本發(fā)明涉及一種二氫硫辛酰胺脫氫酶突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大腸桿菌，兼性異養(yǎng)，在有氧和無氧條件下均能生長。丙酮酸脫氫酶(pdh)又稱丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pdhc)，位于線粒體中，控制著碳水化合物利用的關(guān)鍵步驟，即丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a和nadh。pdh的三個組分由單個操縱子編碼，該操縱子包括調(diào)節(jié)基因(pdhr)和三個結(jié)構(gòu)基因，三個結(jié)構(gòu)基因為acee基因(編碼丙酮酸脫氫酶e1)、acef基因(編碼二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶e2)和lpd基因(編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶e3)。在厭氧條件下，大腸桿菌的細胞提取物中能檢測到pdh活性，然而，大腸桿菌體內(nèi)的pdh通常是無活性的。在有氧生長期間，糖酵解中產(chǎn)生的nadh最終被氧化，而在糖酵解過程中由葡萄糖產(chǎn)生的有機化合物用作電子受體，以維持氧化還原平衡，并且在厭氧條件下持續(xù)細菌的生長。由于兩種生長模式之間的電子受體的差異，厭氧細胞所報導(dǎo)的[nadh]/[nad+]比值遠高于好氧細胞的比值。由于nadh的抑制，厭氧大腸桿菌培養(yǎng)物中的pdh活性非常低或檢測不到其活性。進一步的研究已經(jīng)證實，pdh的nadh敏感性位于二氫硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamidedehydrogenase,lpd)中，因為只有這種酶與nad+作為底物相互作用。工業(yè)發(fā)酵旨在有氧或厭氧的條件下，微生物利用便宜的原料生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品。在厭氧發(fā)酵過程中，還原力nadh主要集中于產(chǎn)物的合成而不是被氧化，從而導(dǎo)致目標產(chǎn)物產(chǎn)量更高。例如，乳酸和琥珀酸等有機酸，二者均能通過厭氧發(fā)酵有效地產(chǎn)生。然而，乳酸和琥珀酸的最大理論得率均受nadh供應(yīng)的限制。這是因為：在厭氧條件下，由于pdh的活力受到抑制，1摩爾的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑僅能提供2摩爾的nadh；然而在好氧條件下，1摩爾的葡萄糖可以產(chǎn)生4摩爾的nadh?？梢?，足夠還原力的供應(yīng)對于獲得目標產(chǎn)物的最大理論得率是至關(guān)重要的。pdh催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a，同時伴隨一分子nadh的生成。如果pdh酶被激活，nadh的可利用度就可以得到改善，導(dǎo)致代謝通路中nadh依賴型的產(chǎn)品的產(chǎn)量增加。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種二氫硫辛酰胺脫氫酶突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)(iaa350/351/358vvv突變體蛋白)，為如下(a1)或(a2)：(a1)將二氫硫辛酰胺脫氫酶進行點突變甲和點突變乙和點突變丙得到的蛋白質(zhì)；所述點突變甲為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第350位氨基酸殘基由i突變?yōu)関；所述點突變乙為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第351位氨基酸殘基由a突變?yōu)関；所述點突變丙為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第358位氨基酸殘基由a突變?yōu)関；(a2)在(a1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)。所述標簽見表1。表1標簽的序列標簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個)rrrrrpoly-his2-10(通常為6個)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl所述二氫硫辛酰胺脫氫酶為如下(b1)或(b2)或(b3)：(b1)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b2)來源于大腸桿菌且與序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)具有90％以上同一性的蛋白質(zhì)；(b3)來源于大腸桿菌且與序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)具有90％以上同一性且具有二氫硫辛酰胺脫氫酶功能的蛋白質(zhì)。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌mg1655。