專利名稱：一種新的頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶(此后簡稱為“CC酰基轉(zhuǎn)移酶”)。本發(fā)明特別涉及一種新的由蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生的突變體CC?；D(zhuǎn)移酶，其編碼DNA，含有所述DNA的表達載體，一種用所述的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物以及經(jīng)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體得到的CC?；D(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物。
頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶是一種酶的總稱，它們都能水解頭孢菌素C產(chǎn)物7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)。
迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了三種酶可被歸類為CC酰基轉(zhuǎn)移酶，即頭孢菌素C酰基轉(zhuǎn)移酶SE83、N176和V22，它們的氨基酸序列已在Journalof Fermentation和Bioengineering Vol 72，232-243(1991)上公開。此文獻中，CC?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列編號是從其N-末端部分的蛋氨酸基團開始。然而，在本說明書中，CC酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列編號是從其N-末端部分蛋氨酸基團相鄰的蘇氨酸基團開始，因為通過原核生物來表達CC?；D(zhuǎn)移酶基因所得到的成熟CC?；D(zhuǎn)移酶的α-亞基的N-端蛋氨酸被酶(如氨肽酶)去掉，生成一以蘇氨酸基團做為其N-末端氨基酸的成熟CC?；D(zhuǎn)移酶。通過重組DNA技術(shù)得到的天然型CC?；D(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物也已在所述的文章中公開，并發(fā)現(xiàn)表達的CC?；D(zhuǎn)移酶在細胞內(nèi)部被加工成一包含α-亞基和β-亞基的活化形式。然而，在大腸桿菌中，加工效率通常不高。從廣泛的研究結(jié)果來看，本發(fā)明的發(fā)明人在產(chǎn)生突變體CC?；D(zhuǎn)移酶上是成功的，這些酶具有滿意的性質(zhì)，可歸納為高的酶效力、pH分布型(profile)改變、加工效率高等等。
本發(fā)明的新突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的特性可歸納如下一種突變體CC?；D(zhuǎn)移酶，其中在天然CC?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的Ala49、Met164、Ser166、Met174、Glu358、Met465、Met506或Met750位置上至少有一個氨基酸被不同的氨基酸取代。
優(yōu)選的取代Met164的不同氨基酸的實例包括中性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等等。
取代Ser166、Met174、Met465、Met506和/或Met750的不同氨基酸的優(yōu)選實例可包括中性氨基酸如丙氨酸等。
取代Glu358的不同氨基酸的優(yōu)選實例可包括中性氨基酸(如異亮氨酸等)，堿性氨基酸(如賴氨酸等)等等。
取代的Ala49的不同氨基酸的最優(yōu)選實例是亮氨酸。
本發(fā)明的突變體CC?；D(zhuǎn)移酶也可以通過用一個不同的氨基酸，取代天然CC?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列其它位置的至少一個氨基酸制備的。例如，用一個或多個不同的氨基酸取代突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的Met269和/或Cys305。
突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶的一個優(yōu)選實例可用下面的式子代表，此式是CC酰基轉(zhuǎn)移酶加工成其α-亞基和β-亞基前的前體形式A1-48-X1-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6-A466-505-X7-A507-749-X8-A751-773其中A1-48與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Thr1到Glu48具有相同的氨基酸序列。
A50-163與天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶的Asp50到Leu163具有相同的氨基酸序列。
A167-173與天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶的Val167到Arg173具有相同的氨基酸序列。
A175-357與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Leu175到Val357具有相同的氨基酸序列。
A359-464與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Thr359到Ala464具有相同的氨基酸序列。
A466-505與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Pro466到Ile505具有相同的氨基酸序列。
A507-749與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Lys507到Ala749具有相同的氨基酸序列。
A751-773與天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶的Val751到Ala773具有相同的氨基酸序列。
X1是丙氨酸或一種不同的氨基酸，X2、X4、X6、X7和X8各為蛋氨酸或一種不同的氨基酸，X3是絲氨酸或一種不同的氨基酸，以及X5是谷氨酸或一種不同的氨基酸，條件是Met269和/或Cys305可由一個或多個不同的氨基酸取代，當X1是丙氨酸，X2、X4、X6、X7及X8均為蛋氨酸，X3是絲氨酸以及X5是谷氨酸以外的一種氨基酸。
在本說明書中，給特定的突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的名稱采用方便的命名法，例如根據(jù)此命名，通過用亮氨酸取代天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列第164位的蛋氨酸制得的突變體CC?；D(zhuǎn)移酶，稱為突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L，其中M是被取代的蛋氨酸(一種氨基酸)殘基的單字母縮寫，164是天然CC?；D(zhuǎn)移酶氨基酸序列的位置號，L是用來取代蛋氨酸(前氨基酸)殘基的亮氨酸(不同的氨基酸)的單字母縮寫。另外，再如突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L和M164A分別是用亮氨酸和丙氨酸取代天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的164位的蛋氨酸殘基后得到的。突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M164L/M174A/M269Y是通過以下方式得到的，用亮氨酸取代天然CC?；D(zhuǎn)移酶氨基酸序列164位的蛋氨酸殘基，用丙氨酸取代天然CC?；D(zhuǎn)移酶氨基酸序列174位的蛋氨酸殘基和用酪氨酸取代天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列269位的蛋氨酸殘基。
本發(fā)明的突變體CC?；D(zhuǎn)移酶可以通過重組DNA技術(shù)，多肽合成等方法制備。
即，新的CC酰基轉(zhuǎn)移酶可以通過在營養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)宿主細胞并從液體培養(yǎng)基中回收新CC?；D(zhuǎn)移酶來制備。此宿主細胞是用含編碼新CC酰基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化了的。
此過程的細節(jié)在下面有更詳細的解釋。
宿主細胞可以是微生物[細菌(如大腸桿菌、枯草桿菌等)，酵母菌(如啤酒酵母菌等)，動物細胞系以及培養(yǎng)的植物細胞]。優(yōu)選的微生物實例包括細菌(特別是屬于埃希桿菌屬的菌株(如E.coliJM109 ATCC 53323，E.coli HB101 ATCC 33694，E.coli HB101-16 FERM BP-1872，E.coli 294 ATCC 31446等))、酵母菌(特別是屬于酵母菌屬的菌株，如啤酒酵母菌AH 22)、動物細胞系(如小鼠L929 細胞，中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等)等等。
