專利名稱：：能有效發(fā)酵葡萄糖與木糖的重組酵母的制作方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明一般是涉及能同時(shí)將纖維質(zhì)物質(zhì)中的兩種主要糖份，葡萄糖與木糖，發(fā)酵為乙醇的基因工程酵母。更具體地，本發(fā)明是涉及這類酵母可通過在能發(fā)酵葡萄糖為乙醇的酵母中克隆一個(gè)木糖還原酶基因，一個(gè)木糖醇脫氫酶基因，一個(gè)木酮糖激酶基因而構(gòu)建成。最新的研究表明，乙醇是汽車的理想的液體燃料。它可直接用做純?nèi)剂?100％乙醇)或以不同濃度與汽油混合使用。用乙醇來補(bǔ)充或替代汽油可減輕許多國家對(duì)進(jìn)口石油的依賴，同時(shí)也為運(yùn)輸工業(yè)提供一種可再生的燃料。進(jìn)一步，已證明乙醇是一種較常規(guī)汽油更清潔的燃料，因?yàn)樗尫诺江h(huán)境中的污染物較后者要少得多。例如，已經(jīng)證明，將氧化物摻入到汽油中，可減少有害物一氧化碳排放到空氣中。在幾種通常用于提高汽油氧含量的氧化物中，乙醇的氧含量最高。美國環(huán)保局(EPA)的資料表明，汽油里摻入10％的乙醇可減少一氧化碳排放量約25％～30％。到目前為止，用于發(fā)醇生產(chǎn)工業(yè)用乙醇的原料仍是來源于甘蔗或甜菜的糖類及來源于玉米或其它農(nóng)作物的淀粉。然而，用這些農(nóng)作物作原料來大規(guī)模生產(chǎn)乙醇燃料是太浪費(fèi)了。植物，由于其可再生，價(jià)格便宜且數(shù)量巨大，因而成為發(fā)酵生產(chǎn)乙醇燃料的一種有吸收力的原料。早在二十年前人們就知道可以對(duì)農(nóng)作物里的糖進(jìn)行微生物發(fā)酵，并對(duì)產(chǎn)生的乙醇加以利用。來源于纖維素質(zhì)的主要可發(fā)酵糖類是葡萄糖與木糖(葡萄糖與木糖的比例大約為2或3到1)。當(dāng)然，對(duì)纖維素質(zhì)最有價(jià)值的發(fā)酵過程是將葡萄糖和木糖完全轉(zhuǎn)化為乙醇。不幸的是，至今還沒有發(fā)現(xiàn)一種天然存在的微生物能夠同時(shí)有效地既發(fā)酵葡萄糖又發(fā)酵木糖。酵母，特別是酵母屬(Saccharomyces)的，習(xí)慣上用于將富含葡萄糖的原料發(fā)酵為乙醇，如今仍然是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇的最佳微生物。然而，這些發(fā)酵葡萄糖的酵母卻不能發(fā)酵木糖，也不能利用其進(jìn)行生長；但他們能利用木酮糖進(jìn)行生長，并將其發(fā)酵(圖1)，雖然各種酵母的有效率不同。例如，釀造酵母(S.cerevisiae)僅能很微弱地發(fā)酵木酮糖，而裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的菌株，則能進(jìn)行十分有效地發(fā)酵(Chiang等，1981；Lastick等，1989)。雖然發(fā)酵葡萄糖的酵母不能利用木糖進(jìn)行生長與發(fā)酵，但是，有許多天然酵母在有氧條件下能利用木糖進(jìn)行生長，但卻不能將木糖發(fā)酵為乙醇。這些能利用但不能發(fā)酵木糖的酵母依賴兩種酶一木糖還原酶和木糖醇脫氫酶—來將木糖直接轉(zhuǎn)化為木酮糖(圖1)。酵母木糖還原酶和木糖醇脫氫酶作用時(shí)均需要輔助因子；木糖還原酶需NADPH做輔酶，木糖醇脫氫酶需NAD做輔酶。相反，細(xì)菌木糖異構(gòu)酶不需要輔助因子，而直接將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖(圖1)。二十年前，人們做了很多的努力企圖發(fā)現(xiàn)能有效地將葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化為乙醇的新酵母，雖然這種理想的酵母沒有找到，但這些努力確實(shí)也沒有白費(fèi)。例如，發(fā)現(xiàn)少數(shù)酵母不僅能在有氧條件下利用木糖進(jìn)行生長，也能將木糖發(fā)酵為乙醇(Toivola等，1984；Dupreez和VanderWalt，1983)，雖然這些發(fā)酵木糖的酵母中沒有一種能夠完全有效地將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇(Jeffries，1985)。