專利名稱：新型芳香族?；D移酶基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼具有以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為?；w，將芳香 族?；螯S酮類化合物的糖殘基轉移的活性的蛋白質的基因、并涉及編碼 具有以UDP-葡萄糖作為葡糖基供體、使葡糖基向羥基肉桂酸的1位羥基 轉移的活性的蛋白質的基因、及其利用方法。
背景技術：
在產(chǎn)業(yè)上，植物的顏色是最重要的性狀之一，如在花色的多樣化和果 實顯色的優(yōu)良、著色的穩(wěn)定化和均一化等中發(fā)現(xiàn)的那樣，其已成為花卉類、 果樹類、蔬菜類中主要的經(jīng)濟因素。植物色素中最常發(fā)現(xiàn)的為總稱為花色 素苷的化合物，累積的細胞和組織呈現(xiàn)淡藍色至深紅色的各種顏色。迄今 為止，根據(jù)各種植物種類已經(jīng)報道了近500種花色素苷，其顏色主要取決 于其化學結構?；ㄉ厥菢嫵苫ㄉ剀盏墓羌艿奶擒张浠?，但其本身并不 按原樣存在于植物體，必須以經(jīng)糖基化和酰基化等修飾的形式(花色素苷) 存在。花色素通過糖基化而形成無毒的花色素苷從而穩(wěn)定化，而且，由于 成為水溶性，就會溶解到細胞的液泡中。經(jīng)糖基化的眾多花色素苷再受到 糖基化、?；⒓谆刃揎?。特別是，?；岣咭号輧然ㄉ剀辗?子的穩(wěn)定性。另外，通過芳香族?；M行的酰基化，由于糖苷配基與芳香 族酰基的分子內結合，使得花色素苷分子的最大吸收值向長波長側移動。 因此，累積了經(jīng)芳香族?；；幕ㄉ剀盏闹参锝M織，多呈現(xiàn)紫色至 藍色系?；ㄉ剀胀ㄟ^在液泡內與芳香族酰基的分子內結合、與?；咸?糖、黃酮和黃酮醇等輔助色素或金屬離子的分子間結合、與金屬離子的配 位鍵合、與多肽的結合等形成復雜的色素高分子，從而呈現(xiàn)多樣的色彩。因此，花色素苷的?；跀U大基于花色素苷的花色的多樣性方面是重要 的化學反應中的一種。
可以直接以肉眼確認的性質-由花色素苷產(chǎn)生的發(fā)色成為許多遺傳
學、生物化學、分子生物學的研究對象，目前，正在從矮牽牛(Petunia x hybrida )、金魚草(Antirrhinum majus)、牽?；?Pharbitis nil或Ipomoea nil )、擬南芥(Arabidopsis thaliana )等花卉類和蘋果(Malus x domestica )、 葡萄(Vitis vinifera)等果實類、癡子(Solan腿melongena)、紫蘇(Perilla frutesceiis)等蔬菜類中克隆與黃酮類化合物生物合成體系相關的基因，其
且，人們正通過天然物化學和生理學分析不斷了解基于花色素苷的花色表 達的纟幾制。
已知龍膽(Gentiana spp.) 、 土耳其桔梗(Eustoma grandiflor腿)、 牽?；ā⑸焦２?Lobelia erinus)、 馬鞭草(Verbena x hybrida)、瓜 葉菊(Senecio cruentus或Pericallis cruenta )等植物種中基于花色素脊蓄 積的發(fā)色基本上是由花色素苷的糖苷配基(天竺葵色素、花青素、芍藥花 青素、翠雀素、矮牽牛苷配基、錦葵色素等)的不同引起，翠雀素類色素 的累積對表現(xiàn)藍色有效。另一方面，矮牽?；?、飛燕草(Delphinium spp.)、 蝶豆(Clitoria ternatea )等植物中花色發(fā)色的差異由與花色素結合糖和酰 基的的模式和結合數(shù)的不同造成。酰基不與花色素苷糖苷配基直接結合， 許多情況下，結合于與花色素結合的葡萄糖等糖殘基。已經(jīng)報道了結合于 三花龍膽(Gentiana triflora)的花色素苷B環(huán)的3'位葡糖基的芳香族?；?-咖啡酰基以及結合于蝶豆和山菅(Dianella spp.) 3'位和5'位葡糖基的芳 香族?；?對香豆?；诒冉Y合于3位、5位、7位的其它葡糖基的芳香族 ?；奈恢蒙吓c花色素苷糖苷配基進行分子內結合(Yoshida等人, (2000) Phytochemistry 54: 85-92、 Terahara等人，(1996) Journal of Natural Products 59: 139-144、 Bloor (2001) Phytochemistry 58: 923-927 )。因此， 可以合理推測通過芳香族?；揎椈ㄉ剀?'位和5'位的葡糖基，可以使 紫或藍系的色彩在植物體的細胞、組織、器官中表達，但還未獲得該基因?；ㄉ剀盏孽；校F(xiàn)已報道了由乙?；?、蘋果?；?T !J》基)、 丙二?；?、甲基丙二?；?、丁二?；@樣的脂肪族?；a(chǎn)生的酰基化和由 對香豆?；?、咖啡酰基、阿魏?；?、芥子酰基、對羥基苯甲?；⑽圊；?br> 這樣的芳香族?；a(chǎn)生的?；?。
作為編碼由脂肪族?；鸬幕ㄉ剀盏奶菤埢孽；幕颍?經(jīng)報道了來自于大利花(Dahlia variabilis) (Suzuki等人，(2002) Plant Physiology 13: 2142-2151、公開特許公報特開2002-233381 )、瓜葉菊
(PCT/WO96/25500 、 Suzuki等人，(2003) Plant Biotechnology 20: 229-234 )、菊花(Dendranthema x morifolium ) ( Suzuki等人，(2004) Plant Science 166: 89-96 )、馬鞭草和小野芝麻(Lamium purpureum ) ( Suzuki 等人，(2004) Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28: 87-93 )的編 碼具有以脂肪族?；鵆oA硫酯作為酰基供體將丙二?；D移到黃酮類化 合物的3位糖殘基的活性的蛋白質的基因。而且，還報道了源自西洋紅
(Salvia splendens) ( Suzuki等人，(2001) Journal of Biological Chemistry 276: 49013-49019、 Suzuki等人，(2004) Plant Journal 38: 994-1003， PCT/WO01/92536 )、深藍鼠尾草(Salvia guaranitica )、薄荷(Lavendula angustifolia )、紫蘇(PCT/JP01/04677 )的編碼具有以脂肪族酰基CoA 硫酯作為?；w將丙二酰基轉移到黃酮類化合物的5位糖殘基的活性的 蛋白質的基因。
另外，作為編碼由芳香族?；a(chǎn)生的花色素苷的糖殘基的?；幕?因，已報道了源自紫蘇、薄荷(PCT/W096/25500、 Yonekura-Sakakibara 等人，(2000) Plant Cell Physiology 41: 495-502 )、 矮牽?；?br> 芳香族?；D移到黃酮類化合物的3位糖殘基的活性的蛋白質的基因。而 且，已經(jīng)報道了源自三花龍膽(PCT/WO96/25500、 Fujiwara等人，(1998) Plant Journal 16: 421-431 ) 、 土耳其桔梗(野田等人(2001 )育種學研究 3 (別1) :61、野田等人(2002)第20回日本植物細胞分子生物學會大會 專題論文要旨集145 )的編碼具有以芳香族酰基CoA硫酯作為?；w將這些已經(jīng)獲得報道的基因克隆，具有將?；D移到花色素苷的糖殘基
上的活性的蛋白質催化以作為?；w的?；鵆oA硫酯作為底物的反應， 作為?；w，除了酰基CoA疏酯以外，現(xiàn)已報道了綠原酸和l-O-?；?
P -D-葡萄糖(Steffens (2000 ) Plant Cell 12: 1253-1255 )。
已經(jīng)用番茄(Lycopersicon esculentum )報道了作為具有以綠原酸作 為?；w轉移?；幕钚缘牡鞍踪|-綠原酸:葡糖二酸咖啡?；D移酶
(5-0-咖啡酰金雞納酸:葡糖二酸咖啡酰基轉移酶)的純化和生物化學的分 析(Strack和Gross (1990 ) Plant Physiology 92: 41-47 )。
對于具有以l-O-酰基-P -D-葡萄糖作為?；w轉移?；幕钚缘牡?白質，也有如下報道。就l-O-芥子酸酯代謝相關的膽堿芥子酰轉移酶(l-O-芥子?；?P-D-葡萄糖:膽堿l-O-芥子酰基轉移酶)而言，報道了從野蘿卜
(Rapha國sativus)和白芥(Si—s alba)的種子中對該酶進行的部分 純化和特性分析(Grawe和Strack (1986) Zeitschrift fur Naturforchung 43c: 28-33)、擬南芥(Arabidopsis thaliana )的變異體的分析和基因的克隆化
(Shirley等人，(2001) Plant Journal 28:83-94 )和使用重組蛋白質的生物化 學的分析(Shirley和Chappie (2003) Journal of Biological Chemistry 278: 19870-19877)、從油菜(Brassica napus )中進行的基因(SNG2 )的克隆 化(Milkowski等人，(2004) Plant Journal 38: 80-92 )。
就與芥子酸酯代謝相關的蘋果酸芥子酰基轉移酶(l-O-芥子?；?p -D-葡萄糖:蘋果酸l-O-芥子?；D移酶)而言，現(xiàn)已報道了在野蘿卜細胞 內的位置(Sha醒和Strack (1985) Planta 163: 563-568 )、油菜種子和實 生中酶活性的測定(Strack等人，(1990) Planta 180: 217-219 )、擬南芥和 日本油茱籽(Brassica rapa ssp. oleifera)實生和幼植物體中酶活性的測定
(Mock等人，(1992) Zeitschrift fur Naturforchung 47c: 680-682 )、自野蘿
卜胚軸的蛋白質純化和生物化學的分析(Grawe等人，(1992) Planta 187: 236-241 )、擬南芥的變異體的分析和基因(SNG1)的克隆化(Lehfeldt 等人，(2000) Plant Cell 12: 1295-1306、 PCT/WO02/04614 )、在擬南芥的葉組織的細胞中的位置(Hause等人，(2002) Planta 215: 26-32 )。
就與脂肪酸代謝相關的葡萄糖酰基轉移酶(l-O-丁酰-P -D-葡萄 糖:l-O-丁酰-P-D-葡萄糖2-0-丁酰基轉移酶)而言，現(xiàn)已報道了潘那利番 茄(Lycopercsicon pennellii)中酶活性的測定(Ghangas和Steffens (1995) Archives of Biochemistry和Biophysics 316: 370-377、 Ghangas (1999) Phytochemistry 52: 785-792)、純化和部分氨基酸序列的測定(Li等人，
(1999) Plant Physiology 121:453-460)、和基因的克隆化(Li和Steffens
(2000) PNAS 97: 6902-6907、 PCT/W097/48811)。
就與吲哚乙酸代謝相關的l-O-吲味-3-乙?；?P -D-葡萄糖:肌醇巧l味 -3-乙酰基轉移酶而言，已經(jīng)報道了源自玉米(Zeamays)的該酶的酶活性 測定(Michalczuk和Bandurski (1980) Biochemical Biophysics Research Communication 93: 588-592 )、蛋白質的純化和生物化學的特性的分析和 部分氨基酸序列的分析(Kowalczyk等人，(2003) Physiologia Plantarum 119:165-174)。
就與甜菜紅色素(betalain)生物合成相關的l-O-羥基肉桂酰-P -D-葡萄 糖類:甜茱苷配基二糖苷O-羥基肉桂?；D移酶而言，已報道了源自藜 (Chenopodium rubrum )懸浮培養(yǎng)細胞或Lampranthus sociorum花瓣中 的該酶的活性檢測(Bokern和Strack (1988 )Planta 174:101-105、 Bokern 等人，(1991) Planta 184: 261-270)、和蛋白質的純化和生物化學的特性的 分析(Bokern等人，(1992) Botanica Acta 105: 146-151)。