當一種細菌，特別是E.coli被用作宿主細胞時，表達載體通常至少包括啟動子一操縱基因區(qū)，起始密碼子，編碼新CC?；D(zhuǎn)移酶氨基酸的DNA，終止密碼子、終止子區(qū)以及可復(fù)制單位。當酵母菌或動物細胞被用做宿主細胞時，表達載體優(yōu)選的至少包含啟動子，起始密碼子，編碼信號肽和新CC?；D(zhuǎn)移酶氨基酸序列的DNA，以及終止密碼子，將增強子序列，新CC?；D(zhuǎn)移酶的5′-和3′-非編碼區(qū)，剪接接界，聚腺苷酸化位點以及可復(fù)制單位也可插入表達載體。
啟動子-操縱基因區(qū)由啟動子、操縱基因和Shine-Dalgarno(SD)序列(例如AAGG等)組成。優(yōu)選的啟動子一操縱基因區(qū)可包括常規(guī)使用的啟動子-操縱基因區(qū)(如E.coli的PL-啟動子和trp-啟動子)和CC?；D(zhuǎn)移酶N-176染色體基因的啟動子。用于酵母菌的新CC?；D(zhuǎn)移酶表達的啟動子可包括TRP1基因的啟動子、ADHI或ADHII基因以及啤酒酵母菌的酸性磷酸酶(pH05)基因。用于哺乳動物細胞新CC?；D(zhuǎn)移酶表達的啟動子可包括SV40早期和晚期啟動子，HTLV-LTR-啟動子，鼠金屬硫蛋白I(MMI)-啟動子，痘苗一啟動子等等。
優(yōu)選的起始密碼子可包含蛋氨酸密碼子(ATG)。
信號肽可包含常規(guī)使用的其它酶的信號肽(天然t-PA信號肽，天然纖溶酶原的信號肽)等等。
編碼新CC?；D(zhuǎn)移酶氨基酸序列的DNA可采用常規(guī)方法制備，如用DNA合成儀部分或全部合成DNA和/或處理來自轉(zhuǎn)化體的插入一合適的載體的編碼天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶的完整DNA序列(如PCCN 176-2)而得，此載體除了用一種合適的酶(如限制性酶、堿性磷酸酶、聚核苷酸激酶、DNA連接酶、DNA聚合酶等)處理外，采用合適的方法如常規(guī)突變方法(如暗盒突變法(cf.Tokunaga，T.et al.，Eur.J.Biochem.153，445-449(1985))，PCR突變方法(cf.Higuchi，R.et al.，Nucleic Acids Res.16，7351-7367(1988))，Kunkel′s方法(cf.Kunkel，T.A.et al.，Methods Enzymol，154，367(1987)等)。
終止密碼子可包括常規(guī)使用的終止密碼子(如TAG，TGA等)。
終止子區(qū)可包括天然或合成的終止子(如合成的fd噬菌體終止子等)。
可復(fù)制單位是一個DNA化合物，它能在宿主細胞中復(fù)制屬于此處的整個DNA序列，并且可以包含天然質(zhì)粒，人工修飾的質(zhì)粒(如從天然質(zhì)粒制備的DNA片段)和合成質(zhì)粒。質(zhì)粒的優(yōu)選實例對E.coli可包括質(zhì)粒pBR 322和它的人工修飾質(zhì)粒(從適當?shù)南拗泼柑幚鞵BR 322而得到的DNA片段)，對酵母菌來說可是酵母2μ質(zhì)粒和酵母染色體DNA，對哺乳動物細胞可以是質(zhì)粒pRSVneo ATCC 37198，質(zhì)粒pSV2dhfrATCC 37145，質(zhì)粒pdBPV-MMTneo ATCC 37224和質(zhì)粒pSV2neo ATCC37149。
增強子序列可包含SV40的增強子(72b.p.)。
聚腺苷酸化位點可包含SV40的聚腺苷酸化位點。
剪接接界可包含SV40的剪接接界。
啟動子、起始密碼子、編碼新CC?；D(zhuǎn)移酶氨基酸序列的DNA、終止密碼子和終止子區(qū)可連續(xù)地環(huán)化地與一個適當?shù)目蓮?fù)制單位(質(zhì)粒)連接，如果需要，用適當?shù)腄NA片段(如接頭，其它限制位點等)用常規(guī)方式(如用限制酶消化，用T4DNA連接酶連接)以得到一個表達載體。
宿主細胞能被表達載體轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染)可用一常規(guī)方式(如用于E.coli的Kushner方法，用于哺乳動物細胞的磷酸鈣法，顯微注射等)進行以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)染體)。
對于通過本發(fā)明方法產(chǎn)生新CC?；D(zhuǎn)移酶，如此獲得的含有表達載體的轉(zhuǎn)化體在水溶性營養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。
所用的營養(yǎng)介質(zhì)含有碳源(如葡萄糖、甘油、甘露糖醇、果糖、乳糖等)和無機或有機氮源(如硫酸銨、氯化銨、酪蛋白水解液、酵母膏、聚蛋白胨、細菌用胰化胨、牛肉膏等)。如果需要，其它營養(yǎng)源[如無機鹽(像磷酸二氫鈉、鉀、磷酸氫二鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈣)，維生素(如維生素B1)，抗生素(如氨芐青霉素，卡那霉素)等等]可以加入到培養(yǎng)基中。對于哺乳動物細胞二培養(yǎng)，常用加有胎牛血清和一種抗生素的Dulbecco′s Modified Eagle′s MinimumEssential Medium(DMEM)培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)化體(包括轉(zhuǎn)染體)的培養(yǎng)通常是在pH 5.5-8.5(優(yōu)選pH 7-7.5)和18-40℃(優(yōu)選20-30℃)進行5-50小時。
當經(jīng)如此產(chǎn)生的新CC?；D(zhuǎn)移酶存在于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)濾液(上清液)通過過濾或離心液體培養(yǎng)基得到。從培養(yǎng)濾液中，新CC?；D(zhuǎn)移酶可以用一般用來純化和分離天然或合成蛋白的的常規(guī)方法來純化(如透析、凝膠過濾、采用抗-CC?；D(zhuǎn)移酶單克隆抗體的親合柱層析、在合適吸附劑上的柱層析、高效液相色譜等等)。如果產(chǎn)生的新CC酰基轉(zhuǎn)移酶存在于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的外周質(zhì)和細胞質(zhì)中，用過濾或離心來收集細胞，其細胞壁或細胞膜用如超聲波和/或溶菌酶處理加以破壞產(chǎn)生碎片和/或裂解物。此碎片和/或裂解物可溶于適當水溶液中(如8M水溶尿素，6M水溶quanidium鹽)。新CC酰基轉(zhuǎn)移酶可從該溶液中用上面舉例的常規(guī)方法加以純化。
本發(fā)明進一步提供了一個制備如下式的化合物或其鹽的方法 此處R1是乙酰氧基、羥基或氫，該方法包含分子式如下的一個化合物或其鹽 此處R1如上面所定義，R2是羧酸?；?，與由包含編碼本發(fā)明的新CC?；D(zhuǎn)移酶DNA的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物的培養(yǎng)基或其加工材料接觸。
R2的羧酸?；梢允侵?、芳香或雜環(huán)羧酸酰基，其適宜的實例是C1-C6鏈烷?；梢詭в羞x自氨基、羥基、羰基、C1-C6鏈烷酰氨、苯甲酰氨基、噻吩基等等的一或二個合適的取代基。
化合物(I)和(II)的適宜的鹽可以是堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽)。
如果CC酰基轉(zhuǎn)移酶活性通常存在于轉(zhuǎn)化細胞中，下面的制備方法可做為液體培養(yǎng)基的加工物質(zhì)的例證。(1)原始細胞用常規(guī)方式，如過濾、離心，從液體培養(yǎng)基中分離；(2)干燥細胞用常規(guī)方式，如冷凍干燥和真空干燥，干燥所述原始細胞而得到；(3)無細胞抽提物用常規(guī)方式(如用有機溶劑使細胞自溶，用氧化鋁、海沙等研磨細胞，或用超聲波處理細胞)，通過破壞所述原始細胞或干燥細胞獲得。(4)酶溶液用常規(guī)方式(如柱層析)，通過純化或部分純化所述的無細胞提取物獲得；(5)固定細胞或酶用常規(guī)方式(如丙烯酰胺、玻璃珠、離子交換樹脂等方法)，通過固定所述的細胞和酶來制備。
包含化合物(II)與酶接觸的反應(yīng)可以在水性介質(zhì)，如水或緩沖液中進行，也就是說，常常通過把培養(yǎng)基或其加工物質(zhì)溶于或懸浮于像水或緩沖液那樣的含有化合物(II)的水性介質(zhì)中來進行反應(yīng)。
優(yōu)選的反應(yīng)混合物的pH，化合物(II)的濃度，反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度可隨所用的培養(yǎng)基或其加工物質(zhì)的性質(zhì)有所變化。一般地，反應(yīng)在pH6到10，優(yōu)選pH7到9；在5到40℃，優(yōu)選5到37℃下進行0.5到50小時。
在反應(yīng)混合物作為底物的化合物(II)的濃度可優(yōu)選自從1到100mg/ml范圍。
以常規(guī)方式，可從反應(yīng)混合物中分離純化由此得到的化合物(I)。
根據(jù)下面提到的步驟測定突變?；D(zhuǎn)移酶的比活。i)GL-7ACA?；D(zhuǎn)移酶活性在預(yù)先在37℃溫育10分鐘的500μlGL-7ACA溶液[10mg/ml，于0.15M Tris·HCl(pH 7.5)]中，加入20ml?；D(zhuǎn)移酶樣品，混合物于37℃保溫5分鐘。加入550μl5％乙酸中止反應(yīng)。所得混合物離心后(在環(huán)境溫度下10,000rpm離心5分鐘)，上清液用于測定7ACA形成。
HPLC條件柱TSKgel ODS-80 TMCTR 4.4mm×100mm(TOSOH)；洗脫液100mM檸檬酸，14.3％(v/v)乙腈中的5.0mM正己烷-1-磺酸鈉；流速1.0ml/min；進樣體積10μl；檢測器254nM。
一個活力單位定義為在37℃，每分鐘能從GL-7ACA合成1.0μmol7ACA的活性。