另外，這些酵母均不能有效地發(fā)酵葡萄糖。在這些發(fā)酵木糖酵母中，對(duì)三種菌，管囊酵母(Pachysolentannophilus)(Toivola等，1984)，石氏假絲酵母(Candidashehatae)(Dupreez和VanderWalt，1983)，和樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)(Grootjen等，1990)的特性進(jìn)行了深入的研究。樹干畢赤酵母和石氏假絲酵母發(fā)酵木糖時(shí)比其它發(fā)酵木糖的酵母更有效(Grootjen等，1990)。然而，即使是最好的發(fā)酵木糖的酵母在發(fā)酵木糖時(shí)效率也不高，并且不能發(fā)酵葡萄糖(Jeffries，1985)。在過去的十年里，人們致力利用重組DNA技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)地發(fā)酵葡萄糖的酵母，特別是釀造酵母，進(jìn)行基因改造。最初的努力集中在將木糖異構(gòu)酶基因克隆到酵母中去，使其能不依靠輔酶直接將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖。然而，這些努力沒有成功，因?yàn)榫幋a各種細(xì)菌木糖異構(gòu)酶的基因在釀造酵母中不能指導(dǎo)合成出有活性的酶(Rosenfeld等，1984；Ho等；1983；Sarthy等，1987；Wilhelm和Hollenberg，1984；Amore等，1989年)。前幾年，人們的研究目標(biāo)是得到能發(fā)酵木糖的基因工程酵母，特別是釀造酵母，重點(diǎn)放在對(duì)編碼木糖還原酶(Takama等，1991；Hallborn等，1991；Strasser等，1990)，木糖醇脫氫酶(Ketter等，1990；Hallborn等，1990)，和木酮糖激酶(stevis等，1987；Chang和Ho，1988；Ho和Chang，1989；Deng和Ho，1990)的基因進(jìn)行克隆。釀造酵母和其它發(fā)酵葡萄糖的酵母均不含有任何可檢測(cè)出的木糖還原酶或木糖醇脫氫酶活性，但似乎都含有木酮糖激酶活性。因此，發(fā)酵葡萄糖的酵母都能發(fā)酵木酮糖，只是各自的效率不同(Deng和Ho，為1990)。最近，Ketter等(1990)，Strasser等(1990)，和Hallborn等(1990；1991)，已將木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因克隆到了釀造酵母中。但是，這些基因工程酵母仍然不能有效地發(fā)酵木糖。例如，這些酵母只能發(fā)酵不到2％的木糖。此外，它們從木糖產(chǎn)生大量的木糖醇，使得寶貴的木糖底物從希望的產(chǎn)生乙醇的發(fā)酵途徑轉(zhuǎn)向了產(chǎn)木糖醇的途徑。以上詳細(xì)的背景介紹表明，雖然眾多的研究者經(jīng)過了一致不懈的努力，但能有效地發(fā)酵葡萄糖和木糖為乙醇的酵母仍沒有得到。因此，仍然需要找到這類酵母以及其制備和使用方法。鑒于此，遞交上本發(fā)明。發(fā)明概述本發(fā)明的特征在于如下發(fā)現(xiàn)可通過重組DNA技術(shù)和基因克隆技術(shù)得到能有效地單獨(dú)發(fā)酵木糖或同時(shí)也發(fā)酵葡萄糖的新酵母菌株。具體地說，這些技術(shù)被用于產(chǎn)生新的含有克隆的木糖還原酶(XR)基因，木糖醇脫氫酶(XD)基因，和木酮糖激酶(XK)基因的重組酵母。這些基因與不被存在葡萄糖抑制的啟動(dòng)子融合(fused)在一起。據(jù)此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是提供一種重組酵組菌株，該菌株含有導(dǎo)入的編碼木糖還原酶，木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因，能將木糖發(fā)酵為乙醇。