就與梧單寧生物合成相關的P -葡糖梧苷(l-O-培?；?P -D-葡萄糖) 依賴性梧?；D移酶而言，現(xiàn)已報道了來自火炬漆(Rhus typhina)的葉 (Niemetz和Gross (2001 ) Phytochemistry 58: 657-661、 Frohlich等人， (2002) Planta 216: 168-172 )和歐洲櫟(Quercus robur)的葉(Gross等人， (1986 ) Journal of Plant Physiology 126: 173-179 )的該酶的蛋白質的純化 和生物化學特性的分析。
這樣一來，報道了具有以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰基供體催化酰 基轉移反應的活性的蛋白質的純化、其生物化學的特性的闡明和基因的克隆化。然而，就將酰基轉移到以花色素苷為首的黃酮類化合物的糖殘基上
的l-O-?；?P-D-葡萄糖依賴性酰基轉移酶的活性的檢測而言，唯一報道 了來自胡蘿卜(Daucus carota )的培養(yǎng)細胞(Glaessgen和Seitz (1992) Planta 186: 582-585)的l-O-芥子?；?P-D-葡萄糖:花色素三糖苷芥子酰 基轉移酶，但還沒有純化具有活性的蛋白質，也沒有對基因克隆化。
專利文獻l:特開2002-233381號公才艮
專利文獻2:國際公開第001/92536號小冊子
專利文獻3:國際公開第01/72984號小冊子
專利文獻4:國際/〉開第02/04614號小冊子
專利文獻5:國際公開第97/48811號小冊子
發(fā)明的公開 發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明的i果題在于獲得編碼具有使?；螯S酮類化合物的糖殘基轉 移的活性的蛋白質的基因、優(yōu)選，編碼具有不以?；鵆oA作為?；w， 而以l-O-酰基-P-D-葡萄糖作為?；w、使芳香族?；D移到包括花色 素苷在內的黃酮類化合物的糖殘基一處或兩處以上的活性的蛋白質的基 因。通過向植物中導入本發(fā)明中獲得的編碼具有芳香族?；D移活性的蛋 白質的基因或幾乎一樣的基因，使之表達，改變累積的黃酮類化合物化合 物的種類，可以改變花色和果實等植物體的發(fā)色。另外，通過使用本發(fā)明 基因的RNAi法等進行基因表達控制，以及迄今為止報道的某些花色素苷 中導入已知的修飾酶(糖轉移酶(糖基化酶)、?；D移酶、甲基轉移酶) 的基因，使本來不存在的花色素苷在各種植物種類中生物合成，可以制成 呈現(xiàn)迄今為止還沒有的顏色的植物體。
用于解決課題的方法
技術領域：
本發(fā)明人從蝶豆的花瓣中發(fā)現(xiàn)了催化以l-O-酰基國0 -D-葡萄糖作為酰 基供體、使芳香族?；D移到花色素苷的糖殘基的反應的酶活性，以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰基供體進行純化，清楚了部分氨基酸序列。催化 編碼以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為?；w的反應的蛋白質的基因的堿基 序列與編碼絲氨酸羧肽酶(SCPase)的基因的堿基序列的同源性高，催化 以l-O-?；?P -D-葡萄糖作為酰基供體反應的蛋白質被稱為絲氨酸羧肽酶 才羊?；D移酶(SCPL-AT ) (Milkowski和Strack (2004 ) Phytochemistry 65:517-524)。然后，使用基于共同存在于SCPase和SCPL-AT的推定氨 基*列和堿基序列合成的筒并引物進行RT-PCR，擴增cDNA片段，測 定其堿基序列?；讷@得的堿基序列信息，通過cDNA文庫的篩選、cDNA 末端快速擴增(RACE)法和逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法克 隆基因的蛋白質編碼全區(qū)域，克隆全部具有純化蛋白質的部分氨基酸序列 的cDNA及其同系物。而且，同樣，從三花龍膽、山梗菜中也克隆出了 cDNA 同系物。對于獲得的克隆的功能分析，使用利用桿狀病毒和昆蟲細胞的重 組蛋白質合成體系獲得的蛋白質確認了該酶活性。本發(fā)明基于以上認識得 以完成。
也就是說，本發(fā)明提供以下〔1〕 ~ 〔19〕的內容。 〔1〕本發(fā)明的第一方面為編碼具有以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰 基供體、使芳香族?；螯S酮類化合物的糖殘基轉移的活性的蛋白質的基 因。
〔2〕本發(fā)明的第二方面為根據(jù)〔1〕所述的基因，其編碼以下的(a) (d)的蛋白質。
(a) 具有序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的M酸序列的蛋白
質、
(b) 具有序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列中添加、 缺失了 一個或多個氨基酸和/或一個或多個氨基酸被其它氨基酸替代的氨 基,列的蛋白質、
(c) 具有與序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列顯示 出20%以上的同源性的氨基#列的蛋白質、
(d) 具有與序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列顯示出70%以上的同源性的氨基絲列的蛋白質。
〔3〕本發(fā)明的第三方面為這樣的基因，其與序列編號l、 3、 5、 7、 9、 或11中所示的堿基序列表示的核酸、或編碼序列編號2、 4、 6、 8、 10、 或12中所示的氨基酸序列的核酸的一部分或全部在嚴格條件下雜交，且編 碼具有以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰基供體、使芳香族?；螯S酮類化 合物的糖殘基轉移的活性的蛋白質。
〔4〕本發(fā)明的第四方面為編碼具有以UDP-葡萄糖作為葡糖基供體、 使葡糖基向羥基肉桂酸的1位幾基轉移的活性的、源自蝶豆和山梗菜的、 合成?；w的蛋白質的基因。
〔5〕本發(fā)明的第五方面為根據(jù)〔4〕記載的基因，其編碼以下的(3)~ (d)的蛋白質。
(a) 具有序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列的蛋白質、
(b) 具有序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列中添加、缺失了 一個或多個氨基酸和/或一個或多個氨基酸被其它氨基酸替代的氨基酸序 列的蛋白質、
(c) 具有與序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列顯示出20%以 上的同源性的氨基^列的蛋白質、
(d) 具有與序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列顯示出70%以 上的同源性的氨基^列的蛋白質。
〔6〕本發(fā)明的笫六方面為這樣的基因，其與序列編號13、 15或17 中所示的堿基序列表示的核酸、或編碼序列編號14、 16、或18中所示的 氨基酸序列的核酸的一部分或全部在嚴格條件下雜交，且編碼具有以IJDP-葡萄糖作為葡糖基供體、使葡糖基向羥基肉桂酸的1位羥基轉移的活性的、 源自蝶豆和山梗菜的、合成酰基供體的蛋白質。
〔7〕本發(fā)明的第七方面為含有〔1〕 ~ 〔3〕中任一項所述的基因的載體。
〔8〕本發(fā)明的第八方面為含有〔4〕 ~ 〔6〕中任一項所述的基因的載體?！?〕本發(fā)明的第九方面為由〔7〕或〔8〕中所述的載體轉化的宿主細胞。
〔10〕本發(fā)明的第十方面為由〔1〕 ~ 〔6〕中任一項所迷的基因編 碼的蛋白質。
〔11〕本發(fā)明的第十一方面為前迷蛋白質的制造方法，其特征在于 培養(yǎng)〔9〕中所述的宿主細胞，或使之生長，然后從該宿主細胞中收集具有 以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰基供體、使芳香族酰基向黃酮類化合物的 糖殘基轉移的活性的蛋白質、或具有以UDP-葡萄糖作為葡糖基供體、使 葡糖基向羥基肉桂酸的l位羥基轉移的活性的蛋白質。
〔12〕本發(fā)明的第十二方面為使用〔1〕 ~ 〔6〕中任一項所述的基 因通過體外翻譯法制造該蛋白質的方法。
〔13〕本發(fā)明的第十三方面為導入了 〔1〕 ~ 〔6〕中任一項所述的 基因、或者〔7〕或〔8〕中所述的載體的經(jīng)轉化植物。
〔14〕本發(fā)明的第十四方面為具有與〔13〕中所述的植物相同性質 的該植物的后代。
〔15〕本發(fā)明的第十五方面為〔13〕中所述的植物或〔14〕中所述 的該植物的后代的組織。
〔16〕本發(fā)明的第十六方面為〔13〕中所述的植物或〔14〕中所述 的該植物的后代的切花。
〔17〕本發(fā)明的第十七方面為以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰基供 體、使芳香族?；螯S酮類化合物的糖殘基轉移的方法，其通過向植物或 植物細胞中導入〔1〕 ~ 〔3〕中任一項所述的基因、或〔7〕中所述的載體, 使該基因表達。
〔18〕本發(fā)明的第十八方面為調節(jié)植物體的花色的方法，該方法通 過向植物或植物細胞中導入〔1〕 ~ 〔6〕中任一項所述的基因、或者〔7〕 或〔8〕中所述的載體，使該基因表達。
〔19〕本發(fā)明的第十九方面為通過在具有〔1〕 ~ 〔6〕中任一項所以下、對本發(fā)明詳細進行說明。 (1)基因
(l-l)笫一個基因
本發(fā)明的第一個基因為編碼具有以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為?；?供體、使芳香族酰基向黃酮類化合物的糖殘基轉移的活性的蛋白質的基因。
作為本發(fā)明的第一個基因，可以例舉，例如以下的(A) ~ (D)的 基因。
(A )編碼具有序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基, 列且具有上述酰基轉移酶活性的蛋白質的基因。
其中，所謂"具有序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸 序列"不僅指僅由序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列 構成的蛋白質，還包括在此類蛋白質的N末端或C末端側添加了多個氨基 酸的蛋白質。添加的氨基酸的個數(shù)只要是不使上述?；D移活性喪失的范 圍即可，并沒有特別的限定，但通常為400個以內，優(yōu)選50個以內。
(B )編碼具有序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基^ 列中添加、缺失了 一個或多個氨基酸和/或一個或多個氨基酸被其它氨基酸 替代的氨基酸序列，且具有上述?；D移酶活性的蛋白質的基因。
這種具有添加、缺失、替代的氨基酸序列的蛋白質可以是天然的，也 可以是人工的蛋白質。添加、缺失、替代的氨基酸的個數(shù)只要在不使上述 ?；D移酶活性喪失的范圍內即可，并沒有特別的限定，通常為20個以內， 優(yōu)選5個以內。
(C )具有與序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列 顯示出一定以上的同源性的氨基酸序列，且具有上述?；D移酶活性的基 因。
其中所謂"一定以上的同源性"通常是指20%以上的同源性、優(yōu)選50 %以上的同源性、更優(yōu)選60%以上的同源性、最優(yōu)選70%以上的同源性。 (D )與序列編號1、 3、 5、 7、 9、或11中所示的堿基序列表示的核 酸、與編碼序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列的核酸的一部分或全部在嚴格條件下雜交且編碼具有上述?；D移酶活性的蛋白 質的基因。
其中所謂"核酸的一部分，，是指，例如編碼共有序列區(qū)域的6個以上 氨基酸序列的部分等。所謂"嚴格條件"是指，只發(fā)生特異的雜交，而不 發(fā)生非特異的雜交的條件，例如溫度為50°C、鹽濃度為5xSSC (或與其 同等的鹽濃度)這樣的條件。再者，適當?shù)碾s交溫度根據(jù)核酸的堿基序列 及該核酸的長度而有所不同，例如以由編碼6個氨基酸的18個堿基構成的 DNA片段作為探針時，優(yōu)選50'C以下的溫度。
作為通過這樣的雜交選擇出的基因，可以列舉天然的基因，例如植物 來源的基因，尤其是蝶豆、山梗菜、龍膽來源的基因。另外，通過雜交選 棒出的基因可以是cDNA，也可以U因組DNA。