ii)CC酰基轉(zhuǎn)移酶活性在37℃預(yù)保溫10分鐘的500μlCC溶液中[10mg/ml，在0.15M Tris·HCl(pH 8.7)中的頭孢菌素C鈉鹽，用1N NaOH重調(diào)pH至8.7)，加入20μl?；D(zhuǎn)移酶樣品，并將混合物于37℃溫育10分鐘。加入550μl 5％乙酸終止反應(yīng)。離心(在環(huán)境溫度下10,000rpm 5分鐘)所得混合物，上清液用于7ACA形成的測定。
HPLC條件柱TSKgel ODS-80 TMCTR 4.4mm×100mm(TOSOH)；洗脫液100mM檸檬酸，14.3％(v/v)乙腈中5.0mM正己烷-1-磺酸鈉；流速1.0ml/min；進樣體積20μl，檢測器254nM。
一個活力單位定義為在37℃，每分鐘能從頭孢菌素C鈉鹽合成1.0μmol 7ACA的活性。
附圖的簡要解釋如下

圖1表示用于本說明書工作實施例的DNA寡聚體。
圖2是構(gòu)建pCC001A的圖示。
圖3是構(gòu)建pCC002A的圖示。
圖4是構(gòu)建pCK002的圖示。
圖5是構(gòu)建pCC007A和pCCNt013的圖示。
圖6是構(gòu)建pCC013A的圖示。
圖7是構(gòu)建pΔN176和pCK013的圖示。
圖8是制備mp18p181和mp18p183的圖示。
圖9是制備mp18p181M164A、mp18p181M174A、pCKM174A和pCKM164A的圖示。
圖10是制備pCKS166A的圖示。
圖11是制備pCKM164L和pCKM164G的圖示。
圖12是構(gòu)建mp19pfu62的圖示。
圖13是制備RF DNAs(mp19pfu62M465A、mp19pfu62M506A和mp19pfu62M750A)和表達載體(pCKM465A、pCKM506A和pCKM750A)的圖示。
圖14是制備p269I358K、p269I358S和p269I358L的圖示。
圖15是制備pCCE358R和pCCE358T的圖示。
圖16是制備p164L269Y、p164L269F和p164L269Y305S的圖示。
圖17是制備p164L174A和p164A174A的圖示。
圖18是制備p164A269Y、p164L174A269Y、p164L174A269F和p164A174A269Y305S的圖示。
圖19是制備p164L174A269Y305S750A的圖示。
圖20是制備pCKA49L的圖示。
圖21是制備p49L164L174A269Y的圖示。
圖22表示突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164A的核苷酸及氨基酸序列。
圖23表示突變體CC?；D(zhuǎn)移酶S166A的核苷酸及氨基酸序列。
圖24表示突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M269I/E358K的核苷酸及氨基酸序列。
圖25表示突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L/M174A/M269Y的核苷酸及氨基酸序列。
圖26表示突變體CC?；D(zhuǎn)移酶A49L的核苷酸及氨基酸序列。
下面的實施例中，一些質(zhì)粒、酶(如限制性酶，T4 DNA連接酶)及其它材料是從商業(yè)途徑獲得，并參照供應(yīng)商的說明使用。特別地，在實施例中用作起始材料的質(zhì)粒pCCN176-2和質(zhì)粒pTQiPAΔtrp已保藏于一個國際性保藏單位-National Institute of Bioscienceand Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology in Japan，分別做為轉(zhuǎn)化體E.coli JM109(pCCN176-2)FERM BP-3047和轉(zhuǎn)化體E.coli HB101-16(pTQiPAΔtrp)FERMBP-1870，根據(jù)USP 5,192,678和歐洲專利申請公布No.302456很易得到。其它質(zhì)粒等可根據(jù)說明書的描述，從所述pCCN176-2，pTQiPAΔtrp和可購得的質(zhì)粒容易地制備。用于DNA克隆，宿主細胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)、從培養(yǎng)基中回收新CC酰基轉(zhuǎn)移酶等操作在技術(shù)上是共知的，或可由文獻改動。
下列實施例其目的是為了解釋本發(fā)明，而本發(fā)明不只限于此。實施例1(寡脫氧核糖核苷酸的合成)DNA寡聚體SO-M164A[如圖1(a)所列]是用381A DNA合成儀(Applied Biosystems Inc.)合成的。此DNA用28％氨水從CPG聚合物載體(CPG可控多孔玻璃)上釋放出來，隨后在60℃加熱9小時以脫除所有保護基團。反應(yīng)混合物真空蒸干，殘留物溶于200μl TE緩沖液[10mM Tris·HCl(PH 7.4)-1mM EDTA]中，所得粗DNA溶液用反相HPLC分離[柱子COSMOSIL C18 4.6mm×150mm(Nacalai Tesqul)，洗脫液A0.1M乙酸三乙胺緩沖液(pH 7.2-7.4)，B乙腈，梯度起始A(100％)，終止A(60％)+B(40％)，25分鐘內(nèi)線性梯度，流速1.2ml/min]。收集含有目的DNA寡聚體的洗脫液并真空蒸干。純化的DNA溶于200μl TE緩沖液，使用前貯存于-20℃。
圖1所列所有其它DNA寡聚體用上述相似方式合成和純化。實施例2(在trp啟動子控制下的天然CC?；D(zhuǎn)移酶N176的表達載體的制備)(1)構(gòu)建pCC002A，它是天然CC?；D(zhuǎn)移酶N176的氨芐青霉素抗性表達載體(i)構(gòu)建pCC001A質(zhì)粒pCCN176-3[從質(zhì)粒pCCN176-2(用常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化體E.coli JM109(pCCN176-2)FERM BP-3047得到)制備該質(zhì)粒的方法在JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERINGVol 72，1991的235頁公開](1.0μg)用EcoRI和HindIII滴化，含有CC酰基轉(zhuǎn)移酶N176全部編碼區(qū)的2.9kb片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離。另外，突變體t-PA[用常規(guī)方式及在歐洲專利申請公布No.302456中公開的制備方法可從轉(zhuǎn)化體E.coli HB101-16CpTQiPAΔtrp)FEPM BP-1870獲得]的表達載體pTQiPAΔtrp(1.0μg)用XmaI和XhoI消化，并分離較大的DNA(5113bp)。合成的DNA寡聚體CT-1(5’-CCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA)，CT-2(5’-AGCTTCACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAGTCTAGGTAGTTGGTAACCTTGGTGTACACAC)，TR-1(5’-AGCTTGTCCTCGAGATCAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTTG)and TR-2(5’-TCGACAAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGATCTCGAGGACA)用T4聚核苷酸激酶磷酸化并用T4DNA連接酶連接得到XmaI/SalI DNA片段(114bp)，得到的DNA片段與XmaI/XhoI DNA連接從而得到pTQiPAdtrp。pTQiPAdtrp(1.0μg)用EcoRI和HindIII消化。分離得到的4.3kb DNA含trp啟動子的t-PA編碼區(qū)的一部分(Cys92到Trp113)及fd噬菌體中央終止子的復(fù)制序列。將2.9kb和4.3kb DNA片段混合，在16℃及T4DNA連接酶(300單位，Takara Shuzo)存在情況下，于50mM Tris·HCl，10mM MgCl2，10mM 二巰蘇糖醇和1mM ATP組成的40μl連接緩沖液中連接5小時。連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli JM109。從抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化體可以得到稱作pCC001A的目的質(zhì)粒，并通過限制酶切作圖鑒定。(ii)構(gòu)建pCC002A質(zhì)粒pCC001A含有t-PA基因在trp啟動子和?；D(zhuǎn)移酶基之間的一部分(Cys92到Trp113)。為了除去這個區(qū)域，pCC001A(1.0μg)用ClaI和MluI消化，并分離得到的6.1kb DNA片段，另外，pCCN176-3(1μg)用MluI和Sau3AI消化來分離編碼酰基轉(zhuǎn)移酶Asp7到Arg71的189bp DNA。合成的DNA寡聚體002a和002b(分別與0.5nmol，見下面表1)在37℃ 10μl緩沖液(Kination緩沖液50mM Tris·HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1.0mM ATP)中用T4聚核苷酸激酶磷酸化1小時，反應(yīng)混合物在55℃加熱20分鐘以使酶失活。得到的混合物在15℃ 20μl連接緩沖液中，在T4連接酶存在下與189bp Sau3AI/MluI DNA連接3小時。6.1kb ClaI/MliIDNA片段加入得到的連接混合物中，在加入T4DNA連接酶(300單位)后于4℃保溫16小時。得到的連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coliJM109。所需CC?；D(zhuǎn)移酶N176的表達載體質(zhì)粒pCC002A從某轉(zhuǎn)化體分離到并通過限制酶切作圖鑒定。