這株重組酵母菌優(yōu)選地也能將葡萄糖發(fā)酵為乙醇和這種更為優(yōu)選的能有效地同時(shí)發(fā)酵這兩種糖為乙醇的酵母菌已經(jīng)得到，在這些菌株中，XR、XD和XK基因與不被存在的葡萄糖抑制也不需木糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子融合在一起。本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方案是提供一種含有編碼木糖還原酶，木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因的重組酵母菌株。其中，所述基因與不被葡萄糖抑制的啟動(dòng)子融合在一起，和其中該重組酵母能將木糖發(fā)酵為乙醇。這個(gè)重組酵母菌株優(yōu)選地也能將葡萄糖發(fā)酵為乙醇。本發(fā)明的第三種優(yōu)選的實(shí)施方案涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組酵母的各種試劑。因此，本發(fā)明也提供了一個(gè)包含編碼木糖還原酶、木糖酶脫氫酶、木酮糖激酶的各種基因的重組DNA分子。本發(fā)明還提供了一個(gè)包含編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的各種基因的載體。在這些試劑中，各基因優(yōu)選地與不被葡萄糖抑制也不需木糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子融合，使得能方便地產(chǎn)生能同時(shí)將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇的重組酵母。本發(fā)明的第四種優(yōu)選的實(shí)施方案是提供一種獲得能將木糖發(fā)酵為乙醇的重組酵母的方法。這種方法包括將DNA引入到酵母中的步驟，使得酵母具有引入的編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因。優(yōu)選地是這些基因能被融合到不被葡萄糖抑制的啟動(dòng)子上，使得能同時(shí)將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇。更為有利的是，例如，利用上面討論的本發(fā)明的各種試劑，可同時(shí)將這三種基因引入到酵母中。本發(fā)明的第五種優(yōu)選的實(shí)施方案是提供將木糖或葡萄糖發(fā)酵為乙醇的方法。該方法包括用一株含引入的編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因的重組酵母菌發(fā)酵含木糖或含葡萄糖的培養(yǎng)基的步驟。理想的狀況是將三種引入的基因與不被葡萄糖抑制的啟動(dòng)子相融合，并且培養(yǎng)基中既含葡萄糖也含木糖，以便能同時(shí)將木糖和葡萄糖發(fā)酵為乙醇。本發(fā)明其它的優(yōu)選實(shí)施方案、特征及優(yōu)點(diǎn)，在隨后的說明書中，會(huì)給以更加清楚的描述。附圖的簡要說明圖1為細(xì)菌和酵母中與木糖代謝早期階段相關(guān)的各種酶類的圖解。圖2表示包括5′和3′-側(cè)翼序列在內(nèi)的酵母木酮糖激酶基因的核苷酸序列及衍生的氨基酸序列。起始密碼和終止密碼下面均已畫線，位于5′-和3′-端非編碼區(qū)域的可能的調(diào)控序列由箭頭標(biāo)出。圖3表示克隆在質(zhì)粒pLSK15上的基因及該質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。圖4表示克隆在質(zhì)粒pUCKm10上的基因及該質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。圖5表示克隆在質(zhì)粒pLNH21上的基因及該質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。圖6A表示用重組酵母SC(pLNH21)(含有引入的XR、XD和XK基因的釀造酵母)發(fā)酵木糖(I)2天；和(II)4天，所得發(fā)酵液的HPLC層析圖譜。圖6B表示用重組酵母SC(pLNH13-32)(含引入的XR和XD基因，不含XK基因的釀造酵母)發(fā)酵木糖(I)2天，和(II)6天，所得發(fā)酵液的HPLC層析圖譜。