編碼iaa350/351/358vvv突變體蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因為將序列表的序列2所示dna分子進行如下突變得到的dna分子：第1048-1053位核苷酸由“atcgcc”突變?yōu)榱恕癵ttgtt”，并且，第1072-1074位核苷酸由“gca”突變?yōu)榱恕癵tt”。含有所述基因的表達盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體具體可為在pet-28a(+)質(zhì)粒的多克隆位點(例如bamhi和xhoi酶切位點之間)插入序列表的序列2所示的dna分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌具體可為將以上任一所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)菌得到的重組菌。所述出發(fā)菌可為大腸桿菌，具體可為大腸桿菌bl21(de3)。本發(fā)明還保護iaa350/351/358vvv突變體蛋白作為二氫硫辛酰胺脫氫酶的應(yīng)用。本發(fā)明還保護一種丙酮酸脫氫酶復(fù)合物，其特征在于：用iaa350/351/358vvv突變體蛋白代替了丙酮酸脫氫酶復(fù)合物中的二氫硫辛酰胺脫氫酶。本發(fā)明還保護所述丙酮酸脫氫酶復(fù)合物作為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的應(yīng)用。本發(fā)明還保護一種制備iaa350/351/358vvv突變體蛋白的方法，包括發(fā)酵所述重組菌的步驟。本發(fā)明還保護一種解除二氫硫辛酰胺脫氫酶受nadh抑制的方法，包括如下步驟：將二氫硫辛酰胺脫氫酶進行點突變甲和點突變乙和點突變丙；所述點突變甲為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第350位氨基酸殘基由i突變?yōu)関；所述點突變乙為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第351位氨基酸殘基由a突變?yōu)関；所述點突變丙為將二氫硫辛酰胺脫氫酶第358位氨基酸殘基由a突變?yōu)関。為了獲得厭氧條件下目標產(chǎn)品的最大產(chǎn)量，微生物必須提供足夠的還原當量。丙酮酸脫氫酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a，同時伴隨一分子nadh的生成。然而在厭氧條件下，由于二氫硫辛酰胺脫氫酶受nadh的抑制，大腸桿菌的pdh通常是沒有活性的。本發(fā)明的發(fā)明人通過大量序列分析、結(jié)構(gòu)分析建立了容量龐大的突變蛋白庫，對多個單點突變蛋白和多點突變蛋白的酶活進行比較，尋找可以消除nadh對lpd的抑制作用(進而消除nadh對pdh的抑制)的關(guān)鍵的突變點，發(fā)現(xiàn)了一個三點突變的突變體蛋白(iaa350/351/358vvv)。與野生型蛋白以及其他突變體蛋白相比，突變體蛋白(iaa350/351/358vvv)能更有效的提高厭氧條件下pdh的活力，降低pdh對nadh抑制的敏感性。即使存在較高水平的nadh，突變體蛋白iaa350/351/358vvv也是有活性的。突變體蛋白iaa350/351/358vvv的pdh活性在nadh]/[nad+]比為0.15時是a358v突變體的6倍以上。據(jù)報道，在需氧條件下生長的大腸桿菌的細胞內(nèi)[nadh]/[nad+]比約為0.03至0.05。在這個比例下，pdh復(fù)合物保留了最大活性的幾乎90％。預(yù)計厭氧細胞的[nadh]/[nad+]比值將高于需氧細胞的濃度值得注意的是，在添加[nadh]/[nad+]比為0.15的條件下，突變體蛋白iaa350/351/358vvv的pdh的活性仍然高于沒有任何nadh添加的野生型蛋白pdh的活性。本發(fā)明提供的突變體蛋白(iaa350/351/358vvv)，對nadh抑制的敏感性降低，使得pdh在厭氧大腸桿菌培養(yǎng)物中對nadh的耐受性增加，能有效提高pdh的活性。本發(fā)明對于大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸鹽、乙醇、丁醇、1,3-丙二醇等還原化學(xué)物質(zhì)具有廣泛的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為實施例2的結(jié)果。圖2為實施例3的結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。e.colibl21(de3)：tiangen。pet-28a(+)：novagan，lausanne，switzerland。實施例1中所用的各個引物見表2。表2實施例1、重組菌的構(gòu)架一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、以大腸桿菌mg1655的基因組為模板，采用f和r組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物。2、取步驟1得到的pcr擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。3、取pet-28a(+)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi進行雙酶切，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pet-28a-lpd。