表1為CC?；D(zhuǎn)移酶N176的N-末端盒式突變而合成的DNA寡聚體。
(2)CC?；D(zhuǎn)移酶N176的卡那霉素抗性表達載體pCK002的構(gòu)建質(zhì)粒pCC002A用DraI(TOYOBO)消化。生成混合物用酚處理以除去酶，并用乙醇沉淀。回收的DNA懸浮在20μl連接緩沖液中，并與磷酸化的EcoRI接頭(2μg，Pharmacia)混合，然后在4℃與T4DNA連接酶(300單位)保溫16小時。反應(yīng)混合物用酚抽提并乙醇沉淀?；厥盏腄NA用EcoRI消化，并用瓊脂糖凝膠電泳分離生成的5.6kb缺乏氨芐青霉素抗生基因的DNA。另外，質(zhì)粒pA097[從轉(zhuǎn)化體E.coli JM109(pA097)FERM BP-3772獲得]用EcoRI消化，并分離得到的1.2kb卡那霉素抗性DNA。該1.2kb EcoRI DNA在16℃50μl連接緩沖液中用T4DNA連接酶(300單位)與5.6kb EcoRIDNA連接2小時。連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli JM109得到帶有以卡那霉素抗性基因為抗生素標記的目的質(zhì)粒pCK002。實施例3CC酰基轉(zhuǎn)移酶N176的高表達載體(pCK013的構(gòu)建)(1)pCC013A的構(gòu)建(i)pCC007A的構(gòu)建質(zhì)粒pCC001A用EcoRI和MluI消化，并用瓊脂糖凝膠電泳分離生成的6.4kb DNA片段?；厥盏腄NA在16℃用T4DNA連接酶(300單位)與合成的DNA寡聚體007a和007b(各0.5μg表1)連接5小時，007a和007b在連接反應(yīng)前均被磷酸化。生成混合物用來轉(zhuǎn)化E.coli JM109以獲得目的的質(zhì)粒pCC007A。(ii)pCCNt013的構(gòu)建質(zhì)粒pCC007A(1.0μg)用ClaI和BamHI消化，生成的6.1kb DNA用5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。該DNA在T4DNA連接酶(300單位)作用下與合成的寡聚體013a和013b(各0.5μg，均已磷酸化，表1)連接。連接混合物用來轉(zhuǎn)化E.coli JM109，目的質(zhì)粒pCCNt013從氨芐抗性轉(zhuǎn)化體中分離。(iii)pCC013A的構(gòu)建質(zhì)粒pCCNt013用BamHI和MluI消化，并分離生成的6.1kb DNA。此外，pCC002A(1.0μg)用MluI和Sau3AI消化得到189bp DNA片段。生成的DNA在T4DNA連接酶(300單位)作用下與6.1kb BamHI/MluI DNA片段連接，連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coliJM109。從抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化體之一，分離具有AT-豐富的NH2末端DNA序列(編碼與天然CC?；D(zhuǎn)移酶N176相同的氨基酸序列)的目的質(zhì)粒pCC013A。(2)天然CC?；D(zhuǎn)移酶N176的卡那霉素抗性表達載體pCK013的構(gòu)建。(i)pΔN176的構(gòu)建質(zhì)粒pCK002(1.0μg)用AakII(TOYOBO)消化，生成的DNA用T4DNA連接酶(150單位)處理以自連接。連接混合物用來轉(zhuǎn)化E.coli JM109，以得到含單一AtaII限制性內(nèi)切酶位點的質(zhì)粒pΔN176。(ii) pCK013的構(gòu)建質(zhì)粒pΔN176(1.0μg)用AatII消化，此線性化DNA在42℃ 100mM Tris.HCl(pH 8.0)緩沖液中用細菌堿性磷酸酶(1單位，Takara Shuzo)處理1小時。分離脫磷酸化的DNA并在T4DNA連接酶作用下與pCC013A的2.5kb AatII DNA連接。連接混合物用來轉(zhuǎn)化E.coli JM109，得到含卡那霉素抗性基因作標志的目的質(zhì)粒pCK013。實施例4(用Kunkel′s法對編碼CC?；D(zhuǎn)移酶N176的DNA進行點突變)(1)編碼CC?；D(zhuǎn)移酶N176的DNA亞克隆到M13噬菌體(i)制備mp18p181質(zhì)粒pCC013A(一種含氨芐青霉素抗性標志的天然CC?；D(zhuǎn)移酶N176的表達載體，該質(zhì)粒的構(gòu)建在歐洲專利申請公布No.558,241，p.8中公開)用HpaI和SmaI消化。分離編碼CC?；D(zhuǎn)移酶N176 Met1至Pro267的842bp DNA。該DNA在T4DNA連接酶存在下與被SmaI消化的7250bp M13mp18連接，連接混合物用來轉(zhuǎn)化E.coli JM109。從一個噬菌斑分離到目的的RF DNA mp18p181，在該質(zhì)粒中，部分?；D(zhuǎn)移酶以與M13的正向ori相反之方向插入，用限制性酶切圖譜鑒定RF DNA mp18p181。制備RF DNA mp18p181的噬菌體溶液在使用前貯存于4℃。
從來自pCC013A的編碼CC?；D(zhuǎn)移酶N176 Met1至Ala414的1162bp HpaI/Eco47III DNA制備RF DNA mp18p183，并用與上述相似的方法將7250bp M13mp18用HincII消化。(ii)制備單鏈U-mp18p181-SS(cf.Kunkel，T.A.et al.MethodsEnzyml.154，367)E.coli CJ236(dut-，ung-，F(xiàn)′)(Bio-Rad Lab.)的單克隆在37℃含有氯霉素(30μg/ml)的2ml 2XTY培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時。將細胞(0.1ml)轉(zhuǎn)到含30μg/ml氯霉素的新鮮2XTY培養(yǎng)基(50ml)中，并繼續(xù)在37℃培養(yǎng)。當在600nm吸光度達0.3時，將mp18p181的噬菌體溶液(MOI＜0.2)加入培養(yǎng)基。再繼續(xù)培養(yǎng)5小時。4℃ 17000xg離心15分鐘后，將上清液再離心。得到的上清液(30ml)于室溫用RNase(150μg/ml，Sigma)處理30min，然后加入7.5ml PEG溶液(3.5M NH4OAC溶于20％聚乙二醇8000)。離心(17,000xg，15分鐘，4℃)后，殘留物重懸于200μl含300mMNaCl，100mM Tris·HCl(pH 8.0)和0.1mM EDTA的緩沖液中。得到的溶液順次用200μl酚和200μl酚/氯仿(1∶1)抽提，并用氯仿(200μl)洗兩次。將7.5M NH4OAC(100μl)和乙醇(600μl)加入溶液中以沉淀噬菌體DNA。離心收集DNA，用700μl冰冷的90％乙醇洗滌并真空干燥，將純化的單鏈U-DNA(U-mp18p181SS)懸于20μl TE緩沖液中使用前貯于4℃。
用與上述相似的方法制備其它的用于Kunkel′S突變法的單鏈U-DNAs。(2)制備用于突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164A的mp18p181M164A寡聚脫氧核糖核苷酸SO-M164A(0.2nmol)在37℃ 15ml緩沖液(含1.3mMATP，10mM二硫蘇糖醇(DTT)，50mM Tris·HCl，6.6mM于5％聚乙二醇(PEG)6000)中與T4DNA連接酶(10單位)保溫60分鐘。在20μl含10mM Tris·HCl(pH 8.0)，6mM及40mM NaCl的緩沖液中將磷酸化引物(1.5μl，20pmol)與mp18p181 SS-U-DNA(1μl，0.1pmol)混合?；旌衔镉?5℃加熱5分鐘，然后冷卻至室溫超過40分鐘，然后將混合物置于0℃。向混合物中加入T4DNA聚合酶(15單位)，T4DNA連接酶(600單位)，100mM二硫蘇糖醇(DTT，6μl)，10mM ATP(2μl)及5mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP，2μl)。得到的混合物相繼在室溫孵育5分鐘及37℃保溫1.5小時。部分反應(yīng)混合物(1.0μl)加入根據(jù)Sigesada′s方法[Sigesada，K.(1983)SAIBO-KOUGAKU(Japanese)2，616-626]制備的E.coliJM109的感受態(tài)細胞，該細胞在濕冰上孵育30分鐘。將在L培養(yǎng)基(A600＝0.8，200μl)中培養(yǎng)的E.coli JM109加入轉(zhuǎn)化細胞中，并將此細胞混合物加入55℃預(yù)熱的3ml H頂層瓊脂(1％菌胰蛋白胨，0.8％NaCl，0.8％瓊脂)中。將混合物鋪在H平板(1％菌胰蛋白胨，0.8％ NaCl，1.5％瓊脂)上，平板于37℃保溫16小時。從平板上噬菌斑中分離目的RF DNA(mp18p181M164A)，并通過BamHI消化鑒定。(3)制備用于突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164A的pCKM164Amp18p181M164A用MluI及BstBI消化，用瓊脂糖氮膠電泳分離582bp DNA片段。pCK013(一種帶有卡那霉素抗性標記的天然CC?；D(zhuǎn)移酶N176表達載體)也用MluI及BstBI消化，并分離較大的DNA片段。生成的DNA(0.03pmol)在10μl連接緩沖液(66mM Tris·HCl(pH 7.6)，6.6mM，10mM β-巰基乙醇，0.5mM ATP)于環(huán)境溫度在T4DNA連接酶(300單位)作用下與582bp MluI/BstBI DNA(0.15pmol)連接5小時。