圖6C表示用非基因工程菌釀造酵母(不含引入的XR、XD或XK基因)發(fā)酵木糖(I)2天，和(II)7天，所得發(fā)酵液的HPLC層析圖譜，詳細(xì)描述見例6。圖7表示克隆在質(zhì)粒pLNH33上的基因及該質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。圖8A表示用非基因工程酵母菌1400(不含引入的XR、XD或XK基因)發(fā)酵含葡萄糖和木糖(相應(yīng)為10％和5％)的培養(yǎng)基(I)0天；(II)2天，所得發(fā)酵液的HPLC層析圖譜。詳細(xì)描述見例8。圖8B表示用重組酵母1400(pLNH33)(含引入的XR、XD和XK基因的酵母1400)發(fā)酵含葡萄糖和木糖(分別為10％和5％)的培養(yǎng)基(I)0天；(II)2天，所得發(fā)酵液的HPLC層析圖譜。詳細(xì)描述見例8。圖9為含有克隆的XR、XD和XK基因的質(zhì)粒pBluescriptIIKS(-)的構(gòu)建圖解已建成4種這類質(zhì)粒pKS(-)-KK-A*R-KD-1；pKS(-)-KK-A*R-KD-2；pKS(-)-KK-AR-KD-3；和pKS(-)-KK-AR-KD-4，詳細(xì)描述見例4。圖10表示用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)從樹干畢赤酵母染色體DNA得來的完整的木糖醇脫氫酶基因和不含啟動(dòng)子的XD進(jìn)行直接擴(kuò)增；從左至右，第一列分子標(biāo)準(zhǔn)，BamHI-EcoKI降解入DNA；第二列畢赤氏酵母木糖醇脫氫酶基因(完整的)；第三列畢赤氏酵母木糖醇脫氫酶基因(不含啟動(dòng)子的)；第四列分子標(biāo)準(zhǔn)，HaeIII降解φxDNA。圖11為測(cè)定酵母木酮糖激酶基因序列的設(shè)計(jì)方案圖。圖12為質(zhì)粒pLNH21的構(gòu)建圖解。圖13表示用釀造酵母SC(pLNH13-32)(僅含XR和XD基因)發(fā)酵葡萄糖(10％)和木糖(5％)混合物(I)0天；(II)2天；(III)5天，所得發(fā)酵液的HPLC層析圖譜。圖14表示用非基因工程樹干畢赤酵母發(fā)酵葡萄糖(10％)和木糖(5％)混合物(I)0天；(II)3天；(III)5天，所得發(fā)酵液的HPLC層析圖譜。發(fā)明詳述為了增進(jìn)對(duì)本發(fā)明原理的理解，對(duì)某些實(shí)施方案給出參考文獻(xiàn)，并用專業(yè)語言加以敘述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍是不受限制的，正如本文作為精選的例示所表明的對(duì)本發(fā)明原理的改變，進(jìn)一步的修正及應(yīng)用，通常是該發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以作出的。本發(fā)明提供了重組酵母，DNA分子和包含XR、XD和XK基因的載體。眾所周知，這些基因廣泛存在于各種微生物中，事實(shí)上，正如前面所討論的，大量的XR、XD和XK基因已被確定并分離出來。這些基因各自的來源對(duì)于本發(fā)明的各個(gè)方面并不是關(guān)鍵的。進(jìn)一步說，任何編碼具有木糖還原酶活性(即在NADPH或NADH作輔酶時(shí)，能將D-木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇)，木糖醇脫氫酶活性(NAD+作輔酶時(shí)，能將木糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖)，或木酮糖激酶活性(能將D-木酮糖轉(zhuǎn)化為5-磷酸-D-木酮糖)的蛋白質(zhì)(酶)的DNA，都是適合的。這些基因可以天然存在的形式被得到，或以修飾的形式被得到，例如，通過堿基的增加，取代或缺失使得天然存在的基因被修飾，只要被編碼的蛋白質(zhì)仍具有XR、XD或XK活性。同樣，這些基因或基因組分可由現(xiàn)成的技術(shù)合成出來，只要生成的基因編碼的蛋白質(zhì)具有所需的XR、XD或XK活性。