上述基因中天然存在的基因如后述實施例所示可以通過cDNA文庫的 篩選等獲得。而且，不存在于自然界的基因，可以通過利用位點特異性誘 變法及PCR法等獲得。 (1-2)第二個基因
本發(fā)明的第二個基因為編碼具有以IJDP-葡萄糖作為葡糖基供體、使 葡糖基向羥基肉桂酸的l位羥基轉移的活性的、源自蝶豆和山梗菜的、合 成?；w的蛋白質的基因。
作為本發(fā)明的第二個基因，可以列舉例如以下的(E) ~ (H)的基因。
(E )具有序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列，且編碼具 有上述葡糖基轉移活性的蛋白質的基因。
其中所謂"具有序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列"不僅 指僅由序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列構成的蛋白質，還包 括在此類蛋白質的N末端或C末端側上添加了多個氨基酸的蛋白質。添加 的氨基酸的個數(shù)只要在不使上述葡糖基轉移活性喪失的范圍內即可，并沒 有特別的限定，但通常在400個以內，優(yōu)選50個以內。
(F )編碼具有序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列中添加、缺失了 一個或多個氨基酸和/或一個或多個氨基酸被其它氨基酸替代的氨 基^列，且具有上述葡糖基轉移活性的蛋白質的基因。
這種具有添加、缺失、替代的氨基酸序列的蛋白質可以是天然的蛋白 質，而且也可以是人工的蛋白質。添加、缺失、替代的氨基酸的個數(shù)只要 在不使上述葡糖基轉移活性喪失的范圍內即可，并沒有特別的限定，但通
常為20個以內，優(yōu)選5個以內。
(G )具有與序列編號14、 16、或18中所示的氨基^列顯示出一 定以上的同源性的氨基酸序列且具有上述葡糖基轉移活性的基因。
其中所謂"一定以上的同源性，，通常是指20%以上的同源性、優(yōu)選50 Q/o以上的同源性、更優(yōu)選60%以上的同源性、最優(yōu)選70%以上的同源性。 (H )與序列編號13、 15或17中所示的堿基序列表示的核酸、或編 碼序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列的核酸的一部分或全部在 嚴格條件下雜交并且編碼具有上述葡糖基轉移活性的蛋白質的基因。其中 所謂"核酸的一部分，，是指，例如編碼共有序列區(qū)域的6個以上氨基酸序列 的部分等。所謂"嚴格條件"是指，只發(fā)生特異的雜交，而不發(fā)生非特異 的雜交的條件，例如溫度為50°C、鹽濃度為5xSSC (或與其同等的鹽濃 度)這樣的條件。再者，適當?shù)碾s交溫度根據(jù)核酸的堿基序列及該核酸的 長度而有所不同，例如以由編碼6個氨基酸的18堿基構成的DNA片段作 為探針時，優(yōu)選50'C以下的溫度。
作為通過這樣的雜交選擇出的基因，可以列舉天然的基因，例如植物 來源的基因，尤其是蝶豆、山梗菜、龍膽來源的基因。另外，通過雜交選 擇出的基因可以是cDNA，也可以U因組DNA。
上述基因中天然存在的基因如后述實施例所示可以通過cDNA文庫的 篩選等獲得。而且，不存在于自然界的基因，可以通過利用位點特異性誘 變法及PCR法等獲得。 (2)載體
本發(fā)明的載體可以通過向已知的表達載體中插入(1)的基因來制備。 其中使用的已知的表達載體只要是含有適當?shù)膯幼印⒔K止子、復制起點等的載體即可，并沒有特別的限定。啟動子如果是使基因在例如細菌
中表達的啟動子，可以使用trc啟動子、tac啟動子、lac啟動子等，如果 是使基因在酵母中表達的啟動子，則可以使用甘油醛3-磷酸脫氫酶啟動子、 PH05啟動子等，如果是使基因在絲狀真菌中表達的啟動子，可以使用淀 粉酶啟動子、trpC啟動子等，如果是使基因在動物細胞中表達的啟動子， 可以使用SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、多角體蛋白啟動子等。
(3) 經(jīng)轉化的宿主細胞
所謂本發(fā)明中經(jīng)轉化的宿主細胞是指由(2)的載體轉化的宿主細胞。 宿主細胞可以是原核生物、真核生物中的任意一種。作為原核生物， 可以使用例如大腸桿菌(Escherichia coli )、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ) 等。作為真核生物，除了酵母、絲狀真菌等之外，還可以使用動物和植物 的培養(yǎng)細胞。作為酵母，可以歹寸舉酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 巴斯德畢赤酵母(Pichia patoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica )、 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等，作為絲狀真菌，可以列 舉米曲霉(Aspergillus oryzae)、 黑曲霉(Aspergillus niger)等，作為動 物細胞，可以列舉小鼠(Mus musculus)、中國倉鼠(Cricetulus griseus) 等嚙齒類、猴、人(Homo sapiens)等靈長類、非洲爪蟾等兩棲類、家蠶 (Bombyx mori )、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )、黑腹果蠅 (Drosophila melonogaster)等昆蟲。
通過(2)的載體轉化的方法沒有特別的限定，可以按照常規(guī)的方法進行。
(4) 蛋白質
上述(l)的基因編碼的蛋白質也包含于本發(fā)明中。這種蛋白質可以通 過例如后述的(5)的方法制造。
(5) 蛋白質的制造方法
技術領域：
本發(fā)明的蛋白質的制造方法的特征在于培養(yǎng)(3)的宿主細胞，或使 之生長，然后從該宿主細胞中收集具有以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰基 供體、使芳香族酰基向黃酮類化合物的糖殘基轉移的活性的蛋白質、或具有以UDP-葡萄糖作為葡糖基供體、使葡糖基向羥基肉桂酸的1位羥基轉 移的活性的、源自蝶豆和山梗菜的、合成酰基供體的蛋白質，或者通過體 外翻譯法等進行蛋白質的制造。宿主細胞的培養(yǎng)或生長，可以按照適應所 述宿主細胞的種類的方法進行。蛋白質的收集可以按照常規(guī)方法進行，例 如，通過從培養(yǎng)細胞或培養(yǎng)基等中過濾、離心分離、細胞的破碎、凝膠過 濾層析、離子交換層析、親和層析、疏水層析等進行回收、純化，可以獲 得目的蛋白質。
(6) 植物
本發(fā)明的植物為導入了上述(l)的基因或(2)的栽體的經(jīng)轉化植物。 作為基因等的導入對象的植物沒有特別的限制，可以列舉，例如薔薇 科植物、菊、瓜葉菊、金魚草、仙客來、蘭、土耳其桔梗、洋水仙、大丁 草、唐菖蒲、霞草、長壽花、百合、天竺葵屬植物、老鸛草、矮牽牛、郁 金香、山梗菜、夏堇、稻、大麥、小麥、油菜籽、馬鈴薯、番茄、白楊、 香蕉、桉樹、紅薯、大豆、紫花苜蓿、白羽扇豆、玉米、花椰菜、山梗菜、 蘋果、葡萄、桃、柿、梅、柑橘類等。
(7) 植物的后代
上述(6)的植物的后代也包含于本發(fā)明中。
(8) 植物等的組織
上述(6)的植物或(7)的植物的后代的細胞、組織、器官也包含于 本發(fā)明中。
(9 )植物等的切花
上述(6)的植物或(7)的植物的后代的切花也包含于本發(fā)明中。
(10) 芳香族?；霓D移方法
通過向植物或植物細胞中導入上述(l-l)的基因或(2)的載體(含 有第一個基因的載體)，使該基因表達，以l-O-?；?p-D-葡萄糖作為酰 基供體、使芳香族?；螯S酮類化合物的糖殘基轉移的方法也包含于本發(fā) 明中。
(11) 花色的調節(jié)方法本發(fā)明的花色的調節(jié)方法為通過向植物或植物細胞中導入上述(1 )的
基因或(2)的載體使該基因表達，或通過在具有上述(1)的基因的植物 中，抑制該基因的表達來調節(jié)植物體的花和果實的色彩。對作為基因導入 的對象的植物沒有特別的限制，可以使用例如上述(6)中例舉的植物。而 且，作為(1)的基因的抑制對象的植物只要是具有(1)的基因的植物即 可，并沒有特別的限定。
(1)的基因的導入和表達可以按照常規(guī)方法進行。另外，(1)的基 因的表達抑制也可以按照常規(guī)方法(例如反義法或共抑制法或RNAi法) 進行.
發(fā)明的效果
通過使用由本發(fā)明獲得的基因的表達產(chǎn)物，可以以l-O-?；?P-D-葡 萄糖作為?；w、使芳香族?；螯S酮類化合物的糖殘基轉移。因此， 可以進行由于花和果實等的黃酮類化合物的累積而發(fā)色的植物組織的改 變。
用于實施發(fā)明的最佳方式
按照以下實施例，更詳細地說明本發(fā)明。本申請的發(fā)明不受以下這些 例子的限制。分析化學的方法、分子生物學的方法和生物化學的方法如果 沒有特別限定，則按照特開2005-95005號公^^中所述的方法進行。
〔實施例1〕酶反應的底物和標準化合物的制備
(1)植物材料的制備
用常規(guī)方法無菌播種蝶豆'對蘭，(Clitoria ternatea cv. Double blue) (廿力夕的種子)，使之生根后，使之在玻璃溫室中育苗、生長。三花龍 膽'八甲田，(Gentiana triflora cv. Hakkoda)，是收集在青森縣下栽培 的植物體作為切花，只制備花瓣。在玻璃溫室中播種山梗菜'里維埃拉午 夜藍， (Lobelia erinus cv. Riviera Midnight Blue) 、 'Aqua White' ( L. erinus cv. Aqua White )、 'Aqua Lavender' ( L. erinus cv. Aqua Lavender )、'Aqua Blue' (L. eri畫cv. Aqua Blue)(夕* 4種苗)后，使之在塑料 盆中生長直至開花。收集開花花瓣和花蕾花瓣后、用液氮瞬間冷凍，于-80 'C保存。
(2)化合物的分離
l曙O畫羥基肉桂酰畫e -D國葡萄糖類(Milkowski等人，(2000) FEBS Letters 486: 183-184、 Bokern和Strack ( 1988 ) Planta 174:101-105、 Bokern等人， (1991) Planta 184: 261-270、 Bokern等人，(1992) Botanica Acta 105: 146-151)的樣本，也就是l-O-對香豆?；?P -D-葡萄糖，l-O-咖啡酰基-P -D-葡萄糖，l-O-阿魏?；?P -D-葡萄糖、和l-O-芥子?；?P -D-葡萄糖使用 由Alfred Baumert博士和Dieter Strack教授(Leibniz IPB， Halle, Germany)分發(fā)的化合物。從蝶豆的花瓣中純化分離l-O-對香豆?；?P-D-葡萄糖、從山梗菜的花瓣中純化分離l-O-咖啡酰基-P-D-葡萄糖，l-O-阿魏 酰基-P -D-葡萄糖(數(shù)馬等人(2005 )日本農(nóng)藝化學會2005年大會講演要 旨集3)。從蝶豆的花瓣中純化分離翠雀素3-(6-丙二酰)葡糖苷3',5'-二葡 糖苷(ternatin C5、 Terahara等人，(1998) Journal of Natural Products 61: 1361-1367)、翠雀素3，3',5'-三葡糖苷(preternatin C5, Terahara等人， (19卯)Phytochemistry 29: 3686-3687)、和翠雀素3-(6-丙二酰)葡糖苷-3，-葡糖苷(Kazuma等人，(2005) Chemistry & Biodiversity 1: 1762-1770)。
〔實施例2〕標準的的酶活性測定
于30。C使20inl含有l(wèi)OOmM磷酸緩沖液(pH6.5) 、 4jil的0.4mM 花色素苷、4ul的0.5mM l-0-?；?P-D-葡萄糖和8ial酶液的反應液反 應。加入4 n 1的1M鹽酸水溶液使反應停止，加入24 |J 1含有0.05M TFA 的5%乙腈后、用Millex-LH過濾器(Millipore)進行過濾，在HPLC中 注入lOjal進行分析。