連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli JM109。從一個卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離目的質(zhì)粒pCKM164A，并用限制性酶切作圖鑒定。轉(zhuǎn)化體稱作E.coli JM190/pCKM164A，其甘油貯存液用常規(guī)方式制備。(4)制備用于突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M174A的mp18p181M174A用與上述相似的方法從mp18p181的SS-U-DNA和DNA寡聚體SO--M174A制備mp18p181M174A。(5)用于突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M174A的表達載體pCKM174A的制備用與上述相似的方法制備突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M174A表達載體及其轉(zhuǎn)化體，分別稱作pCKM174A和E.coli JM109/pCKM174A。用常規(guī)方法制備轉(zhuǎn)化體的甘油貯存液。(6)用于突變體CC?；D(zhuǎn)移酶S166A的表達載體pCKS166A的制備用類似于上述方法，從mp18p183和DNA寡聚體SO-S166A(5′-CATCCGCCAAAGCTTGAACCACACCGCACCCATAAG)制備突變體CC?；D(zhuǎn)移酶S166A的mp18p183S166A。mp18p1835166A用MluI和BetBI消化。分離較小的DNA片段與被MluI及BstBI消化的pCK013的較大DNA片段連接，得到pCKS166A。用它轉(zhuǎn)化E.coli JM109得到轉(zhuǎn)化體E.coliJM109/pCKS166A，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。實施例5(用PCR法對編碼CC酰基轉(zhuǎn)移酶N176的DNA的點突變)(1)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L的表達載體pCKM164L的制備pCK013(模板DNA，0.5fmol)，DNA寡聚體SO-MluFor[引物#1，125pmel，圖1(b)]及SO-M164L[引物#2，125pmol，圖1(b)]在100μl含10mM Tris·HCl(pH9.0)，50mM KCl，0.1％Triton X-100，2.5mM和0.2mM dNTP的緩沖液中與Taq DNA聚合酶(Kurabo，1單位)混合?；旌衔镉玫V物油封并如下進行PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))。初始變性(96℃ 0.5分鐘)后，反應(yīng)完成30個循環(huán)的擴增(97℃ 1.5分鐘，50℃ 2.5分鐘及72℃ 2.5分鐘)。然后終延伸(72℃ 7分鐘)。生成混合物用酚抽提，乙醇沉淀并用BamHI及MluI消化。285bp BamHI/MluI DNA與被BamHI及MluI消化的pCKM164A的較大DNA片段連接。連接反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化E.coliJM190。從一個卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離目的質(zhì)粒pCKM164L，并通過限制酶切作圖鑒定。E.coli JM109用pCKM164L轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/pCKM164L，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(2)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164G表達載體pCKM164G的制備以與上述類似的方法，用pCK013(模板DNA)，DNA寡聚體SO-MluFor[引物#1，圖1(b)]及SO-M164G[圖1(b)]進行突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M164G的DNA片段的突變和擴增。生成的285bpBamHI/MluI DNA與被MluI及BamHI消化的pCKM164A的較大DNA片段連接，得到pCKM164G。用pCKM164G轉(zhuǎn)化E.coli JM109得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/pCKM164G，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(3)其它M164突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的表達載體M164X突變?；D(zhuǎn)移酶(X＝C、D、E、F、H、I、K、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y)的表達載體及其轉(zhuǎn)化體用與上述相似的方法制備。實施例6(其它突變體CC?；D(zhuǎn)移酶表達載體的制備)(1)mp19pfu62的構(gòu)建M13mp19(1.0μg)用SmaI(5單位)和HindIII(5單位)消化，并用瓊脂糖凝膠電泳分離得到的7.2kb DNA。此外，pCK002(此質(zhì)粒的構(gòu)建公開在歐洲專利申請公布No.558,241，p.7)用SmaI和HindIII消化，分離到1.6kb DNA。得到和DNA在20μl連接緩沖液中于15℃并有T4DNA連接酶(300單位)存在下與7.2kb SmaI/HindIII DNA連接2小時。連接混合物用來轉(zhuǎn)化E.ocli JM109得到目的RF DNAmp19pfu62。mp19pfu62單鏈U-DNA(SS-U-DNA)以與實施例2(1)(ii)所述相似的方法制備。(2)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M465A的mp19pfu62M465A的制備以與上述相似的方法從mp19pfu62的SS-U-DNA和DNA寡聚體SO-M465A[圖1(a)]制備mp19pfu62M465A。(3)突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M506A的mp19pfuM506A的制備以與上述相似的方法從mp19pfu62的SS-U-DNA和DNA寡聚體SO-M506A[圖1(a)]制備mp19pfu62M506A。(4)突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M750A的mp19pfu62M750A的制備以與上述相似的方法從mp19pfu62的SS-U-DNA和DNA寡聚體SO-M750A[圖1(a)]制備mp19pfu62M750A。(5)突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M465A的表達載體pCKM465A的制備mp19pfu62M465A用PstI和NcoI消化，用瓊脂糖凝膠電泳分離較小的DNA片段(1271bp)。PCK013也用PstI和NcoI消化。分離較大的DNA，在含有50mM Tris·HCl，10mM，1.0mM DTT及5％PEG 6000的緩沖液中，用T4DNA連接酶將其與1271bp PstI/NcoI DNA連接。連接反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli DH10B。從卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體中，分離目的質(zhì)粒pCKM465A，并通過限制性酶切作圖鑒定。E.coliJM109用pCKM465A轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/pCKM465A，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(6)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M506A的表達載體pCKM506A的制備以與上述相似的方法從pCK013和mp19pfu62 M506A構(gòu)建pCKM506A。E.coli JM109用pCKM506A轉(zhuǎn)化，從而得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/pCKM506A，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(7)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M750A的表達載體pCKM750A的制備以與上述相似的方法從pCK013和mp19pfu62 M750A構(gòu)建pCKM750A。E.coli JM109用pCKM750A轉(zhuǎn)化，從而得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/pCKM750A，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。