作為例子，合適的XR和XD基因來源包括能利用木糖的酵母如石氏假絲酵母、樹干畢赤酵母；合適的XK基因來源包括上述的能利用木糖的酵母，以及不能利用木糖的酵母如那些來自酵母屬的，如釀造酵母，裂殖酵母屬的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，和細(xì)菌如大腸桿菌，芽胞桿菌屬的菌種及鏈霉菌屬的菌種等。利用一些常規(guī)方法可從這些來源獲得感興趣的基因。例如，雜交、互補(bǔ)或PCR技術(shù)都可用于此種目的。申請(qǐng)人所用的特定的XR基因是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從樹干畢赤酵母中克隆出的(Chen和Ho，1993)。用PCR對(duì)從染色體DNA得到的XR基因進(jìn)行擴(kuò)增，所需的寡核苷酸鏈根據(jù)已報(bào)道的樹干畢赤酵母XR基因的序列進(jìn)行合成(Takama等，1991)。擴(kuò)增出的XR基因首先被克隆并貯存在pUC19中，然后，將克隆的XR基因融合到不同的啟動(dòng)子上，這些啟動(dòng)子包括酵母TRP5基因的啟動(dòng)子(zalkin和Yanofsky，1982)和酵母乙醇脫氫酶I基因(ADC1)的啟動(dòng)子(Ammerer，1983；Bennetzen和Hall，1982)。申請(qǐng)人研究所用的XD基因也通過PCR從樹干畢赤酵母中克隆出。由畢赤酵母染色體DNA得來的XD基因的擴(kuò)增所需的寡核苷酸鏈，根據(jù)已報(bào)道的畢赤酵母XD基因的序列加以合成(ketter等，1990)。同樣，擴(kuò)增的基因先克隆并貯存在PUC19中。隨后，這個(gè)基因被融合到酵母丙酮酸激酶基因(PYK)(Burke等，1983)和酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GPD)(Holland和Holland，1979)的糖酵解啟動(dòng)子上。申請(qǐng)人已克隆三種不同的XK基因，它們來自釀造酵母(Ho和Chang，1989)、管囊酵母(stevis等，1987)和大腸桿菌并且發(fā)現(xiàn)在融合于高效酵母啟動(dòng)子之后這三種基因都能有效地在釀造酵母中表達(dá)。在此，用克隆的釀造酵母木酮糖激酶基因做說明性的工作。為了幫助正確地將酵母XK基因融合到合適的啟動(dòng)子上，對(duì)包括5′-、3′-端非編碼在內(nèi)的釀造酵母XK基因的全部核苷酸序列進(jìn)行了分析，見圖2。各種不同的啟動(dòng)子都適合于本發(fā)明。廣義的講，與酵母相容的能控制XR、XD或XK基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子都適用。這類啟動(dòng)子可從大量的來源得到，包括酵母、細(xì)菌及其它細(xì)胞來源。用于本發(fā)明的啟動(dòng)子優(yōu)選是高效的，不被葡萄糖抑制，不需木糖誘導(dǎo)的。關(guān)于這一點(diǎn)，其中所述“高效”的啟動(dòng)子指的是能高水平地轉(zhuǎn)錄所融合的基因。具有這些特性的啟動(dòng)子也很容易得到。這類啟動(dòng)子在本發(fā)明中的應(yīng)用，本文給出了指導(dǎo)，但啟動(dòng)子與XR、XD、XK基因的融合，啟動(dòng)子/基因融合物克隆到適合的載體中，載體對(duì)酵母菌的轉(zhuǎn)化，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員都可以完成。所有的這些操作步驟用本領(lǐng)域和文獻(xiàn)中常見的常規(guī)基因工程技術(shù)即可完成。下面，對(duì)申請(qǐng)人的例示性工作給予更具體的敘述。將酵母木酮糖激酶基因XK融合到酵母乙醇脫氫酶基因(ADC1)，酵母丙酮酸激酶基因(PYK)，酵母TRP-5基因等的啟動(dòng)子上。融合到TRP-5啟動(dòng)子上的XK基因用于構(gòu)建pLNH21(圖5)，融合到PYK啟動(dòng)子上的XK基因用于構(gòu)建pLNH33(圖7)。XR、XD和XK基因與ADC1、PYK、GPD等的完整啟動(dòng)子的融合。