花色素苷?；D移酶反應產(chǎn)物的HPLC分析，用Develosil ODS-UG-5 (3.0 i.d. x 250 mm,野村化學)柱，在35t:柱溫度下進行。對初期溶劑-含有0.05M三氟乙酸(TFA)的5%乙腈(MeCN)水溶液以14至86%的線性濃度梯度(20分鐘)添加含有0.05M TFA的40%MeCN，以0.5 mL/ 分鐘的流速洗脫，使用PDA檢測，并用LC-MS/MS進行分子量的確認。
〔實施例3〕酶活性測定中使用的底物的研究
為了檢測以l-O-酰基-P-D-葡萄糖作為?；w、使芳香族?；螯S 酮類化合物的糖殘基轉移的酶活性，研究了 l-O-酰基-P-D-葡萄糖和花色 素苷的種類。使用從蝶豆花瓣中提取的蛋白質的35-70%的硫酸銨沉淀級分 作為酶溶液，以preternatin C5作為?；荏w，使用各種l-O-?；?P-D-葡萄糖作為?；w，測定酶活性。其結果是，樣本中使用的所有l(wèi)-O-酰 基陽P -D-葡萄糖可以檢測到酰基轉移酶活性，清楚了比活性從低到高依次 為l-O-芥子酰基-P-D-葡萄糖、l-O-阿魏?；?P-D-葡萄糖、l-O-對香豆酰 基國P-D陽葡萄糖、l-0國咖啡酰基-l3-D-葡萄糖。另夕卜，使用l-O畫對香豆?；?-P-D-葡萄糖作為?；w，使用各種花色素苷作為受體，測定酶活性。 其結果，試驗中使用的所有花色素苷(preternatinC5、 ternatinC5、翠雀 素3-(6-丙二酰)葡糖苷-3，-葡糖苷)均可以檢測到酰基轉移酶活性。
〔實施例4〕具有將芳香族?；D移到花色素苷的3'位葡糖基上的酶 活性的蛋白質3，AT的純化
從蝶豆的花瓣中，使用preternatin C5和l-O-對香豆?；?P-D-葡萄 糖作為酶活性測定的底物，參考生物合成1，2-二-0-?；?P-D-葡萄糖的葡 萄糖酰基轉移酶的純化方法(Li等人，(1999) Plant Physiology 121: 453-460、 Li和Steffens (2000) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 6902-6907 、 PCT/W097/48811)純化具有將對香豆?；?'位葡糖基的6位轉移的活 性的蛋白質-?；D移酶(3'AT)。蛋白質的純化步驟，于0-4。C進行， 其通過依次進行以下步驟來完成蛋白質提取、硫酸銨分級、使用TSK凝 膠DEAE-TOYOPEARL 650M (東曹)的離子交換層析、使用伴刀豆球 蛋白A( ConA )-瓊脂糖(Honen )的層析、使用Mono P HR 5/20( AmershamBioscience)的層沖斤和4吏用Mono Q HR 5/5 (Amersham Bioscience )的離 子交換層析。在使用TSK凝膠DEAE-TOYOPEARL 650M、 Mono P和 Mono Q的柱層析中使用FPLC ( Pharmacia )。使用ConA瓊脂糖的柱層 析中使用空心柱。
(1)粗酶液的制備
液氮存在下用乳缽和乳棒研磨510.5g蝶豆的冷凍花蕾。再加入約 1000ml緩沖液A (lOOmM Tris-HCl ( pH7.5 ) 、 5mM 二硫蘇糖醇(DTT )、 IOjuM對脒基苯甲基磺酰氟鹽酸鹽(pAPMSF) ) 、 5g聚乙烯吡咯烷酮 (PVPP)和適當?shù)暮Ｉ?，然后研磨。?,000轉/分鐘對提取懸浮液離心 15分鐘后，用四層砂布過濾上清。向上清的濾液中添加800g的Dowex 1 x2 (100-200目、室町化學)，靜置15分鐘后，用尼龍網(wǎng)過濾，獲得了 1240ml的粗酶液。
(2 )硫酸銨分級
用35 %飽和硫酸銨對粗酶液進行30分鐘鹽析后，以7,000轉/分鐘離 心20分鐘除去不溶物。用70%飽和硫酸銨再進行一晚鹽析后、通過7,000 轉/分鐘離心20分鐘獲得了蛋白質沉淀。將沉淀再次溶解于緩沖液B (20mM Tris曙HCl (pH 7.5 ) 、 lmMDTT、 10 ja M pAPMSF)后、使用經(jīng) 緩沖液B平衡化的Sephadex G-25 Fine ( 70 mm x 40 mm i.d.; Amersham Bioscience)柱脫鹽?；厥盏鞍踪|級分(1598.4mg/144mL )，提供給以下 的層析。
(3 ) DEAE陰離子交換FPLC
將30ml TSK凝膠DEAE-TOYOPEARL 650M填充于柱(XK16/20, 180 mm x 16 mm i.d.)中，用緩沖液B進行平衡。將酶溶液添加到柱上， 以8 ml/分鐘的流速，通過在45分鐘內使氯化鈉濃度由0 mM變化到200 mM的線性梯度進行蛋白質的分級。測定各級分的?；D移酶活性后，收 集具有活性的級分840ml，用卯％飽和硫酸銨進行一晚鹽析。將通過在 7,000轉/分鐘離心20分鐘獲得的蛋白質的沉淀再次溶解到40ml的緩沖 液B中。將溶解的蛋白質溶液平均分成5ml，直至以后的純化中使用之前保存于-80。C。
(4 ) ConA瓊脂糖柱層析
溶解5ml冷凍保存的DEAE活性級分后、用經(jīng)緩沖液C ( 50mM HEPES-NaOH ( pH7.5) 、 10%丙三醇、0.2MKC1)平衡過的凝膠過濾柱 PD-10 (Amersham Bioscience)脫鹽。通過超離心過濾將7ml經(jīng)脫鹽的蛋 白質溶液濃縮到0.5ml。將蛋白質濃縮液(0.5ml)加到填充于柱中經(jīng)緩沖 液C平衡化的ConA瓊脂糖(4ml)上。添加蛋白質溶液后、用4柱床量 的緩沖液C(16ml)清洗后，用3柱床量的緩沖液D(50mMHEPES-NaOH (pH7.5) 、 10%丙三醇、0.2MKC1、 1M oc-D-甲基葡糖苷)(12ml)洗 脫吸附于Con-A瓊脂糖的蛋白質。將洗脫液注入透析管SnakeSkin Dialysis Tubing MWCO IO，OOO ( PIERCE Biotechnology)后、用緩沖液E (25mM 哌溱-HCl ( pH 5.5 ) ) (3，000ml)透析一晚。用PD-10再次脫鹽后，釆用 Amicon Ultra (分級分子量10,000、 Millipore)進行離心濃縮，制成0.5ml 的蛋白質溶液(0.5mg/ml)。 (5 ) Mono P FPLC
以0.8ml/分鐘的流速將ConA活性級分(0.5ml)添加到經(jīng)緩沖液E平 衡化的Mono P柱上。添加蛋白質后，用緩沖液E (6ml)清洗柱。用以 1:10 (v/v)稀釋的Polybuffer 74-HC1 ( pH4.0 ) (32ml)洗脫。平均0.8ml 分級到預先裝入了 0.08ml的0.5M HEPES-NaOH ( pH 7.5 )和0.08ml的 丙三醇的試管中。收集具有活性的級分(8.8ml )進行離心濃縮，制成1.5ml 的蛋白質溶液。
(6 ) Mono Q強陰離子交換FPLC
1.0ml/分鐘的流速將Mono P活性級分(1.5ml)添加到經(jīng)緩沖液F (10mM Tris-HCl ( pH 7.5) 、 ImM DTT、 10 mM pAPMSF)平衡化的 Mono Q HR5/5柱上。使用緩沖液F( lOmM Tris曙HCl( pH 7.5 )、 ImM DTT、 10 |a M pAPMSF)作為A液，使用緩沖液G (10mM Tris-HCl ( pH 7.5 )、 ImM DTT、 10 y M pAPMSF、 1M NaCl)作為B液，60分內進行B液0% 至25%的線性濃度梯度，平均lml分級。回收活性級分(6ml)、進行離心濃縮，制成0.1ml的蛋白質溶液(0.9jug/ml)。
求出3，AT活性的比活性，其結果為1492.6pkat/mg，如果與DEAE活 性級分的比活性0.252pkat/mg比較，純化為其的5923倍。另外，用 SDS-PAGE分級活性級分后，進行了銀染，結果，只檢測到清楚的30.8kDa 和淡的24.1kDa的兩條條帶。據(jù)報道，絲氨酸羧肽酶樣酰基轉移酶 (SCPL-AT)為作為由34kDa和24kDa的多肽構成的異四聚體(Li等人， (1999) Plant Physiology 121: 453-460)、或由30kDa和17kDa的多肽構成 的異二聚體(Shirley和Chapple( 2003 )Journal of Biological Chemistry 278: 19870-19877)起作用的蛋白質。因此，根據(jù)SDS-PAGE的分析結果顯示， 從蝶豆花瓣中純化的3'AT蛋白質已純化成足夠十分均勻。據(jù)報道， SCPL-AT與絲氨酸羧肽酶(SCPase ) —樣，通過糖鏈被修飾，由3'AT蛋 白質結合到ConA樹脂上也可知受糖鏈修飾的可能性高。而且，由于銀染 對受糖鏈修飾的多肽的染色力弱，因此顯示出24.1kDa的亞基受糖鏈修飾 的可能性。
〔實施例5〕具有依次對花色素苷3，位和5'位葡糖基進行?；幕?性的3'5'AT蛋白質的部分純化
純化3'AT蛋白質的過程中，檢測到依次對preternatinC5的B環(huán)3' 位和5'位的葡糖基進行?；?'5'AT活性。硫酸銨分級、DEAE陰離子 交換FPLC、 ConA層析、Mono P FPLC后的3'AT活性級分中也檢測到 3'5'AT活性，但MonoQFPLC后的3'AT級分中沒有檢測到3'5'AT活性。 然后，使用preternatinC5和l-O-阿魏?；?卩-D-葡萄糖作為酶活性測定的 底物，進行了具有將阿魏酰基向3'位葡糖基的6位轉移的活性的蛋白質-?；D移酶(3，AT)和具有將阿魏?；D移到3'位和5'位葡糖基這二者的 6位的活性的蛋白質-3'5'AT的自3'AT的分級和部分純化。 (1)粗酶液的制備和硫酸銨分級
按照〔實施例3〕的(1)粗酶液的制備和(2)硫酸銨分級的方法， 從101.4g蝶豆花瓣中獲得了 269.15mg含有具有3'AT和3，5'AT活性的蛋白質的級分(50ml)。
(2 ) DEAE陰離子交換FPLC
將酶溶液添加到經(jīng)緩沖液B平衡化的TSK凝膠 DEAE-TOYOPEARL 650M柱上，通過以1 ml/分鐘的流速，在360分鐘 內使氯化鈉濃度由0mM變化到200mM的線性梯度分級蛋白質。用90% 飽和石克酸銨對回收的3'AT活性級分(54ml)和3'5'AT活性級分(42ml) 進行一晚鹽析，按照〔實施例3〕 (3)的方法將通過7,000轉/分鐘離心 20分鐘獲得的蛋白質的沉淀再溶解后，進行按照〔實施例3〕 (4)進行脫 鹽和濃縮。
(3 ) ConA瓊脂糖柱層析
將3'AT和3'5'AT各蛋白質濃縮液添加到充填于柱中經(jīng)緩沖液C平衡 化的ConA瓊脂糖(5ml)上。按照〔實施例3〕 (4)進行層析、透析和 脫鹽。
(4 ) Mono P FPLC
按照〔實施例3〕 ( 5 )對ConA活性級分進行層析、脫鹽和濃縮。3'AT 活性級分的3'AT比活性為45.9pkat/mg，純化到硫酸銨分級后的比活性 0.46pkat/mg的100倍。3'AT活性級分中也檢測到了 3'5'AT活性，其比活 性為3.6pkat/mg。另一方面，3，5'AT活性級分的3，5'AT比活性為 9.6pkat/mg，純化到硫酸銨分級后的比活性0.13pkat/mg的74倍。3'5'AT 活性級分中也檢測到了 3'AT活性，其比活性為4.1pkat/mg。
因此，蝶豆花瓣中發(fā)現(xiàn)存在具有對花色素苷B環(huán)3，位葡萄糖?；?活性的3'AT和具有對3'位葡萄糖和5'位葡萄糖依次酰基化的活性的蛋白 質3'5，AT。
〔實施例6〕花色素苷3'AT蛋白質的氨基酸序列的測定 用SDS-PAGE分級由〔實施例4〕純化的約65ng 3'AT蛋白質后， 用PAGEBlue83(CBBR-250，第一化學)染色。分別切出被染色的30.8kDa 和24.1kDa的條帶，將各樣本命名為CTDCPQ-30和CTDCPQ-24。加入含有胰蛋白酶的Tris緩沖液(pH8.0)進行35C、 20小時的處理。然后將 該溶液的所有量提供給反相HPLC，分離肽片段。作為對照，切除沒有對 象條帶的凝膠部分，進行同樣的處理。肽片段的HPLC分離條件如下所示。 柱使用Symmetry C18 3.5 M m (1.0 x 150mm, Waters公司)。流速為50 ial/分鐘，使用含有0.1%TFA的2%乙腈作為溶劑A,使用含有0.09%TFA 的90。/。乙腈作為溶劑B，濃度梯度為起始的6分鐘溶劑B濃度為0%， 之后5分鐘使溶劑B濃度至10%,之后75分鐘使溶劑B濃度至50%，之 后的5分鐘使溶劑B濃度至100%后，5分鐘期間溶劑B為100% 。在210nm 和280認進行檢測，每50 M 1進行分取。
將CTDCPQ-30的級分No.35、 No.44+45、和CTDCPQ-24的級分 No.l8+19提供進行氨基餅列分析。使用Procise 494 cLC蛋白質測序體 系分析各肽片段的N末端氨基^列。確定的氨基^列如下所示。 CTDCPQ-30-T35: (R/K)WLIDHPK (序列編號19和20 ) CTDCPQ-30-T44+45: (R/K)ISFAHILER (序列編號21和22 ) CTDCPQ-24-T18+19: (R/K)RPLYEXNTM (序列編號23和24)
