變體的擴(kuò)大培養(yǎng)和活性驗(yàn)證

將突變體克隆280號接種到5ml含終濃度為50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基的試管中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1%比例轉(zhuǎn)接到100ml含終濃度為50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)3～4h，加入終濃度為1mm的iptg，隨后在30℃、200rpm誘導(dǎo)過夜。

誘導(dǎo)后的菌液于4℃、8000rpm離心10min，菌體用20mlph7.050mm磷酸鈉緩沖液洗滌兩次后，加入10mlph7.050mm磷酸鈉緩沖液進(jìn)行懸浮。隨后在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎（超聲功率200w，超聲3s/間歇5s，超聲10min）。超聲后的樣品在4℃、12000rpm離心20min，上清進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉用作活性檢測。

反應(yīng)條件同例5，hplc檢測條件同實(shí)施例4，凍干粉用緩沖液溶解成1mg/ml濃度，反應(yīng)體系為100ml。結(jié)果顯示，克隆280號生成的辛伐他汀的量要顯著高于野生型酶生成的產(chǎn)物的量，活性約為野生型的12倍。

隨后將這三個(gè)克隆送測序，并與野生型dpe氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)克隆280攜帶d161n、y163f、g180s、a235s四個(gè)突變（如seqidno.3所示，其基因序列如seqidno.4所示）。其中，d161n代表第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成天冬酰胺，y163f代表第163位氨基酸殘基從酪氨酸變成苯丙氨酸，g180s代表第180位氨基酸殘基從甘氨酸變成絲氨酸，a235s代表第235位氨基酸殘基從丙氨酸變成絲氨酸。

實(shí)施例7：生物酶的發(fā)酵制備

本發(fā)明所應(yīng)用

a）搖瓶發(fā)酵

搖瓶種子培養(yǎng)基成分：酵母提取物：5g/l；蛋白胨：10g/l，nacl：10g/l；卡那霉素（簡稱卡那）50ug/ml。

搖瓶種子培養(yǎng)基制備：取5g酵母粉提取物，10g蛋白胨，10gnacl，溶解在800ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph到7，用蒸餾水定容至1000ml，121℃保持15min，在121℃保持15min，溶液冷卻到60℃以下后加入卡那至終濃度50ug/ml。

發(fā)酵步驟：

取原種菌種在lb平板上劃線，37℃，倒置培養(yǎng)過夜。在平板上挑取單克隆接種于至3ml種子培養(yǎng)基（10ml試管）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)16-20小時(shí)后od600長到0.5-1。以1%接種量接種至300ml種子培養(yǎng)基（1l三角瓶）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)4-8小時(shí)后od600長到1-2。

b）發(fā)酵培養(yǎng)

培養(yǎng)基分為發(fā)酵培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基為m9培養(yǎng)基成分如下：na2hpo46g/l，kh2po43g/l，mgso4?7h2o0.246g/l，(nh4)2so42.24g/l，nacl0.5g/l，葡萄糖20g/l。

發(fā)酵培養(yǎng)基配置：na2hpo4、kh2po4、mgso4?7h2o、(nh4)2so4、nacl、葡萄糖攪拌溶解，121℃下保持30min，冷卻后待用，卡那霉素采用無菌膜過濾除菌。。然后將無菌的卡那霉素加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

流加培養(yǎng)基成分如下：葡萄糖600g/l

流加培養(yǎng)基配置：葡萄糖加水溶解，115℃保持30min，冷卻后待用。

發(fā)酵罐發(fā)酵控制

整個(gè)過程控制do20%以上，通風(fēng)比為1:1-4（vvm），發(fā)酵培養(yǎng)控溫37℃，ph7.0，培養(yǎng)8小時(shí)溶氧突變，開始補(bǔ)料，od600=30左右誘導(dǎo)，iptg終濃度為1mm，誘導(dǎo)溫度控制30℃，培養(yǎng)21小時(shí)放罐。

c）發(fā)酵液處理和酶制備

發(fā)酵完畢后，將發(fā)酵液送入離心機(jī)進(jìn)行菌液分離，濃縮菌體使用均質(zhì)機(jī)破碎，菌液濃度控制在50～200g/l，破碎壓力控制在30～60mpa，細(xì)胞破碎液離心后獲得上清，上清經(jīng)過超濾濃縮后，得到酶液，進(jìn)行凍干后，獲得?；D(zhuǎn)移酶干粉。

實(shí)施例8：酶催化合成辛伐他汀方法，包括如下步驟：

（1）合成辛伐他汀側(cè)鏈：向反應(yīng)釜中加入3-巰基丙酸甲酯、乙酸乙酯、三乙胺、上述制備的酰基轉(zhuǎn)移酶；開啟攪拌，降溫至0～5℃，滴加2,2-二甲基丁酰氯，合成辛伐他汀側(cè)鏈；

（2）?；D(zhuǎn)移酶催化合成反應(yīng)：向反應(yīng)釜中加入莫那克林酸、上述步驟中所述的辛伐他汀側(cè)鏈、酸性溶液，控制反應(yīng)體系ph值在9.0～10.0；加入上述的?；D(zhuǎn)移酶，溫度控制在25～45℃，攪拌反應(yīng)48～60h；將反應(yīng)液過濾；過濾完畢，溫度控制在30～50℃，減壓，真空度≤-0.09mpa，干燥，得中間體；

（3）辛伐他汀粗品制備：將上述步驟制得的中間體加入二氯甲烷中溶解；溫度控制在0～25℃下，往濾液中滴加入二氯甲烷與甲烷磺酸混合溶液；滴加完畢，溫度控制在0～25℃攪拌1～4h；反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液溫度調(diào)至25～45℃，減壓濃縮至固體，得到辛伐他汀粗品。

本實(shí)施例中，所述酸性溶液為鹽酸、硫酸、醋酸中的一種。

本發(fā)明采用新型?；D(zhuǎn)移酶的生物酶活為野生型酶的12倍，合成轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%。該?；D(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性更好，活性高，將該酶應(yīng)用于生產(chǎn)辛伐他汀，而且反應(yīng)環(huán)境友好，生產(chǎn)成本低，轉(zhuǎn)化時(shí)間短、工藝操作簡單，反應(yīng)體系雜質(zhì)含量低，提高產(chǎn)率，易后處理，具有大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的廣泛前景。

seqidno：1

mqdierafeqavesgqipgvvlmakdrsgakinytrcygsrtarldnapaettimevdspmrlasackiittvmamqcverkllrldedvsgilpevgnmmvlegfdsdsrprmrkpeavvtlrsllthtsgisyivehpdlmryrdlghiarpdagkvvdrynyplvsdpgrcwsygpglewagklvervtglsleeylqqnicaplgvadmtfklqqrpdmrarradmsrrdaegvprnedasyyradpedcfggmgifasprafmavlhsllakdgkllaagtietmfqpqldavceqslndeidarqqtnhggllprtgirrshglgglmilencdgmdwrrqgsmswggfpnlywcidpeagiciliafqlipwadpqcvelgcaferaiyqqlrnd

seqidno：2

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seqidno：3

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seqidno：4

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