通過克隆含有特定啟動(dòng)子的片段和XR、XD或XK的結(jié)構(gòu)基因到一個(gè)BluescriptKS質(zhì)粒上(stratagene，LaJolla，CA)而得以完成，然后通過專一位總誘變除去多余的不需要的核苷酸(Kunkel等，1987)。本發(fā)明還提供了幾種pBluescriptIIKS(-)(以后簡稱pKS(-)衍生物，它們都含有克隆的XD(與丙酮酸脫氫酶啟動(dòng)子融合)，XR(與ADC1子融合)，XK(與丙酮酸激酶啟動(dòng)子融合)基因。這些重組質(zhì)粒被叫做pKS(-)KD-AR(或A*R)-KK。4種這樣的質(zhì)粒已經(jīng)建成，詳見圖9。這些質(zhì)粒具有相似但不相同的結(jié)構(gòu)。克隆到這些質(zhì)粒上的XR、XD和XK(或KD-AR(或A*R)-KK)基因通過一個(gè)單位點(diǎn)xhoI的限制性降解，可同親代質(zhì)粒pKS(-)分開。然后，將融合到適當(dāng)啟動(dòng)子上的XR、XD和XK基因克隆到pLSK15(圖3)或pUCKm10(圖4)上。pLSK15，由pLX10-14衍生而來(Stevis和Ho，1985)，為一低拷貝數(shù)質(zhì)粒，在酵母(釀造酵母)中的拷貝數(shù)約為10。它含有酵母的2μ的復(fù)制子，使質(zhì)粒在釀造酵母及相近的其它種中能自動(dòng)復(fù)制。pLSK15還含有遺傳霉素(卡那霉素)抗性基因(KmR)和氨芐青霉素抗性基因(ApR也可ampr)，它們?cè)卺勗旖湍负推渌湍钢谐洚?dāng)選擇性標(biāo)記。pSK15還含有與酵母TRP-5啟動(dòng)子融合的XK基因。因而，與含有適合啟動(dòng)子的適當(dāng)?shù)?′-非端碼序列相融合的XR、XD基因，被插入到pLSK15上以證明這個(gè)生成的質(zhì)粒對(duì)酵母木糖發(fā)酵的影響。為此比較不同基因的存在對(duì)酵母木糖發(fā)酵的影響，用一種只含XR和XD基因的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化釀造酵母，轉(zhuǎn)化后的酵母再用于比較發(fā)酵。用非基因工程釀造酵母，含有克隆的XR、XD和XK(SC(pLNH21))基因的酵母及含有克隆的XR、XD，但不含XK(SC(pLNH這13-32))基因的酵母分別對(duì)木糖進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見圖6A、6B和6C。pUCKm10(圖4)是一種高拷貝數(shù)質(zhì)粒(即質(zhì)粒的拷貝數(shù)約為50或更多)，在釀造酵母中的拷貝數(shù)接近100。pUCKm10由PUC19衍生而來，含有與pLSK15相同的2μ的復(fù)制子，KmR及ApR基因。這些特定的片段充當(dāng)復(fù)制子，選擇標(biāo)記，使得質(zhì)粒在釀造酵母(及相關(guān)酵母)中能自動(dòng)復(fù)制。同樣，使得含此質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子能同未轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞區(qū)分開來。申請(qǐng)人在重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了pUCKm10，這些重組質(zhì)粒含有相同的XR、XD和XK基因，這些基因與包含適合啟動(dòng)子的5′-端適當(dāng)?shù)姆蔷幋a序列融合。設(shè)計(jì)的這些載體對(duì)轉(zhuǎn)化所有的釀造酵母菌株及相關(guān)酵母的菌株都適用。不需要特定的突變體充當(dāng)受體菌株。象pLNH33(圖7)及pLNH21(圖5)這樣的質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)化工業(yè)釀造酵母及其它酵母菌。用pLSK15或pUCKm10的衍生質(zhì)粒對(duì)酵母的轉(zhuǎn)化作用，通常采用Becker和Guarente(1991)的方法得以完成。含有pLSK15或pUCKm10衍生質(zhì)粒的真正的酵母轉(zhuǎn)化子，由下述方法可被分離。