〔實施例7〕 SCPL-AT cDNA片段擴增用引物的設計 編碼催化以l-O-酰基-P -D-葡萄糖作為?；w的反應的蛋白質的基 因的堿基序列與編碼絲氨酸羧肽酶(SCPase)的基因的堿基序列的同源性 高，催化以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰基供體的反應的蛋白質被稱為 SCPL國AT ( Milkowski和Strack (2004 ) Phytochemistry 65: 517-524 )。 然后，基于在SCPase和SCPL-AT中高度保守的區(qū)域及其堿基序列合成簡 并引物。高度保守的區(qū)域的鑒定和引物的設計中使用采用CLUSTALW程 序的多重比對、Block MakeK http:〃blocks.fhcrc.org/blocks/ )和CODEHOP (http:Vblocks.fhcrc.org/codehop.html )。多重比對中使用的序列為 NCBI/EMBL/DDBJ登錄號AF242849、 AF275313、 AF248647、 AY033947、 AY383718、 X80836 (區(qū)域12728..14326 )和UniProt/Swiss畫Prot登錄號 P07519、 P08819、 P37890的氨基紗列。合成的CODEHOP引物和簡并引物如下所示。
cdhp Fd: GGACCCCGTGATGATCTGGYTIAMIGG (序列編號25 )
cdhpRv: CCGCAGAAGCAGGAGCAICCIGGICC (序列編號26)
blockA Fd: AMIGGWGGICCTGGITGYWSIWS (序列編號27 )
blockBFd: GAIWSICCIGYIGGIWSIGG (序列編號28)
blockC Fd: RTIGSIGGIGAIWSITAYDSIGG (序列編號29 )
blockERv: RTCRTGRTCICCISWRWA (序列編號30)
blockF Rv: GGYTTRTAYTCIGGIRCIGTRTGICC (序列編號31)
〔實施例8〕蝶豆SCPL-AT cDNA的克隆化 (1) RNA的制備
將蝶豆花瓣按花蕾的長度每5mm分成各個階段。即花蕾長度5-10mm 為階段l、 10-15mm為階段2、 15-20mm為階段3、 20-25mm為階段4、 25-30mm為階段5、 30-35mm為階段6、 35-40mm為階段7、 40-45mm為 階段8、 45-50mm為階段9、開花階段為階段IO。對數(shù)百毫克各階段的花 瓣使用TRIzol( Invitrogen )制備總RNA。使用Oligotex-dT30 super( Takara Bio)從該總RNA (50 jug)中按照制造者推薦的方法在各階段純化 poly(A)+RNA，制成15 p 1的poly(A)+RNA溶液。
(2 )使用簡并RT-PCR的cDNA片段的擴增和克隆化
以15 |a 1純化的poly(A)+RNA溶液作為模板，使用第一鏈cDNA合成 試劑盒(Amersham Bioscience )按照制造者推薦的方法合成單鏈cDNA。 等量混合合成的全部階段的cDNA，作為PCR反應的模板。PCR反應中 使用[實施例7 ]中所示的CODEHOP引物、簡并引物和NotI-d(T)18引物 (Amersham Bioscience)。
首先，組合chhp Fd和blockA Fd引物和反向引物這3種引物進行PCR 反應。以2Ml單鏈cDNA溶液作為模板，使用正向和反向引物各2ju 1、 2個單位的ExTaq聚合酶(Takara Bio )，通過制造者推薦的方法以共計 50lil進行PCR反應。引物組為1: cdhp Fd和NotI-d(T)18、 2: blockA Fd和NotI-d(T)18、 3: cdhp Fd和blockE Rv、 4: cdhp Fd和blockF Rv、 5: blockA Fd和blockE Rv、 6: blockA Fd和blockF Rv，將CODEHOP引
物和簡并引物的濃度調整成50nM,將NotI-d(T)化引物的濃度調整成10 MM使用。PCR反應為在95。C反應3分鐘后、進行40個95'C 30秒、55 °C 45秒、72°C 80秒的反應的循環(huán)，最后于72X:處理7分鐘。將獲得的 反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收引物組3至6的反應中獲得的預計大 小的凝膠片段。
以1 ju 1通過引物組1和2的組合進行PCR獲得的產(chǎn)物作為模板，進 行巢式PCR。正向和反向引物的組合為1: blockA Fd和blockF Rv、 2: cdhpFd和blockFRv 、3 : cdhpFd和 Notl隱R21
(5'-TGGAAGAATTCGCGGCCGCAG-3':序列編號32)，以liilPCR 產(chǎn)物作為模板，使用正向和反向引物各1M 1、 1個單位的ExTaq聚合酶
(TakaraBio)，通過制造者推薦的方法以總計25 |J 1進行PCR。以使用 cdhp Fd和NotI-d(T)18作為引物組的PCR反應產(chǎn)物作為模板，從凝膠片段 中回收由引物的組合l的反應獲得的預計大小的PCR產(chǎn)物。
然后，組合blockB Fd、 blockC Fd引物和反向引物這3種引物進行 PCR反應。以2|il單鏈cDNA溶液作為模板，使用正向和反向引物各2 ja 1 、 2個單位的LA Taq聚合酶(Takara Bio )以共計50 |a 1進行PCR 反應。引物組為1: blockB Fd和NotI-d(T)18、 2: blockC Fd和NotI-d(T)18、 3: blockB Fd和blockE Rv、 4: blockC Fd和blockE Rv、 5: blockB Fd 和blockF Rv、 6: blockC Fd和blockF Rv，將CODEHOP引物和簡并引 物的濃度調整成50 M M，將NotI-d(T)18引物的濃度調整成10 |a M使用。 反應為在95。C反應3分鐘后、進行40個95X: 30秒、50X: 45秒、72C 80 秒的反應的循環(huán)，最后于72r處理7分鐘。將獲得的反應產(chǎn)物進行瓊脂糖 凝膠電泳、從凝膠片段中回收引物組4, 5和6的反應獲得的預計大小的 PCR產(chǎn)物。
以lnU通過引物組l、 2和3的組合進行PCR獲得的產(chǎn)物作為模板， 分別進行巢式PCR。引物組為l: blockB Fd和blockE Rv、 2: blockC Fd和blockERv、 3: blockB Fd和blockF Rv、 4: blockC Fd和blockF Rv， 分別使用100pmole的正向和反向引物、1個單位的LATaq聚合酶，通過 制造者推薦的方法以總計50 u 1進行PCR反應。將PCR反應產(chǎn)物進行瓊 脂糖凝膠電泳，從凝膠片段中回收預計大小的PCR產(chǎn)物。將純化的PCR 產(chǎn)物亞克隆到pGEM-T Easy載體(Promega )中測定堿基序列。獲得的克 隆編碼的基因產(chǎn)物的推定中使用BLASTsearch(http:〃blastgenome.jp/)。 而且，使用CLUSTAL X進行多重比對后，使用Tree View程序制成分子 系統(tǒng)樹，進行cDNA的功能推定。
情況第一次PCR中使用cdhp Fd和blockE Rv、 blockA Fd和blockE Rv 的情況，以在第一次PCR中使用cdhp Fd和NotI-d(T)18的PCR反應產(chǎn) 物作為模板在巢式PCR中使用blockA Fd和blockF Rv的情況，使用 blockCFd和Notl-d(T)M時的情況，或組合使用blockB Fd、 blockC Fd和 blockE Rv、 blockF Rv的情況。認為編碼SCPase或SCPL-AT的cDNA 片段的克隆為29個克隆，通過多重比對和分子系統(tǒng)樹進行的分析確認了存 在4種SCPL克隆。將各蝶豆SCPL克隆命名為CtSCPLl, 2， 3, 4。其 中，與SCPL-AT同源性高、且位于與制成分子系統(tǒng)樹時已知的SCPL-AT 相同進化枝的為CtSCPLl和CtSCPL4 cDNA的片段克隆。 (3 ) CtSCPLl和CtSCPL4 cDNA的RACE
從蝶豆花瓣中通過改良CTAB法(Chang等人，(1993 )PIant Molecular Biology Reporter;山本向井，植物細胞工學；|j 一X 7， 57-62頁)制備 總RNA。使用Oligotex-dT30 super從250 /a g該總RNA中，通過制造者 推薦的方法純化poly(A)+RNA。從約480ng純化的poly(A)+RNA中使用 GeneRacer kit(Invitrogen)按照制造者推薦的方法合成Gene Racer Ready cDNA ( GRR cDNA)。
以將合成的GRR cDNA按1:3稀釋的cDNA溶液作為模板，使用 GeneRacer 5'引物(5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3':序列編 號33 、 Invitrogen)和特異于CtSCPLl cDNA片段的內部序列的CtSCPLl-Rl引物(5'-TACTGGAATGGGAATACCAGAGTAAG-3':序 列 編 號34 ) 或CtSCPLl-R2引 物
(5'-GGCATGGTGAACTAATGTCCAGTCAC-3，序列編號35)進行 PCR。另夕卜，使用GeneRacer5'引物和特異于CtSCPL4cDNA片段的內部 序列的CtSCPL4-Rl引物(5'-GTGTCGACCCAGTCACAGTTTG-3，序 列 編 號36 ) 或CtSCPL4-R2引 物
(5'-CTGATATAACCTCATTGTATGACTCC-3，序列編號37)進行 PCR。以GRR cDNA作為模板，使用GeneRacer 5'引物(30pmole)和 CtSCPLl-Rl (20pmole )或GeneRacer 5'引物(30pmole)和CtSCPLl-R2 作為引物(20pmole),使用LA Taq聚合酶按照制造者推薦的方法以共計 50 M1進行PCR反應。94。C反應3分鐘后、進行30個94°C, 30秒、65°C ■ 45秒、72'C. 80秒反應的循環(huán)，最后于72。C處理7分鐘。然后以第一次 PCR產(chǎn)物作為模板，組合使用GeneRacer 5'巢式引物和CtSCPLl-Rl、 CtSCPLl-R2， CtSCPL4-Rl或CtSCPL4-R2進行巢式PCR。以第一次PCR 產(chǎn)物作為模板，使用LA Taq聚合酶(Takara Bio)，用制造者推薦的方 法以總計50jul進行與笫一次PCR同樣的PCR反應。用0.8%瓊脂糖電 泳分級第一次PCR和巢式PCR產(chǎn)物后，切出擴增產(chǎn)物的條帶，回收PCR 產(chǎn)物。將從凝膠中純化的PCR產(chǎn)物TA克隆到pGEM-T Easy載體中。分 析獲得的若干克隆，測定CtSCPLl和CtSCPL4 cDNA的5'末端的堿基序 列。
以合成的GRR cDNA按1:3稀釋的cDNA溶液作為模板，使用 GeneRacer3'引物(5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3':序列 編號 38、 Invitrogen )、 或 Gene Racer 3'巢式引物(Invitrogen 、 5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3':序列編號39)作為反向引物， 使用特異于CtSCPLl cDNA片段的內部序列的CtSCPLl-Fl引物 (5'-TCATAAGGGAAGTATTGGTGAATGGC-3':序列編號40 )或 CtSCPLl畫F2引物(5'-GTTTACCTTTCACGTCGGACATTCC畫3，序列 編號41)作為正向引物進行PCR。另外，使用特異于CtSCPL4 cDNA片段 的 內 部 序 列 的 CtSCPL4-Fl 引 物 (5'-AGTGCACTACACATTCGTAAGG-3，序列編號42 )或CtSCPL4-F2 引物(5，-GTAAATGGCGTCGATGTACCC-3':序列編號43)作為正向 引物進行PCR。與5'RACE同樣進行PCR、克隆和測序，測定CtSCPLl 和CtSCPL4 cDNA中3'末端的堿基序列。