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pet-28a-lpd進行結(jié)構(gòu)描述如下：在pet-28a(+)質(zhì)粒的bamhi和xhoi酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的dna分子。序列表的序列2所示的dna分子，編碼序列表的序列1所示的野生型蛋白。5、以重組質(zhì)粒pet-28a-lpd為模板，采用a358v+和a358v-組成的引物對進行單點突變，得到重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(a358v)。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(a358v)進行測序，測序結(jié)果表明：與重組質(zhì)粒pet-28a-lpd相比，重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(a358v)的差異僅在于將序列2所示dna分子第1072-1074位核苷酸由“gca”突變?yōu)榱恕癵tt”。突變后的dna分子編碼a358v突變體蛋白。6、以重組質(zhì)粒pet-28a-lpd為模板，采用ia350/351vv+和ia350/351vv-組成的引物對進行兩點突變，得到重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ia350/351vv)。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ia350/351vv)進行測序，測序結(jié)果表明：與重組質(zhì)粒pet-28a-lpd相比，重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ia350/351vv)的差異僅在于將序列2所示dna分子第1048-1053位核苷酸由“atcgcc”突變?yōu)榱恕癵ttgtt”。突變后的dna分子編碼ia350/351vv突變體蛋白。7、以重組質(zhì)粒pet-28a-lpd為模板，采用ea354/358kv+和ea354/358kv-組成的引物對進行兩點突變，得到重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ea354/358kv)。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ea354/358kv)進行測序，測序結(jié)果表明：與重組質(zhì)粒pet-28a-lpd相比，重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ea354/358kv)的差異僅在于將序列2所示dna分子第1060-1062位核苷酸由“gaa”替換為了“aaa”，并且將序列2所示dna分子第1072-1074位核苷酸由“gca”突變?yōu)榱恕癵tt”。突變后的dna分子編碼ea354/358kv突變體蛋白。8、以重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(a358v)為模板，采用ia350/351vv+和ia350/351vv-組成的引物對進行兩點突變，得到重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(iaa350/351/358vvv)。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(iaa350/351/358vvv)進行測序，測序結(jié)果表明：與重組質(zhì)粒pet-28a-lpd相比，重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(iaa350/351/358vvv)的差異僅在于將序列2所示dna分子第1048-1053位核苷酸由“atcgcc”突變?yōu)榱恕癵ttgtt”，并且將序列2所示dna分子第1072-1074位核苷酸由“gca”突變?yōu)榱恕癵tt”。突變后的dna分子編碼iaa350/351/358vvv突變體蛋白。9、以重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ea354/358kv)為模板，采用ia350/351vv+和ia350/351vv-組成的引物對進行兩點突變，得到重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(iaea350/351/354/358vvkv)。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(iaea350/351/354/358vvkv)進行測序，測序結(jié)果表明，與重組質(zhì)粒pet-28a-lpd相比，重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(iaea350/351/354/358vvkv)的差異僅在于將序列2所示dna分子第1048-1053位核苷酸由“atcgcc”突變?yōu)榱恕癵ttgtt”，并且將序列2所示dna分子第1060-1062位核苷酸由“gaa”替換為了“aaa”，并且將序列2所示dna分子第1072-1074位核苷酸由“gca”突變?yōu)榱恕癵tt”。突變后的dna分子編碼iaea350/351/354/358vvkv突變體蛋白。二、重組菌的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌wt。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(a358v)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌a358v。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ia350/351vv)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌ia350/351vv。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(ea354/358kv)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌ea354/358kv。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(iaa350/351/358vvv)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌iaa350/351/358vvv。將重組質(zhì)粒pet-28a-lpd(iaea350/351/354/358vvkv)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌iaea350/351/354/358vvkv。實施例2、野生型蛋白以及各個突變體蛋白的制備以及酶活檢測一、蛋白的表達和純化分別采用實施例1制備的各個重組菌制備n端融合有his6標簽的各個蛋白質(zhì)，具體步驟均如下：1、將重組菌接種至含30μg/ml卡那霉素的液體lb培養(yǎng)基，37℃、170rpm振蕩培養(yǎng)至od600nm值＝0.6-0.8。2、完成步驟1后，在體系中加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)并使其濃度為1mm，25℃、120rpm振蕩培養(yǎng)8小時。3、完成步驟2后，離心收集細胞。4、取步驟3得到的細胞，用結(jié)合緩沖液懸浮，然后進行超聲破碎(10％的功率，破3秒停5秒，總時間10分鐘)，然后12000g離心20分鐘，收集上清液。結(jié)合緩沖液(ph7.8)：含20mmtris-hcl、500mm氯化鈉和10mm咪唑，余量為水。5、取步驟4得到的上清液，采用鎳親和層析純化目的蛋白。鎳親和層析的柱子為：ni-agarose親和層析柱(15ml)。純化過程：①上樣2ml上清液；②用結(jié)合緩沖液洗滌3個柱體積；③用2.5ml洗脫緩沖液洗脫，收集過柱后溶液。洗脫緩沖液(ph7.8)：含20mmtris-hcl、500mm氯化鈉和300mm咪唑，余量為水。6、取步驟5得到的過柱后溶液，采用gehealthcare公司的脫鹽柱，將蛋白的溶劑體系替換為ph7.0、0.01m的pbs緩沖液，得到蛋白溶液。重組菌wt進行上述步驟得到的蛋白溶液命名為wt蛋白溶液。重組菌a358v進行上述步驟得到的蛋白溶液命名為a358v蛋白溶液。重組菌ia350/351vv進行上述步驟得到的蛋白溶液命名為ia350/351vv蛋白溶液。重組菌ea354/358kv進行上述步驟得到的蛋白溶液命名為ea354/358kv蛋白溶液。重組菌iaa350/351/358vvv進行上述步驟得到的蛋白溶液命名為iaa350/351/358vvv蛋白溶液。重組菌iaea350/351/354/358vvkv進行上述步驟得到的蛋白溶液命名為iaea350/351/354/358vvkv蛋白溶液。使用牛血清白蛋白作為標準，通過bradford方法測定各個蛋白溶液中的蛋白質(zhì)濃度。二、酶活檢測取步驟一制備的各個蛋白溶液，分別作為待測溶液，檢測其作為二氫硫辛酰胺脫氫酶的酶活。反應(yīng)體系(1.0ml)：含0.1mkh2po4、3mmnad+、nadh、3mmdl-二氫硫辛酸、1.5mmedta和待測溶液，余量為ph8.0、0.01m的pbs緩沖液。反應(yīng)體系中，設(shè)置不同的nadh濃度，0濃度即不加入nadh。反應(yīng)體系中，蛋白濃度為3mg/ml(以總濃度計)，蛋白來源為待測溶液。反應(yīng)條件：30℃靜置反應(yīng)。持續(xù)檢測340nm處吸光度(a340nm)，每10秒記一次值?！鱝340nm＝第30秒的a340nm-第10秒的a340nm。將“nadh與nad+的摩爾比為0，wt蛋白溶液作為待測溶液”這一條件下得到的△a340nm作為參照值。計算其他條件下得到的△a340nm與參照值的比值，即為lpd相對酶活。結(jié)果見圖1。圖1中，橫坐標為初始反應(yīng)體系中nadh與nad+的摩爾比。隨著nadh濃度的增高，lpd酶活逐漸被抑制。iaa350/351/358vvv突變體蛋白的活性遠高于野生型蛋白和所有其他突變體蛋白。值得注意的是，在[nadh]/[nad+]比為0.15的“苛刻”條件下，iaa350/351/358vvv突變體蛋白的活性仍然高于沒有任何nadh添加的野生型蛋白的活性。iaea350/351/354/358vvkv突變體蛋白的活性低于野生型蛋白。酶活性的一個單位定義為1mg蛋白在1min內(nèi)生成1μmolnadh。當“nadh與nad+的摩爾比為0，wt蛋白溶液作為待測溶液”時，野生型蛋白的酶活為1.51±0.03u/mg。實施例3、各個丙酮酸脫氫酶復(fù)合物對nadh抑制的敏感性為了證實iaa350/351/358vvv突變體蛋白對nadh抑制的較低敏感性轉(zhuǎn)化為整個丙酮酸脫氫酶復(fù)合物對nadh抑制的較低敏感，使用全細胞提取物測量活性。