質(zhì)粒中的KmR充當(dāng)初始選擇標(biāo)記，它使任何含有一個(gè)這類質(zhì)粒的寄主細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中存在的更高濃度的遺傳霉素產(chǎn)生抗性。然而，一些酵母細(xì)胞可被誘導(dǎo)變?yōu)榭古c含質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子具有相同水平的遺傳霉素。因此，并非每一個(gè)抗遺傳霉素的克隆都是真正的轉(zhuǎn)化子。已有報(bào)道表明，ApR能在釀造酵母中表達(dá)，但后者在無ApR存在時(shí)，對(duì)氨芐青霉素具有抗性，這樣，對(duì)于質(zhì)粒介導(dǎo)的酵母的轉(zhuǎn)化，ApR不能充當(dāng)選擇性標(biāo)記。然而，含有高表達(dá)ApR的酵母將產(chǎn)生足夠的青霉素酶，使得通過青霉素酶實(shí)驗(yàn)(chevallier和Aigle，1979)能夠分辨出長在特定固體平板上的含有這種酵母的克隆。后一種實(shí)驗(yàn)提供了一種可以遺傳霉素抗性克隆中分辨出釀造酵母和其它酵母的真正轉(zhuǎn)化子的技術(shù)。在厭氧條件下，用本發(fā)明的重組酵母，可以完成酵母的木糖(或葡萄糖和木糖)發(fā)酵，詳述見例6到例9。發(fā)酵過程中，糖(木糖和葡萄糖)的消耗量，乙醇及其它產(chǎn)物如木糖醇的生成量，可通過取樣，并用HPLC進(jìn)行分析而測(cè)得，進(jìn)一步的說明見例6。例如，用pLNH21(圖5)轉(zhuǎn)化釀造酵母，生成的含pLNH21的轉(zhuǎn)化子叫做SC(pLNH21)。該轉(zhuǎn)化子在2-4天時(shí)間里可將5％的木糖幾乎全部轉(zhuǎn)化為乙醇，如圖6A所證明。作為另外的例子，用pLNH33(圖7)轉(zhuǎn)化酵母菌株1400，該菌株與釀造酵母密切相關(guān)，對(duì)乙醇和溫度有很高的耐受力(D′Amore等，1989；D′Amore，1990)。這個(gè)生成的基因工程酵母，被叫做1400(pLNH33)。該酵母在2-4天內(nèi)，能將10％的葡萄糖和5％的木糖全部發(fā)酵為乙醇，而不需要很高的細(xì)胞密度，如圖8A和8B所示。在對(duì)木糖發(fā)酵時(shí)，pLNH33質(zhì)粒比pLNH21質(zhì)粒更為有效，因?yàn)榍罢叩目截悢?shù)更高些。再者，pLNH33中XK融合的啟動(dòng)子比pLNH21中XK融合的啟動(dòng)子更為有效。也可用pLNH33轉(zhuǎn)化釀造酵母，生成的轉(zhuǎn)化子叫做SC(pLNH33)。雖然在發(fā)酵木糖或木糖與葡萄糖混合物時(shí)，SC(pLNH33)比SC(pLNH21)更有效，但也發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵木糖與葡萄糖混合物時(shí)，1400(pLNH33)比SC(pLNH33)更有效。因此，菌株本身也會(huì)對(duì)發(fā)酵的效率產(chǎn)生影響。與釀造酵母類似，非基因工程菌1400也不能利用或發(fā)酵木糖(單獨(dú)存在或與葡萄糖混合存在)，如圖8B所示。一般而言這些發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，酵母具有三種引入的基因XR、XD和XK是必需的，它們恰當(dāng)?shù)嘏c合適的啟動(dòng)子融合在一起(最好是有效的糖酵解或別的啟動(dòng)子，不被葡萄糖抑制，也不需木糖誘導(dǎo))，協(xié)調(diào)地表達(dá)這些基因，使得酵母只將木糖發(fā)酵為乙醇，而不生成別的副產(chǎn)物如木糖醇等。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，除去克隆XR和XD基因外，還克隆一個(gè)木酮糖激酶基因(XK)，其重要性在于使酶母能有效地發(fā)酵木糖，特別是當(dāng)葡萄糖和木糖同存于一個(gè)培養(yǎng)基中時(shí)，如纖維素類物質(zhì)的水解液中，能同時(shí)發(fā)酵這兩種糖。與XR和XD基因類似，這個(gè)克隆的XK基因最好與一個(gè)適合的有效的糖酵解或別的啟動(dòng)子融合，這個(gè)啟動(dòng)子不被葡萄糖抑制，也不被木糖誘導(dǎo)。