(4) CtSCPLl cDNA的蛋白質編碼全區(qū)域的克隆 合成含有根據(jù)由RACE獲得的5'和3'末端的堿基序列預測的蛋白質的
起 始 密 碼 子 的 pE-CtSCPLl-F
(5'-GACGACGACAAGATGACCATAGTAGAGTTCCTTCCTG畫3':序 列編號44)作為正向引物，合成含有終止密碼子的pE-CtSCPLl-R (5'-GAGGAGAAGCCCGGTTATTATAGAATGGATGCCAAGTTGG-3 ':序列編號45 Mt為反向引物。以單鏈cDNA作為模板，使用pE-CtSCPLl-F 和pE-CtSCPLl-R各20pmole作為引物，使用LATaq聚合酶，用通過制 造者推薦的方法在總計50iLU中進行PCR反應。PCR反應為，95。C反應3 分鐘后，進行30個95"C. 30秒、55'C. 45秒、72C 80秒的反應的循環(huán)， 最后于72。C處理7分鐘。通過瓊脂糖電泳分級PCR產(chǎn)物后，切出擴增產(chǎn) 物的條帶，將純化的PCR產(chǎn)物亞克隆到pET30 Ek/LIC載體(Novagen ) 中。分析獲得的若干pET-CtSCPLl克隆，測定CtSCPLl的蛋白質編碼全 區(qū)域的堿基序列。其結果，確認了其含有完整的〔實施例6〕中獲得的花 色素苷3'AT蛋白質的內部氨基,列。另外，在CTDCPQ-24-T18+19: (R/K)RPLYEXNTM (序列編號23和24)中沒有檢測到的第6循環(huán)的氨 基酸X在cDNA的推定氨基酸序列中為N，我們認為其受到糖鏈修飾。 CtSCPLl的ORF為1464bp，編碼由487個氨基酸殘基構成的多肽，其存 在3處糖鏈修飾位點并在N末端存在分泌信號。CtSCPLl的堿基序列示于 序列編號1，根據(jù)其堿基序列推定的氨基酸序列示于序列編號2。
(5) cDNA文庫的篩選
使用CtSCPLl、 2、 3和4的cDNA片段克隆、擬南芥SNG1和SNG2 基因cDNA作為探針，在最終清洗條件(55°C、 O.lxSSC、 0.1。/oSDS)下，以各個探針對蝶豆花瓣cDNA文庫的約10萬個克隆進行篩選，最終獲得 了 14個陽性克隆。其中13個為CtSCPLl，剩下1個克隆為CtSCPL3。 CtSCPLl的陽性克隆中，最長的克隆CtSCPLAl-8為1740bp，與由 5'-RACE獲得的克隆相比，該克隆缺失起始蛋氨酸的上游(序列編號46: ATTAAAAAAAAAATATG)。以CtSCPLAl-8為代表的13個陽性克隆 的開放閱讀框中堿基序列與由RACE獲得的克隆和pET-CtSCPLl克隆相 同。
〔實施例9〕桿狀病毒-昆蟲細胞中CtSCPLl重組蛋白質的表達
(1) CtSCPLl重組桿狀病毒的制作 桿狀病毒-昆蟲細胞中重組蛋白質的表達中使用BaculoDirect桿狀病 毒表達系統(tǒng)(BaculoDirect C-Term Expression Kit、 Invitrogen ) 。 4吏用正 向 引 物 ( CtSCPLl-DTOPO-Fd :
5'-CACCATGGCAGCCTTCAGTTCAACTCATA畫3':序列編號47)和反 向 引 物 ( CtSCPLl醫(yī)Rv-C-Tag :
5'-TAGAATGGATGCCAAGTTGGTGTATG-3':序列編號48 )通過PCR 擴增由〔實施例8〕獲得的克隆的堿基序列預測的蛋白質編碼區(qū)域。以1 Hl單鏈cDNA作為模板、使用正向引物和反向引物各20pmole、 2個單位 的Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio )，通過制造者推薦的方法以總計50 jul的體積進行PCR反應。94'C反應3分鐘后、進行30個94'C. 30秒、 65°C. 45秒、72°C. 80秒反應的循環(huán)、最后于72。C處理7分鐘。按照制 造者推薦的方法將獲得的PCR產(chǎn)物亞克隆到pENTR-D-TOPO載體 (Invitrogen)中。分析獲得的若干pENTR-CtSCPLl克隆，確定堿基序 列。用LR Clonase (Invitrogen)將CtSCPLl從pETNR-CtSCPLl中重 組于BaculoDirect C-Term Linear DNA。使用Cellfectin將LR反應產(chǎn)物轉 染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )卵巢細胞來源的Sf9細胞。通過制 造者推薦的方法使用9-[l，3-二羥-2-丙氧甲基I鳥嘌呤去除非重組病毒，重組 病毒的增殖、病毒的效價測定，制備2-3 x l07pfu/ml的重組CtSCPLl病毒。
(2 )重組CtSCPLl蛋白質的表達和酶活性的確認
對于在直徑35mm的6孔板上使用完全Grace培養(yǎng)基或Sf900II-SFM 無血清培養(yǎng)基(Gibco)進行單層培養(yǎng)的3xl(^個細胞的Sf9細胞，以感 染復數(shù)(MOI) 5-10使重組病毒感染。于28。C培養(yǎng)5天后，回收培養(yǎng)液和 Sf9細胞。對培養(yǎng)液進行離心濃縮，將Sf9細胞懸浮于緩沖液后，進行超聲 波破碎，以與對培養(yǎng)液相同方式將離心上清進行離心濃縮。使用濃縮的蛋 白質溶液進行酶反應，通過HPLC和LC-MS分析反應產(chǎn)物。
使用preternatinC5或翠雀素3-(6-丙二酰)葡糖苷-3'-葡糖苷和l-O-阿 魏?；?p -D-葡萄糖作為底物使之反應，結果獲得了具有結合一個阿魏酰 基于preternatinC5的分子量的反應產(chǎn)物，并且可以確定3'AT活性。而且， 以ternatinC5和l-O-對香豆?；?P -D-葡萄糖作為底物使之反應時也發(fā)現(xiàn) 了3'AT活性。因此，確認CtSCPLl cDNA編碼具有以l-O-?；bp-D-葡 萄糖作為?；w將?；D移到花色素苷的B環(huán)葡糖基上的酶活性的蛋白 質。而且，沒有發(fā)現(xiàn)由于培養(yǎng)基的差異而導致的活性差異，沒有感染重組 病毒的Sf9細胞提取液和培養(yǎng)液中沒有發(fā)現(xiàn)活性。而且，由于在Sf9細胞 提取液和培養(yǎng)液這兩者中發(fā)現(xiàn)了酶活性，表明該酶為分泌蛋白質。
〔實施例10〕 CtSCPL4重組桿狀病毒的制備
4吏用 正 向 引 物 ( CtSCPL4-DTOPO-Fd : 5'-CACCATGGCGAGGTTTAGTTCAAGTCTTG-3，序列編號49 )和反 向 引 物 ( CtSCPL4-Rv-Stop :
5，-TTACAAAGGCCTTTTAGATATCCATCTCC畫3':序列編號50)通過 PCR擴增由〔實施例8〕獲得的克隆的堿基序列預測的蛋白質編碼區(qū)域(開 放閱讀框)。PCR反應按〔實施例9〕進行，將獲得的PCR產(chǎn)物按照制 造者推薦的方法亞克隆到pENTR-D-TOPO載體中。分析獲得的若干 pENTR-CtSCPL4克隆，確認CtSCPL4的全堿基序列。CtSCPL4的ORF 中堿基序列示于序列編號3，根據(jù)其堿基序列推定的氨基酸序列示于序列編號4。 CtSCPL4的ORF為1410bp，其編碼由469個氨基酸殘基構成 的多肽，其存在3處糖鏈修飾位點并在N末端存在分泌信號。CtSCPL4 與CtSCPLl在氨基酸水平具有79.1%的同源性，而且分子系統(tǒng)分析中在 SCPL-AT進化枝中也位于最接近CtSCPLl的位置，因此可以認為與 CtSCPLl同樣，CtSCPL4編碼具有以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為酰基供 體，將酰基轉移到尤其是花色素苷的B環(huán)葡糖基上的酶活性的蛋白質。用 BaculoDirect桿狀病毒表達系統(tǒng)將CtSCPL4從pENTR-CtSCPL4重組于 BaculoDirect分泌的線狀DNA，按照制造者推薦的方法制備重組CtSCPL4 病毒?！矊嵤├?1 〕龍膽SCPL-AT cDNA的克隆化 (1)使用簡并RT-PCR進行cDNA片段的擴增和克隆化 將龍膽花瓣分成花蕾的長度為2.5mm以下和2.5-3.5mm的階段。從 1.5克各階段的花瓣中使用TRIzol( Invitrogen )制備總RNA。以該總RNA 中的其中5jag作為模板，使用第1鏈cDNA合成試劑盒(Amersham Bioscience)按照制造者推薦的方法合成單鏈cDNA。等量混合合成的所有 階段的cDNA，以其作為PCR反應的模板。PCR反應中使用〔實施例6〕 中所示的CODEHOP引物、簡并引物和NotI-d(T)18引物。以2jul單鏈 cDNA作為模板、使用正向和反向引物各2ia 1、 l個單位的LATaq聚合 酶，以共計50lal進行PCR反應。PCR反應為在95。C反應3分鐘后，進 行35個95°C, 30秒、48°C. 45秒、72°C, 80秒的反應的循環(huán)，最后于 72。C處理7分鐘。對以第1次PCR產(chǎn)物作為模板進行的巢式PCR所獲得 的反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過各引物的組合進行擴增，回收到了 預計大小的凝膠片段。將純化的PCR產(chǎn)物亞克隆到pGEM-T Easy載體中， 測定堿基序列。獲得作為目的的與SCPase或SCPL-AT同源的克隆的引物的組合為以 下情況第一次PCR中使用blockA Fd和blockT Rv;以及blockCFd和 blockF Rv的情況，以第一次PCR中使用blockA Fd和NotI-d(T)18獲得的PCR反應產(chǎn)物作為模板，在巢式PCR中使用blockC Fd和blockF Rv 的情況，以笫一次PCR中使用blockC Fd和NotI-d(T)!s獲得的PCR反應 產(chǎn)物作為模板，在巢式PCR中使用blockC Fd和blockE Rv;以及blockC Fd和blockF Rv的情況。認為編碼SCPase或SCPL-AT的cDNA片段的 克隆為17個克隆，通過多重比對和分子系統(tǒng)樹的分析確認了存在4種 SCPL克隆。將各龍膽SCPL克隆命名為GentrSCPLl， 2， 3， 4。其中， 與SCPL-AT同源性高、且位于與制成分子系統(tǒng)樹時已知的SCPL-AT相同 進化枝的為GentrSCPLl和GentrSCPL2 cDNA的片段克隆。 (2 ) GentrSCPLl和GentrSCPL2 cDNA的RACE 從〔實施例11 〕 ( 1)中制備的各個階段的總RNA (合計550 M g )中 分別使用Oligotex-dT30 super,通過制造者推薦的方法純化poly(A)+RNA。 使用GeneRacer試劑盒從純化的poly(A)+RNA中的約210ng中按照制造 者推薦的方法合成GRR cDNA。以將合成的GRR cDNA按1:3稀釋的 cDNA溶液作為模板，使用GeneRacer 5'引物和特異于GentrSCPLl cDNA 片段的內部序列的反向引物 (GentrSCPLl-Rl 引物 5'-GCATAAACCGTTGCTTTGATCCGCC醫(yī)3':序列編號 51 、 GentrSCPLl-R2引物5'-CATCAATGAAGCCATCAGCCACAGG-3': 序列編號52)進行PCR。而且，使用GeneRacer5，引物和特異于CtSCPL2 cDNA片段的內部序列的反向引物(GentrSCPL2-Rl引物 5，國TTAAGCACGTCAGGAATCCGGAGG-3':序列編號 53 、 GentrSCPL2-R2引物5，-TGAACGTCGAATGCCGTGAAACACC瞧3': 序列編號54)進行PCR。以GRRcDNA作為模板，使用GeneRacer 5'引 物(30pmole)、反向引物(20pmole) 、 LA Taq聚合酶，用通過制造者 推薦的方法以總計50 jj 1進行pcr反應。94。c反應3分鐘后、進行30個 94。C. 30秒、65°C. 45秒、72°C. 80秒反應的循環(huán)、最后于72。C處理7 分鐘。再以第一次PCR產(chǎn)物作為才莫板，組合^f吏用GeneRacer 5'巢式引物 和反向引物進行巢式PCR。用瓊脂糖電泳分級第一次PCR和巢式PCR 產(chǎn)物、切出擴增產(chǎn)物的條帶，回收PCR產(chǎn)物。