實施例7(E358突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶的表達載體的制備)(1)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M269I/E358的表達載體的制備(i)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M269I/E358K表達載體p269I358K的制備pCK013用HpaI和MluI(0.5fmol)消化后的較大的DNA片段，DNA寡聚體SO-E358K[5′-TAACCGGGCCATGGCGCGTCTTGACTATATCGAACT，125pmol，列于圖1(b)(ii)]和SO-BstFor[5′-ATCGCGTCTTCGAAATACCGGGCATC，125pmol，列于圖1(b)(ii)]在100μl含有10mMTris·HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.1％明膠，1.5mM和0.2mMdNTP的緩沖液中與Taq DNA聚合酶(TaKaRa，1單位)混合?；旌衔镉玫V物油封并初變性(96℃ 0.5分鐘)，進行25個循環(huán)擴增(97℃1.5分鐘，50℃ 2.5分鐘，72℃ 2.5分鐘)并終延伸(72℃ 7分鐘)。反應(yīng)混合物經(jīng)酚抽提，乙醇沉淀，然后用NcoI和BstBI消化。得到的DNA(290bp)連接到被NcoI及BstBI消化的pCK013的較大DNA片段上。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH10B(購自Gibco-BRL)。從卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離目的的質(zhì)粒p269I358K，并用限制性酶切作圖鑒定。E.coli JM109用p269I358K轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coliJM109/p269I358K，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(ii)突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M269I/E358S和M269I/E358L的表達載體P269I358S和p269I358L的制備以與上述相似的方法從pCK013及DNA寡聚體SO-BstFor和SO-E358S[或SO-E358L，見圖1(b)(ii)]制備M269I/E358S(或M269I/E358L)的表達載體。用p269I358S(或p269I358L)轉(zhuǎn)化E.coliJM109得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p269I358S(或E.coli JM109/p269I358L)，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(2)其它突變體CC?；D(zhuǎn)移酶E358表達載體的制備(i)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶E358R表達載體pCCE358R的制備用與實施例2中所述相似的方法從mp18p183和DNA寡聚體SO-E358R[圖1(b)(ii)]制備突變體CC?；D(zhuǎn)移酶E358R的mp18p183E358R。mp18p183E358R用MluI和NcoI消化后的較小DNA與經(jīng)MluI和NcoI消化后的pCC013A的較大DNA連接，得到pCCE358R。E.coli JM109用pCCE358R轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/pCCE358R，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(ii)突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶E358T的表達載體pCCE358T的制備以與實施例2中所述相似的方法從mp18p183和DNA寡聚體SO-E358T[圖1(b)(ii)]制備突變體CC?；D(zhuǎn)移酶E358T的mp18p183E358T。mp18p183E358T經(jīng)MluI和NcoI消化后的較小的DNA與pCC013A經(jīng)MluI和NcoI消化后的較大的DNA連接得到pCCE358T。E.coli JM109用pCCE358T轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/pCCE358T，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。實施例8(多突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的制備)(1)M164L或M164A與另一種突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的組合(i)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L/M269Y的表達載體p164L269Y的制備pCKM164L用MluI和BstBI消化，分離較小的DNA(582bp)。另外，pCKM269Y(此質(zhì)粒的構(gòu)建方法公開在歐洲專利申請公布No.558,241，p.10上)用MluI和BstBI消化。分離生成的DNA(ca 6.2kb)并連接到582bp MluI/BstBI DNA上。連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli DH10B。從卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離目的p164L269Y，并經(jīng)限制性酶切作圖鑒定。E.coli JM109用p164L269Y轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p164L269Y，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(ii)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L/M269F的表達載體p164L269F的制備pCKM164L用MluI和BstBI消化并分離較小的DNA(582bp)。此外，pCKM269F(此質(zhì)粒的構(gòu)建方法公開在歐洲專利申請公布No.558,241，p.15-16上)被MluI和BstBI消化。分離較大的DNA片段(ca 6.2kb)與582bp MluI/BstBI DNA連接。連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli DH10B。從卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離目的p164L269F，并用限制性酶切作圖鑒定。E.coli JM109用p164L269F轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p164L269F，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(iii)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L/M269Y/C305S的表達載體p164L269Y305S的制備用與上述相似的方法從pCKM164L和p269Y305S(此質(zhì)粒的構(gòu)建方法分開在歐洲專利申請公布No.558,241，p 10上)制備p164L269Y305S。E.coli JM109用p164L269Y305S轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p164L269Y305S，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備(iv)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L/M174A的表達載體p164L174A的制備將來自pCKM164L(模板DNA，0.5fmol)的HpaI/NcoI DNA(1122bp)，DNA寡聚體SO-MluFor[引物#1，125pmol，圖1(b)(i)]和SO-M174A2(5′-GACCGGCAGCGCTAGCGCCCGCCAGAGCTTGA，引物#2，125pmol)在100μl含有10mM Tris·HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.1％明膠，1.5mM和0.2mM dNTP的緩沖液中與Taq DNA聚合酶(TaKaRa，1單位)?；旌稀；旌衔镉玫V物油封并進行初變性(96℃ 0.5分鐘)，25個循環(huán)的擴增(97℃ 1.5分鐘，50℃ 2.5分鐘及72℃ 2.5分鐘)和終延伸(72℃ 7分鐘)。生成混合物用酚抽提、乙醇沉淀，并用MluI和NheI消化。生成的DNA與pCKM174A經(jīng)MluI和NheI消化后較大的DNA片段連接，得到目的質(zhì)粒p164L174A。E.coli JM109用p164L174A轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p164L174A，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(v)突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M164A/M174A的表達載體p164A174A的制備用與上述相似的方法從pCKM164A(模板DNA)，SO-MluFor[引物#1，圖1(b)(i)]、SO-M174A[引物#2，圖1(a)]和pCKM174A(載體DNA)制備164A174A。