一、制備全細胞提取物分別采用實施例1制備的各個重組菌制備全細胞提取物，具體步驟均如下：1、將重組菌接種至含30μg/ml卡那霉素的液體lb培養(yǎng)基，37℃、170rpm振蕩培養(yǎng)至od600nm值＝0.6-0.8。2、完成步驟1后，在體系中加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)并使其濃度為1mm，25℃、120rpm振蕩培養(yǎng)8小時。3、完成步驟2后，離心收集細胞。4、取步驟3得到的細胞，用結(jié)合緩沖液懸浮，然后進行超聲破碎(10％的功率，破3秒停5秒，總時間10分鐘)，然后12000g離心20分鐘，收集上清液，即為全細胞提取物。重組菌wt進行上述步驟得到的全細胞提取物命名為wt全細胞提取物。重組菌a358v進行上述步驟得到的全細胞提取物命名為a358v全細胞提取物。重組菌iaa350/351/358vvv進行上述步驟得到的全細胞提取物命名為iaa350/351/358vvv全細胞提取物。二、酶活檢測取步驟一制備的各個全細胞提取物，分別作為待測溶液，檢測其作為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的酶活。初始體系(1ml)：含0.2mm焦磷酸硫胺素、0.1mmcoa、10mmmgcl2、1mmdtt、2mmnad+、nadh和待測溶液，余量為ph7.5、100mm的tris-hcl緩沖液。初始體系中，設(shè)置不同的nadh濃度，0濃度即不加入nadh。反應(yīng)體系中，蛋白濃度為3mg/ml(以總濃度計)，蛋白來源為待測溶液。向初始體系中加入丙酮酸并使其濃度為5mm以啟動反應(yīng)。反應(yīng)條件：30℃靜置反應(yīng)。持續(xù)檢測340nm處吸光度(a340nm)，每10秒記一次值?！鱝340nm＝第30秒的a340nm-第10秒的a340nm。將“nadh與nad+的摩爾比為0，wt蛋白溶液作為待測溶液”這一條件下得到的△a340nm作為參照值。計算其他條件下得到的△a340nm與參照值的比值，即為相對酶活。結(jié)果見圖2。圖2中，左上圖為初始反應(yīng)體系中nadh與nad+的摩爾比為0條件下的相對酶活，右上圖為初始反應(yīng)體系中nadh與nad+的摩爾比為0.08條件下的相對酶活，左下圖為初始反應(yīng)體系中nadh與nad+的摩爾比為0.1條件下的相對酶活，右下圖為初始反應(yīng)體系中nadh與nad+的摩爾比為0.15條件下的相對酶活。具有iaa350/351/358vvv突變體蛋白的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的活性高于具有野生型蛋白的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物以及具有a358v突變體蛋白的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物。iaa350/351/358vvv突變體蛋白能有效解除pdh對nadh的抑制敏感性。天然pdh在nadh]/[nad+]比為0.15時被完全抑制，而具有iaa350/351/358vvv突變體蛋白的pdh仍然保留參照值的約30％。酶活性的一個單位定義為1mg蛋白在1min內(nèi)生成1μmolnadh。當“nadh與nad+的摩爾比為0，wt蛋白溶液作為待測溶液”時，酶活為2.63±0.02u/mg。sequencelisting<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種二氫硫辛酰胺脫氫酶突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用<130>gncyx171347<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>474<212>prt<213>大腸桿菌<400>1metserthrgluilelysthrglnvalvalvalleuglyalaglypro151015alaglytyrseralaalapheargcysalaaspleuglyleugluthr202530valilevalgluargtyrasnthrleuglyglyvalcysleuasnval354045glycysileproserlysalaleuleuhisvalalalysvalileglu505560glualalysalaleualagluhisglyilevalpheglygluprolys65707580thraspileasplysileargthrtrplysglulysvalileasngln859095leuthrglyglyleualaglymetalalysglyarglysvallysval100105110valasnglyleuglylysphethrglyalaasnthrleugluvalglu115120125glygluasnglylysthrvalileasnpheaspasnalaileileala130135140alaglyserargproileglnleupropheileprohisgluasppro145150155160argiletrpaspserthraspalaleugluleulysgluvalproglu165170175argleuleuvalmetglyglyglyileileglyleuglumetglythr180185190valtyrhisalaleuglyserglnileaspvalvalglumetpheasp195200205glnvalileproalaalaasplysaspilevallysvalphethrlys210215220argileserlyslyspheasnleumetleugluthrlysvalthrala225230235240valglualalysgluaspglyiletyrvalthrmetgluglylyslys245250255alaproalagluproglnargtyraspalavalleuvalalailegly260265270argvalproasnglylysasnleuaspalaglylysalaglyvalglu275280285valaspaspargglypheileargvalasplysglnleuargthrasn290295300valprohisilephealaileglyaspilevalglyglnprometleu305310315320alahislysglyvalhisgluglyhisvalalaalagluvalileala325330335glylyslyshistyrpheaspprolysvalileproserilealatyr340345350thrgluprogluvalalatrpvalglyleuthrglulysglualalys355360365glulysglyilesertyrgluthralathrpheprotrpalaalaser370375380glyargalailealaseraspcysalaaspglymetthrlysleuile385390395400pheasplysgluserhisargvalileglyglyalailevalglythr405410415asnglyglygluleuleuglygluileglyleualaileglumetgly420425430cysaspalagluaspilealaleuthrilehisalahisprothrleu435440445hisgluservalglyleualaalagluvalphegluglyserilethr450455460aspleuproasnprolysalalyslyslys465470<210>2<211>1425<212>dna<213>大腸桿菌<400>2atgagtactgaaatcaaaactcaggtcgtggtacttggggcaggccccgcaggttactcc60gctgccttccgttgcgctgatttaggtctggaaaccgtaatcgtagaacgttacaacacc120cttggcggtgtttgcctgaacgtcggctgtatcccttctaaagcactgctgcacgtagca180aaagttatcgaagaagccaaagcgctggctgaacacggtatcgtcttcggcgaaccgaaa240accgatatcgacaagattcgtacctggaaagagaaagtgatcaatcagctgaccggtggt300ctggctggtatggcgaaaggccgcaaagtcaaagtggtcaacggtctgggtaaattcacc360ggggctaacaccctggaagttgaaggtgagaacggcaaaaccgtgatcaacttcgacaac420gcgatcattgcagcgggttctcgcccgatccaactgccgtttattccgcatgaagatccg480cgtatctgggactccactgacgcgctggaactgaaagaagtaccagaacgcctgctggta540atgggtggcggtatcatcggtctggaaatgggcaccgtttaccacgcgctgggttcacag600attgacgtggttgaaatgttcgaccaggttatcccggcagctgacaaagacatcgttaaa660gtcttcaccaagcgtatcagcaagaaattcaacctgatgctggaaaccaaagttaccgcc720gttgaagcgaaagaagacggcatttatgtgacgatggaaggcaaaaaagcacccgctgaa780ccgcagcgttacgacgccgtgctggtagcgattggtcgtgtgccgaacggtaaaaacctc840gacgcaggcaaagcaggcgtggaagttgacgaccgtggtttcatccgcgttgacaaacag900ctgcgtaccaacgtaccgcacatctttgctatcggcgatatcgtcggtcaaccgatgctg960gcacacaaaggtgttcacgaaggtcacgttgccgctgaagttatcgccggtaagaaacac1020tacttcgatccgaaagttatcccgtccatcgcctataccgaaccagaagttgcatgggtg1080ggtctgactgagaaagaagcgaaagagaaaggcatcagctatgaaaccgccaccttcccg1140tgggctgcttctggtcgtgctatcgcttccgactgcgcagacggtatgaccaagctgatt1200ttcgacaaagaatctcaccgtgtgatcggtggtgcgattgtcggtactaacggcggcgag1260ctgctgggtgaaatcggcctggcaatcgaaatgggttgtgatgctgaagacatcgcactg1320accatccacgcgcacccgactctgcacgagtctgtgggcctggcggcagaagtgttcgaa1380ggtagcattaccgacctgccgaacccgaaagcgaagaagaagtaa1425當前第1頁12