將從凝膠中純化的PCR產(chǎn)物進行TA克隆，分析獲得的若干克隆，測定GentrSCPLl和GentrSCPL2 cDNA的5'末端的堿基序列。以合成的GRR cDNA按1:3稀釋的cDNA溶液作為模板、使用 GeneRacer 3'引物或Gene Racer 3'巢式引物作為反向引物、特異于 GentrSCPLl cDNA片段的內部序列的 GentrSCPLl-Fl 引物(5'-TGGCATACAGTGGCGACCATGATC畫3': 序列編號55 )或 GentrSCPLl畫F2引物(5'-CTGATGAGTGGCGTCCATGGAAAG-3':序 列編號56 )作為正向引物進行PCR。而且，使用特異于GentrSCPL2 cDNA 片段的 內部序列的 GentrSCPL2-Fl 引 物(5'-CGTTGTAACCGTTCGTTGCCATTCG-3': 序列編號57 )或 GentrSCPL2畫F2引物(5'-CGATGGTGCCATTCATGGCTACTC-3':序 列編號58)作為正向引物進行PCR。與5，RACE同樣進行PCR、克隆和 測序，測定GentrSCPLl和GentrSCPL2 cDNA中3'末端的堿基序列。(3 ) GentrSCPLl和GentrSCPL2 cDNA的蛋白質編碼全區(qū)域的克隆 合成含有由RACE獲得的5，和3，末端的堿基序列預測的蛋白質的起始 密碼子的正向 引物 ( Gentrl-DTOPO-F : 5'-CACCATGGCGGTGCCGGCGGTGCC畫3' 序列編號 59 、 Gentr2-DTOPO畫F: 5'-CACCATGGCGGATACAAACGGCACAGCC-3': 序列編號60)、和含有終止密碼子的反向引物(Gentrl-Rv-CTag: 5'畫CAATGGAGAATCCGAGAAAAACCG-3':序列編號 61 、 Gentrl-Rv-Stop: 5'誦TTACAATGGAGAATCCGAGAAAAACCG曙3':序 列編號62、 Gentr2誦Rv畫CTag: 5-CAACGGTTTATGAGTTATCCACC-3': 序列編號 63、 Gentr2-Rv-Stop :5'-CTACAACGGTTTATGAGTTATCCAC-3':序列編號64 )。以1 ju 1 單鏈cDNA作為模板、正向引物和反向引物各20pmole、 2個單位的 PyrobestTaq聚合酶，用通過制造者推薦的方法以總計50ul進行PCR反 應。94。C反應3分鐘后、進行30個94'C. 30秒、65°C. 45秒、72t:, 80 秒反應的循環(huán)、最后于72'C處理7分鐘。將獲得的PCR產(chǎn)物按照制造者推薦的方法亞克隆到pENTR-D-TOPO載體。分析獲得的若干 pENTR-GentrSCPLl和pENTR-GentrSCPL2克隆，確認堿基序列。 GentrSCPL2中確認了兩種ORF ，分別命名為GentrSCPL2-l和 GentrSCPL2隱2。 GentrSCPLl、 GentrSCPL2-l和GentrSCPL2畫2的ORF 中堿基序列示于序列編號5、 7、 9，根據(jù)其堿基序列推定的氨基酸序列示 于序列編號6、 8、 10。 GentrSCPLl、 GentrSCPL2-l和GentrSCPL2畫2 的ORF分別為1446bp、 1485bp和1455bp，其編碼由481、 494和484個 氨基酸殘基構成的多肽。GentrSCPLl、 GentrSCPL2-l、 GentrSCPL2-2 的N末端存在分泌信號序列，它們的活性型蛋白質的編碼區(qū)域中分別存在 2、 3、 3處糖鏈修飾位點。GentrSCPL2-2為GentrSCPL2-l的第226-235 位氨基酸區(qū)域發(fā)生缺失的克隆。GentrSCPL2-l和GentrSCPL2-2與 CtSCPLl在氨基酸水平具有41%的同源性，而且分子系統(tǒng)分析中在 SCPL-AT進化枝中也僅次于CtSCPL4地位于鄰近于CtSCPLl的位置， 因此可以認為GentrSCPL2-l和GentrSCPL2-2與CtSCPLl同樣，編碼具 有以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為?；w，將?；D移到尤其是花色素苷 的B環(huán)葡糖基上的酶活性的蛋白質。另外，GentrSCPLl位于SCPL-AT 進化枝中，與GentrSCPL2在氨基酸水平具有32。/。的同源性，可以認為其 編碼以l-O-?；?P -D-葡萄糖作為酰基供體的?；D移酶n用BaculoDirect 桿狀病毒表達系統(tǒng)從pENTR-GentrSCPLl和pENTR-GentrSCPL2-l中將 GentrSCPLl和GentrSCPL2-l重組于BaculoDirect C-Tag線性DNA和 BaculoDirect分泌的線狀DNA后，按照制造者推薦的方法制備重組 GentrSCPLl病毒和重組GentrSCPL2-l病毒。
〔實施例12 〕山梗菜SCPL-AT cDNA的克隆化 (1)使用簡并RT-PCR進行cDNA片段的擴增和克隆化 4吏用QuickPrep Micro mRNA純4匕試齊'J盒(Amersham Bioscience) 按照制造者推薦的方法從山梗菜(Lobelia erinus cv. Riviera Midnight Blue)的花瓣中制備poly(A)+RNA。以該poly(A)+RNA作為模板，使用第l鏈cDNA合成試劑盒，按照制造者推薦的方法合成單鏈cDNA。 PCR反 應中使用〔實施例6〕中所示的CODEHOP引物、簡并引物和Notl-d(T^8 引物。以2Ml單鏈cDNA作為模板、使用正向和反向引物各2p 1、 l個 單位的ExTaq聚合酶，共計50 n 1進行PCR反應。PCR反應為在95 °C反 應3分鐘后，進行30個95。C' 30秒、50'C, 45秒、72'C'卯秒的反應的 循環(huán)，最后于72。C處理7分鐘。對以第1次PCR產(chǎn)物作為模板進行的巢 式PCR所獲得的反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過各引物的組合進行擴 增，回收到了預計大小的凝膠片段。將純化的PCR產(chǎn)物亞克隆到pGEM-T Easy載體中，測定堿基序列。獲得作為目的的與SCPase或SCPL-AT同源的克隆的引物的組合為以 下情況第一次PCR中使用blockAFd和blockTRv，blockCFd和blockF Rv，以及blockC Fd和NotI-d(T)化的情況，巢式PCR中使用blockA Fd 和blockT Rv、 blockB Fd和blockE Rv、 blockC Fd和blockE Rv、以及 blockC Fd和blockF Rv的情況。認為編碼SCPase或SCPL-AT的cDNA 片段的克隆為21個克隆，其中，確認了位于與已知的SCPL-AT相同進化 枝上的1種SCPL-AT克隆LeSCPLl的存在。 (2 ) LeSCPLl cDNA的RACE通過改良CTAB法從5g山梗菜花瓣(開花花瓣2g和花蕾花瓣3g)中 制備總RNA。使用Oligotex-dT30 super從該總RNA中，通過制造者推薦 的方法純化poly(A)+RNA。從純化的poly(A)+RNA中的約480ng中，使 用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)按照制造者推薦的方法合成GRR cDNA。以合成的GRR cDNA按1:3稀釋的cDNA溶液作為模板使用 GeneRacer 5'引物和特異于LeSCPLl cDNA片段的內部序列的反向引物 (LeSCPLl-Rl: 5'曙AATGGGTTGCCTAGCACGTATCCC-3':序列編號 65、 LeSCPLl-R2引物5'-GATTCGTGTTTGGCATCTGTCCAGC-3': 序列編號66)進行PCR。以GRRcDNA作為模板，使用GeneRacer 5，引 物(30pmole)和反向引物(20pmole)，使用LATaq聚合酶，用通過制 造者推薦的方法以總計50 ia 1的體積進行PCR反應。94。C反應3分鐘后、進行30個94。C. 30秒、65。C. 45秒、72'C. 80秒反應的循環(huán)、最后于 72 °C處理7分鐘。進一 步以第 一次PCR產(chǎn)物作為模板，組合使用GeneRacer 5'巢式引物和反向引物進行巢式PCR。用瓊脂糖電泳分級第一次PCR和 巢式PCR產(chǎn)物、切出擴增產(chǎn)物的條帶，回收PCR產(chǎn)物。將由凝膠純化的 PCR產(chǎn)物進行TA克隆，分析獲得的若干克隆，測定LeSCPLl的5'末端 的械基序列。
以合成的GRR cDNA按1:3稀釋的cDNA溶液作為模板、使用 GeneRacer 3'引物或Gene Racer 3'巢式引物作為反向引物、使用特異于 LeSCPLl cDNA 片段的內部序列的 LeSCPLl-Fl 引物 (5'-AACGAGCCAGTTGTCCAACAAGCC-3': 序列編號67 )或 LeSCPLl畫F2引物(5'國CTCCACGTACGAAAGGGAACACTAAC畫3':序 列編號68)作為正向引物進行PCR。與5，RACE同樣進行PCR、克隆和 測序，測定LeSCPLl cDNA中3'末端的堿基序列。
(3 ) LeSCPLl cDNA的蛋白質編碼全區(qū)域的克隆
密碼子的正向引物 (LeSCPL-DTOPO-F : 5'-CACCATGGCGTTTGGTATGCCATTTTCG-3':序列編號69 )和含有 終止密碼子的反向引物(LeSCPL-Rv-CTag : 5'畫CAATAAACTACGAGTAAGCCACCTTC-3': 序列編號7 0 、 LeSCPL畫Rv-Stop: 5'誦TCACAATAAACTACGAGTAAGCCAC-3':序列 編號71)。以1 |i 1單鏈cDNA作為模板、正向引物和反向引物各20pmole、 使用2個的單位的Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio )，用通過制造者推 薦的方法以總計50 nl進行PCR反應。按照制造者推薦的方法將獲得的 PCR產(chǎn)物亞克隆到pENTR-D-TOPO載體。分析獲得的若干 pENTR-LeSCPLl克隆，確認堿基序列。LeSCPLl的ORF中堿基序列示 于序列編號11，根據(jù)其堿基序列推定的氨基酸序列示于序列編號12。 LeSCPLl的ORF為1446bp，其編碼由481個氨基酸殘基構成的多肽，存 在3處糖鏈修飾位點。LeSCPLl與CtSCPLl在氨基酸水平具有26%的同源性，而且分子系統(tǒng)分析中位于SCPL-AT進化枝，可以說其編碼以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為?；w的?；D移酶。使用BaculoDirect桿狀病 毒表達系統(tǒng)，從pENTR-LeSCPLl中將LeSCPLl重組于BaculoDirect C-Tag線性DNA和BaculoDirect分泌的線性DNA后，按照制造者推薦 的方法，制備重組LeSCPLl病毒?！矊嵤├?3〕 l-O-?；?P-D-葡萄糖合成酶(UDP-葡萄糖:羥基肉桂 酸l-O-葡糖基轉移酶)cDNA的克隆化(1)蝶豆l-O-?；?P -D-葡萄糖合成酶cDNA的分離 基于植物二次代謝產(chǎn)物糖基化酶群中的高度保守區(qū)域PSPG敘Huges 和Huges (l"4) DNA Seq.， 5: 41-49 )的氨基酸序列合成以下的簡并引物 GT隱SPF (5'-WCICAYTGYGGITGGAAYTC-3':序列編號72)。以單鏈 cDNA作為模板，使用100pmole GtSPF引物和14pmole NotI-d(T)18引物、 1個單位的ExTaq聚合酶，通過制造者推薦的方法，以總計50 u 1進行PCR 反應。PCR反應為，94'C反應5分鐘后、進行38個94X:. 30秒、42°C-30秒、72°C, 60秒的反應的循環(huán)，最后于72。C處理10分鐘。將獲得的 PCR產(chǎn)物按照制造者推薦的方法亞克隆到pGEM-T easy載體中。分析獲 得的若干克隆，確定堿基序列，獲得了與據(jù)報道來自于油菜和擬南芥的某 種UDP-葡萄糖羥基肉桂酸l-O-葡糖基轉移酶(NCBI/EMBL/DDBJ登 錄號AF287143、 PIR登錄號D71419、 E71419、 F71419 )顯示出高同源性 的cDNA片段克隆GTC600-11。