E.coli JM109用p164A174A轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p164A174A，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(vi)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164A/M269Y的表達載體p164A269Y的制備M164A用MluI和BstBI消化并分離較小的DNA(582bp)。此外，pCKM269Y用MluI及BstBI消化。生成的較大的DNA片段連接到582bpMluI/BstBI DNA，而且連接混合物用來轉(zhuǎn)化E.coli DH10B。從卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體分離目的質(zhì)粒p164A269Y，并經(jīng)限制性酶切作圖鑒定。E.coli JM109用p164A269Y轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p164A269Y，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(vii)突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M164L/M174A/M269Y，M164L/M174A/M269F，和M164A/M174A/M269Y/C305S的表達載體的制備p164L174A用MluI和BstBI消化后的較小的DNA與pCKM269Y(或pCKM269F或p269Y305S)經(jīng)MluI及BstBI消化后的較大DNA片段連接，得到目的載體p164L174A269Y(或p164L174A269F或p164A174A269Y305S)。E.coli JM109用p164L174A269Y(或p164L174A269F或p164A174A269Y305S)轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p164L174A269Y(或E.coli JM109/p164L174A269F或E.coli JM109/p164A174A269Y305S)，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(viii)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A的表達載體p164L174A269Y305S750A的制備pCKM750A用PstI及NcoI消化。分離較小的DNA與p174L174A269Y305S經(jīng)PstI及NcoI消化后的較大的DNA連接，得到目的質(zhì)粒。E.coliJM109用p164L174A269Y305S750A轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p164L174A269Y305S750A，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。(2)A49L與其它突變體?；D(zhuǎn)移酶的組合(i)突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶A49L的mp18p181A49L的制備以與實施例2所述相似的方法從mp18p181的SS-U-DNA和DNA寡聚體SO-A49L制備的mp18p181A49L。(ii)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶A49L的表達載體pCKA49L的制備
mp18p181A49L用ClaI及MluI消化并分離218bp DNA。另外，pCC013A用ClaI及MluI消化。分離生成的較大的DNA并連接到218bpClaI/MluI DNA上。連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli JM109。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中，分離突變體CC?；D(zhuǎn)移酶A49L的表達載體pCCA49L，并有限制性酶切圖譜鑒定。pCCA49L的250bp HpaI/MluIDNA片段與pCK013經(jīng)HpaI及MluI消化后的較大DNA片段連接，得到pCKA49L。(iii)天然CC?；D(zhuǎn)移酶和突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶A49L的表達比較用常規(guī)方法，通過質(zhì)粒pCKA49L(或pCK013)轉(zhuǎn)化E.coli JM109制得的E.coli JM109/pCKA49L(或JM109/pCK013)的甘油貯存液(1ml)轉(zhuǎn)入100ml含50μg/ml卡那霉素的L液體培養(yǎng)基中，該混合物在30℃培養(yǎng)8小時。經(jīng)培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基(3.75ml)加入25ml含25μg/ml卡那霉素的N-3培養(yǎng)基(成分5％大豆汁，1％甘油，1.25％ K2HPO4，0.38％KH2PO4，50μg/ml鹽酸硫胺，2mMMgSO4·7H2O，0.2mM CaCl2·2H2O，0.05mM FeSO4·7H2O)，該混合物在22.5℃培養(yǎng)16小時。在第16小時，向培養(yǎng)基中加入終濃度為20μg/ml的3-吲哚丙烯酸(IAA)再繼續(xù)培養(yǎng)56小時。離心收集細胞(于4℃，14000rpm，15分鐘)，懸浮于40ml TE緩沖液(pH 8.0)并超聲裂解。裂解物于4℃ 14000rpm離心20分鐘，得到上清液(稱作“湯”部分)。殘留物重懸于40ml含100mM Tris·HCl(pH 8.0)，1mM EDTA及8M尿素的緩沖液中，并超聲裂解。離心除去不溶物質(zhì)，收集上清(稱作“ppt”部分)。用15％ SDS-PAGE分析突變體CC?；D(zhuǎn)移酶A49L和天然CC?；D(zhuǎn)移酶N176的“湯”及“ppt”部分。通過天然CC?；D(zhuǎn)移酶突變?yōu)橥蛔凅wCC酰基轉(zhuǎn)移酶A49L，細胞不溶性前體蛋白大大減少。通過反相HPLC測定了“湯”中相應(yīng)于成熟酰基轉(zhuǎn)移酶(天然CC?；D(zhuǎn)移酶或突變體CC?；D(zhuǎn)移酶A49L)總量的結(jié)果(下表)。
A49L(單位/ml培養(yǎng)基)天然(單位/ml培養(yǎng)基)72.635.6(iv)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶A49L/M164L/M174A/M269Y的表達載體p49L164L174A269Y的制備p164L174A269Y的772bp MluI/NcoI DNA與pCKA49L經(jīng)MluI和NcoI消化后的較大DNA連接，得到目的質(zhì)粒p49L164L174A269Y。E.coli JM109用p49L164L174A269Y轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體E.coli JM109/p49L164L174A269Y，其甘油貯存液用常規(guī)方法制備。實施例9(突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的表達和純化)(1)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶M164A的表達將E.coli JM109/pCKM164A(0.5ml)的甘油貯存液加入50ml含50μg/ml卡那霉素的L培養(yǎng)基，混合物在30℃培養(yǎng)8小時。然后將經(jīng)培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基(3.75ml)轉(zhuǎn)入25ml含1％甘油和12.5μg/ml卡那霉素的N-3培養(yǎng)基(5.0％大豆浸液(Osaka Shokuhinn Kagaku)，0.608％ Na2HPO4，0.7％ KH2PO4，0.7％K2HPO4，0.12％(NH4)2SO4，0.02％ NH4Cl，0.0011％ FeSO4·7H2O，0.0011％CaCl2·2H2O，0.000276％MnSO4·nH2O，0.000276％AlCl3·6H2O，0.00011％ CoCl2·6H2O，0.0000552％ ZnSO4·7H2O，0.0000552％NaMoO4·2H2O，0.0000276％ CuSO4·7H2O，0.0000138％H3BO4，50μg/mlvitamin B1，0.048％ MgSO4)中?；旌衔镉?0-22℃溫育88小時，并在開始培養(yǎng)后16小時加入β-吲哚丙烯酸(終濃度20μg/ml)，16及24小時加入甘油(終濃度1.0％)。離心(4℃，8000rpm 10分鐘)收集細胞，懸浮于10ml TE緩沖液(10mM Tris·HCl(pH 8.0)，1.0mM EDTA)并超聲裂解。離心(4℃，15000rpm，20分鐘)后，上清液(粗裂解物)在貯存于4℃?zhèn)溆谩?2)M164A的純化用0.45μm column guarb(Millipore)過濾粗裂解物(1.0ml)并上樣到TSK-gelTM DEAE-5PW(TOSOH，4.6×50mm)高壓液相色譜柱。洗脫為30分鐘內(nèi)從80％ A緩沖液[25mM Tris·HCl(pH 8.0)]+20％B緩沖液
到50％A緩沖液+50％B緩沖液的凹型梯度洗脫，流速1.0ml/min。用230nm處吸光率監(jiān)測洗脫過程。收集用約0.16M NaCl洗脫的最后一個主峰，得到突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶M164A的純品。(3)其它突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的表達以與上述相似的方法，培養(yǎng)帶有另一表達載體(如pCKM164L，pCKM164G，pCKM174A，pCKM465A，pCKM506A，pCKM750A，p164L/269Y，p164L/269Y/305S，p164L/174A/269Y/305S，p269I/358K，p269I/358S，p164L/269F，p164L/174A/269F，pCKS166A，p164L/174A/269Y/305S/750A，p164A/269Y，pCK49L和和p49L/164L/174A)的E.coli JM109，并制備其粗裂解物。(4)其它突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶的純化
以與上述相似的方法，其它突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶(如M164L、M164G、M174A、M465A、M506A、M750A、M164L/M269Y、M164L/M269Y/C305S、M164L/M174A/M269Y/S305S、M269I/E358K、M269I/E358S、M164L/M269F、M164L/M174A/M269F、S166A、M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A、M164A/269Y、和A49L/M164L/M174A)從各自的粗裂解物純化。(5)突變體CC?；D(zhuǎn)移酶的鑒定通過12.5％ SDS-PAGE分析和反相HPLC鑒定純化的突變體CC?；D(zhuǎn)移酶如M164A，M164L，M164G，M174A，M465A，M506A，M750A，M164L/M269Y，M164L/M269Y/C305S，M164L/M174A/M269Y/S305S，M269I/E358K，M269I/E358S，M164L/M269F，M164L/M174A/M269F，S166A，M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A，M164A/269Y，和A49L/M164L/M174A。在β-巰基乙醇存在下進行SDS-PAGE分析，證實每種純化的?；D(zhuǎn)移酶由2個獨立亞基組成，α和β亞基分別對應(yīng)25.4KDa和58.4KDa的肽，通過它們在凝膠電泳上的遷移率來計算其分子量。在HPLC分析中，每種純化的?；D(zhuǎn)移酶解離為2個獨立的肽——α和β亞基，分別在大約8.7和5.8分鐘被洗脫下來[HPLC條件下，柱5C4-AR-300，4.6×50mm；洗脫10分鐘內(nèi)從35％到70％含0.05％三氟乙酸的乙腈水溶液的線性梯度；檢測214nm]。每種突變體?；D(zhuǎn)移酶的兩個亞基通過反相HPLC系統(tǒng)分離，并用473A蛋白測序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng))通過氨基末端序列分析確定其與天然?；D(zhuǎn)移酶序列相同。實施例10(DNA序列分析)用373A DNA測序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng))測定突變體?；D(zhuǎn)移酶，如M164A，M164L，M164G，M174A，M465A，M506A，M750A，M164L/M269Y，M164L/M269Y/C305S，M164L/M174A/M269Y/S305S，M269I/E358K，M269I/E358S，M164L/M269F，M164L/M174A/M269F，S166A，M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A，M164A/269Y，and A49L/M164L/M174A的載體的DNA序列，并證實其與預(yù)期的相同。實施例11(CC?；D(zhuǎn)移酶活性)用與上述相同的方法測定各突變體?；D(zhuǎn)移酶在pH 8.7的CC酰基轉(zhuǎn)移酶活性，列于表2。結(jié)果見表2。
表2CC?；D(zhuǎn)移酶的相對活性(*將天然型視為100％)
實施例12(GL-7ACA酰基轉(zhuǎn)移酶活性)用與上述相同的方法測定各突變體?；D(zhuǎn)移酶在pH 7.5的GL-7ACA?；D(zhuǎn)移酶活性，列于表3。結(jié)果見表3。
表3GL-7ACA?；D(zhuǎn)移酶的相對活性(*將天然型視為100％)
權(quán)利要求
1.一種突變體CC?；D(zhuǎn)移酶，其中在天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的Ala49、Met164、Ser166、Met174、Glu358、Met465、Met506或Met750位置上至少一個氨基酸被一種不同的氨基酸取代。
2.權(quán)利要求1的突變體頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶，在其被加工成α-亞基和β-亞基之前，其前體形式用下列式子表示A1-48-X1-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6-A466-505-X7-A507-749-X8-A751-773其中A1-48與天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶的Thr1到Glu48的氨基酸序列相同，A50-163與天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶的Asp50到Leu163的氨基酸序列相同，A167-173與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Val167到Arg173的氨基酸序列相同，A175-357與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Leu175到Val357的氨基酸序列相同，A359-464與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Thr359到Ala464的氨基酸序列相同，A464-505與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Pro466到Ile505的氨基酸序列相同，A507-749與天然CC?；D(zhuǎn)移酶的Lys507到Ala749的氨基酸序列相同，A751-773與天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶的Val751到Ala773的氨基酸序列相同，X1是丙氨酸或一種不同的氨基酸，X2、X4、X6、X7和X8各為蛋氨酸或一種不同的氨基酸，X3為絲氨酸或一種不同的氨基酸，以及X5為谷氨酸或一種不同的氨基酸，條件是上式中Met269和/或Cys305可被不同的氨基酸取代，且當X1是丙氨酸，X2、X4、X6、X7和X8均為蛋氨酸時，X3為絲氨酸及X5是谷氨酸以外的一種氨基酸。
3.權(quán)利要求2的突變體頭孢菌素C酰基轉(zhuǎn)移酶，其中X1為亮氨酸，X3為丙氨酸，Mey269被酪氨酸取代。
4.編碼權(quán)利要求1的頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶的DNA。
5.含有權(quán)利要求4的DNA的表達載體。
6.由權(quán)利要求5的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
7.生產(chǎn)權(quán)利要求1的突變體頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶的方法，包括在一種水性營養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)權(quán)利要求6的宿主細胞，并從經(jīng)培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中回收突變體頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶。
8.制備式(I)的化合物或其鹽的方法 其中R1是乙酰氧基，羥基或氫，該方法包括將式(II)的化合物或其鹽 其中R1與上面定義的相同，R2是羧酸酰基，與權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化體的經(jīng)培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基或其加工材料接觸。
全文摘要
一種突變體CC酰基轉(zhuǎn)移酶，其中天然CC酰基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的Ala
文檔編號C12N15/55GK1150823SQ94194758
公開日1997年5月28日 申請日期1994年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月1日
發(fā)明者丹羽峰雄, 齋藤善正, 藤村高穗, 石井芳則, 野口/嗣 申請人:藤澤藥品工業(yè)株式會社