使用該cDNA片段作為探針，在清洗條件 (2xSSC、 1%SDS、 60X:)下篩選蝶豆花瓣cDNA文庫的25萬個克隆， 最終獲得了 7個亞克隆于pBluescript SK-的插入物大小為1.5kbp以上的克 隆。這些克隆的ORF編碼的推定氨基酸序列是相同的，將含有起始密碼 子的最長的克隆命名為CtGTll-4。另夕卜，文庫的篩選通過公知的方法(例 如特開2005-95005號公報)進行。CtGTll-4基因為1788bp,編碼由473 個氨基酸殘基構成的多肽。堿基序列示于序列編號13、由這些堿基序列推 定的氨基酸序列示于序列編號14。(2) CtGTll-4基因產(chǎn)物的l-O-?；?P-D-葡萄糖合成酶活性的確認 CGTll-4基因的表達中使用pET30Ek/LIC體系。首先，使用用于擴 增 CtGTll畫4 的 ORF cDNA 的引物 pEGTCll-4F(5'-GACGACGACAAGATGGGGTCTGAAGCTTCGTTTC-3'(序列編 號 73 ) 和 pEtGTCll陽4R(5'-GAGGAGAAGCCCGGTCTAAGGGTTACCACGGTTTC畫3'(序列 編號74)進行PCR反應。以〔實施例12〕 (1)中獲得的質粒作為模板， 使用pEGTCll-4F和pEtGTCll-4R各40pmole， 1個單位的ExTaq聚合 酶，用通過制造者推薦的方法以總計50 ju 1進行PCR反應。按照制造者推 薦的方法將獲得的PCR產(chǎn)物亞克隆到pET30Ek/LIC載體中。分析獲得的 若干克隆，確認堿基序列后，轉化大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP(Stratagene )。在3ml含有卡那霉素50 ili g/ml和氯霉素34 M g/ml的LB培養(yǎng)基中于 37。C振蕩培養(yǎng)轉化的大腸桿菌一晚。將500 ju 1該培養(yǎng)液接種于50ml LB培 養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至600nm處的吸光度達到0.4后、添加異丙基-P-D-硫代 半乳糖苷(IPTG)使終濃度達到0.4mM,于25。C振蕩培養(yǎng)16小時后、冷 卻離心(8000轉/分鐘，4匸，20分鐘)，回收菌體。用Ni-NTA小型柱(Qiagen)，按照制造者推薦的方法從菌體部分純化重組CtGTll-4蛋白 質后，使用超濾膜進行離心濃縮后，用于酶活性的測定。酶活性的測定中，于30。C使30/Jl含有l(wèi)OOmM磷酸鉀緩沖液(pH7.4) 、 30pmoleUDP-葡萄糖、30pmole羥基肉桂酸、15 pi重組蛋白 質溶液的反應液反應(IO分鐘、20分鐘、30分鐘)后，通過添加6MllM 鹽酸水溶液停止反應。幾基肉桂酸中使用了對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、 芥子酸。通過使用Develosil C30-UG-5 (1.5 i.d x 250mm )的反相高效液相 層析(資生堂NanoSpace系統(tǒng))進行酶反應產(chǎn)物的分析。溶劑保持每分鐘 0.125ml的流速，以5% MeCN水溶液作為A液，以含有0.05M TFA的 40% MeCN水溶液作為B液，以從分離開始0分鐘、20分鐘B液濃度分 別達到14%、 86%的線性梯度進行洗脫，用PDA檢測器進行檢測，分析獲得的數(shù)據(jù)，定量l-O-?；?P -D-葡萄糖。檢測出由重組CtGTll-4蛋白質產(chǎn)生的反應產(chǎn)物中的l-O-羥基肉桂酰-P畫D-葡萄糖類(l-O-對香豆?；?P -D-葡萄糖Rt 8.1分鐘，l-O曙咖啡?；?畫P畫D-葡萄糖Rt5.7分鐘，l-O國阿魏酰基-P-D-葡萄糖Rt 9.3分鐘、和 l-O-芥子?；?P-D-葡萄糖Rt9.8分鐘)。而且，隨著反應小時的增加， 反應產(chǎn)物l-O-鞋基肉桂酰-P-D-葡萄糖類的量直線增加。由此，確認了 CtGTll-4基因編碼具有UDP-葡萄糖羥基肉桂酸l-O-葡糖基轉移活性的 酶，清楚了其為l-O-?；?P-D-葡萄糖合成酶基因。(3)山梗菜l-O-?；?P-D-葡萄糖合成酶cDNA的分離按照〔實施例12〕 ( 1)的方法，以山梗菜花瓣來源的單鏈cDNA作 為模板，進行簡并RT-PCR，克隆出與已知的基因同源性高的cDNA片段。 制備山梗菜(Lobelia erinus cv. Riviera Midnight Blue )花瓣來源的cDNA 文庫，使用獲得的cDNA片段克隆LeGT13作為探針，篩選約50萬個克 隆，最終獲得28個陽性克隆。編碼它們的ORF的推定氨基酸序列可分為 兩類，將各個最長克隆分別命名為LeGT13-20和LeGT13-30。 LeGT13-20 和LeGT13-30分別為1574bp和1700bp， 二者都具有起始密碼子，ORF 為1461bp，其編碼由486個氨基酸殘基構成的多肽。由于在氨基酸水平顯 示出95%的同源性，因此被認為是編碼同一種酶的等位基因。LeGT13-20 和LeGT13-30的堿基序列示于序列編號15和17，根據(jù)它們的堿基序列推 定的氨基酸序列示于序列編號16和18。(4 ) LeGT13-20和LeGT13-30基因產(chǎn)物的l-O-?；?P -D-葡萄糖合 成酶活性的確i人LeGT13-20和LeGT13-30基因的表達中，使用pET30Ek/LIC體系 (Novagen )進行。用于擴增LeGT13-20的ORF cDNA的引物 pELeGT13A-F(5，-GACGACGACAAGATGGGCTCACTGCAGGGTACTACTACCGT C-3' ( 序 列 編 號 75 ) 和 pELeGT13A-R (5'-GAGGAGAAGCCCGGTTAGTGCCCAACAACATCTTTTC-3'(序列編號76 )進行PCR反應。另夕卜，使用用于擴增LeGT13畫30的ORF cDNA 的 引 物 pELeGT13B國F
(5，陽GACGACGACAAGATGGGCTCACTGCAGGGTACTACTACCGT T-3' ( 序 列 編 號 77 ) 和 pELeGT13B國R
(5'-GAGGAGAAGCCCGGTTAGTGCCCAATAACACCTTTTT-3'(序 列編號78)進行PCR反應。以〔實施例12〕 (3)獲得的質粒作為模板， 使用20pmole pELeGT13A-F或pELeGT13B-F作為正向引物，使用 20pmole pELeGT13A-R或pELeGT13B-R作為反向引物，1個單位的 ExTaq聚合酶，通過制造者推薦的方法，以總計50 p 1進行PCR反應。將 獲得的PCR產(chǎn)物按照制造者推薦的方法亞克隆到pET30Ek/LIC載體中。 分析獲得的若干克隆，確認堿基序列后，轉化大腸桿菌 BL21-CodonPlus(DE3)-RP。轉化的大腸桿菌中導入基因的表達、重組蛋白 質的部分純化、酶反應和反應產(chǎn)物的分析按〔實施例12〕 (2)進行，其 結果確認了對使用的所有4種羥基肉桂酸的葡糖基轉移酶活性。由此，確 認了 LeGT13-20基因和LeGT13-30基因編碼具有UDP-葡萄糖羥基肉桂 酸l-O-葡糖基轉移活性的酶，清楚了其為l-O-?；?卩-D-葡萄糖合成酶基 因。
權利要求
1.基因，其編碼具有以1-O-?；?β-D-葡萄糖作為酰基供體、使芳香族酰基向黃酮類化合物的糖殘基轉移的活性的蛋白質。
2. 權利要求l所述的基因，其編碼以下(a) (d)的蛋白質(a) 具有序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列的蛋白質，(b) 具有序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列中添加、 缺失了 一個或多個氨基酸和/或一個或多個氨基酸被其它氨基酸替代的氨 基酸序列的蛋白質，(c) 具有與序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列顯示 出20%以上的同源性的氨基*列的蛋白質，(d) 具有與序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示的氨基酸序列顯示 出70%以上的同源性的氨基*列的蛋白質。
3. 基因，其與序列編號1、 3、 5、 7、 9、或11中所示的堿基序列表 示的核酸、或編碼序列編號2、 4、 6、 8、 10、或12中所示氨基酸序列的 核酸的一部分或全部在嚴格條件下雜交，且編碼具有以l-O-?；?P-D-葡 萄糖作為?；w、使芳香族?；螯S酮類化合物的糖殘基轉移的活性的 蛋白質。
4. 基因，其編碼具有以UDP-葡萄糖作為葡糖基供體、使葡糖基向羥 基肉桂酸的l位羥基轉移的活性的、源自蝶豆和山梗菜的、合成?；w 的蛋白質。
5. 權利要求4所述的基因，其編碼以下的(a) (d)的蛋白質(a) 具有序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列的蛋白質，(b) 具有序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列中添加、缺失了 一個或多個氨基酸和/或一個或多個氨基酸被其它氨基酸替代的氨基酸序 列的蛋白質，(c) 具有與序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列顯示出20%以上的同源性的M^列的蛋白質，(d)具有與序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列顯示出70%以 上的同源性的氨基,列的蛋白質。
6. 基因，其與序列編號13、 15或17中所示的堿基序列表示的核酸、 或編碼序列編號14、 16、或18中所示的氨基酸序列的核酸的一部分或全 部在嚴格條件下雜交，且編碼具有以UDP-葡萄糖作為葡糖基供體、使葡 糖基向羥基肉桂酸的l位羥基轉移的活性的、源自蝶豆和山梗菜的、合成 ?；w的蛋白質。
7. 載體，其包含權利要求l-3中任一項所述的基因。
8. 栽體，其包含權利要求4-6中任一項所述的基因。
9. 由權利要求7或8中所述的載體轉化的宿主細胞。
10. 由權利要求1-6中任一項所述的基因編碼的蛋白質。
11. 前述蛋白質的制造方法，其特征在于培養(yǎng)權利要求9中所述的宿 主細胞，使之生長，然后從該宿主細胞中收集具有以l-O-酰基-P-D-葡萄 糖作為?；w、使芳香族?；螯S酮類化合物的糖殘基轉移的活性的蛋 白質、或具有以UDP-葡萄糖作為葡糖基供體、使葡糖基向羥基肉桂酸的1 位羥基轉移的活性的蛋白質。
12. 使用權利要求1-6中任一項所述的基因通過體外翻譯法而實施的 該蛋白質的制造方法。
13. 經(jīng)轉化的植物，其導入了權利要求1-6中任一項所述的基因、或 權利要求7或8中所述的載體。
14. 具有與權利要求13中所述的植物相同性質的該植物的后代。
15. 權利要求13中所述的植物或權利要求14中所述的該植物的后代 的組織。
16. 權利要求13中所述的植物或權利要求14中所述的該植物的后代 的切花。
17. 以l-O-?；?P-D-葡萄糖作為?；w、使芳香族?；螯S酮類 化合物的糖殘基轉移的方法，其通過向植物或植物細胞中導入權利要求1-3中任一項所述的基因或權利要求7中所述的載體，使該基因表達而實 施。
18. 調節(jié)植物體的花色的方法，該方法通過向植物或植物細胞中導入 權利要求1-6中任一項所述的基因或權利要求7或8中所述的載體，使該 基因表達而實施。
19. 調節(jié)植物體的花色的方法，其通過在具有權利要求1-6中任一項 所述的基因的植物中抑制該基因的表達而實施。
全文摘要
提供了具有序列編號2、4、6、8、10、或12中所示的氨基酸序列的或具有對這些序列進行了修飾的氨基酸序列的、具有將芳香族?；D移到黃酮類化合物的糖殘基上的活性的蛋白質，以及編碼這些蛋白質的基因，尤其是cDNA，及其用途。例如通過向表達羥基肉桂酸1-O-葡糖基轉移酶基因的植物中導入所述基因，或一起導入編碼具有序列編號14、16、或18中所示的氨基酸序列或對這些序列進行了修飾的氨基酸序列，且具有對羥基肉桂酸的1位羥基進行葡糖基化的活性的蛋白質的cDNA，使其表達，可以使該植物的花中黃酮類化合物的糖殘基?；少x予花以藍色。
文檔編號C12N9/10GK101292028SQ200580051869
公開日2008年10月22日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權日2005年10月20日
發(fā)明者佐佐木健, 古川耕一郎, 數(shù)馬恒平, 野田尚信, 鈴木正彥 申請人:青森縣