申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)，僅含克隆的XR和XD基因的酵母，當(dāng)葡萄糖和木糖同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，只能將葡萄糖發(fā)酵為乙醇，而不能將木糖發(fā)酵為乙醇(見圖13)。申請(qǐng)人的結(jié)果還表明，對(duì)于任何酵母來說，包括發(fā)酵木糖的酵母如釀造酵母、石氏假絲酵母，要想在葡萄糖和木糖同時(shí)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，能同時(shí)將這兩種糖發(fā)酵為乙醇，必需具有XR、XD和XK基因，并且這些基因均與不被葡萄糖抑制，也不需木糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子融合。圖13表明，釀造酵母及相關(guān)酵母，若僅含有與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子融合的克隆的XR和XK基因，則當(dāng)葡萄糖與木糖同時(shí)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)，僅能將葡萄糖，而不能將木糖發(fā)酵為乙醇。同樣，圖14表明，含有原始XR、XD和XK基因的非基因工程樹干畢赤酵母，在葡萄糖與木糖作為碳源存在于同一培養(yǎng)基中時(shí)，不能發(fā)酵木糖；而僅木糖為培養(yǎng)基中唯一碳源時(shí)，則能發(fā)酵木糖(結(jié)果未寫出)。應(yīng)當(dāng)知道，對(duì)于那些木酮糖激酶活力很低的酵母，引入XK基因有兩個(gè)目的。一是提高該酶的活力水平，高XK活力更有利于酵母將木糖發(fā)酵為乙醇而不是木糖醇；二是為了使基因處于不被葡萄糖抑制的有效的啟動(dòng)子控制之下。眾所周知，包括酵母在內(nèi)的天然野生型微生物，當(dāng)葡萄糖存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)，便不能利用其它糖進(jìn)行生長與發(fā)酵，葡萄糖將抑制代謝其它糖分子所需的酶類的合成(稱為葡萄糖效應(yīng))。因此，不能選擇由指導(dǎo)糖分子，包括葡萄糖、代謝酶類合成的基因得來的啟動(dòng)子，因?yàn)檫@類啟動(dòng)子對(duì)兩種來源豐富的糖不能提供同步發(fā)酵。此外，申請(qǐng)人的工作表明，細(xì)胞生長是誘導(dǎo)的先決條件。因此，在XR、XD或XK基因表達(dá)時(shí)，不選擇需要木糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。為了進(jìn)一步增進(jìn)對(duì)本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)的理解，下面給出了許多實(shí)例。應(yīng)當(dāng)明白，實(shí)際上這些例子僅是說明性的，而非限定性的。實(shí)例1用PCR技術(shù)合成XR和XD基因用PCR技術(shù)合成完整的或不含啟動(dòng)子的XR基因已有報(bào)道(chen和Ho，1993)。在用PCR技術(shù)合成XD之前，需根據(jù)XD的核苷酸序列(koetter等，1990)合成出三條寡核苷酸鏈，如下所示寡核苷酸鏈IpTCTAGACCACCCTAAGTCG寡核苷酸鏈IIpCACACAATTAAAATGA寡核苷酸鏈IIIpGGATCCACTATAGTCGAAG寡核苷酸鏈I和II用于合成完整的XD基因，寡核苷酸鏈II和III用于合成不含啟動(dòng)子的XD基因，如圖10所示，完整的XD和不含啟動(dòng)子的XD基因首先被克隆到pKS(-)質(zhì)粒中。然后，將完整的XR基因亞克隆到質(zhì)粒pUCKm10(圖4)中，生成的質(zhì)粒pUCKm10-XD采用例5中描述的電穿孔法去轉(zhuǎn)化釀造酵母。檢測(cè)酵母轉(zhuǎn)化子的木糖醇脫氫酶活性以證明克隆的基因是完整的，并能在釀造酵母中表達(dá)。實(shí)例2不含啟動(dòng)子的XD基因融合到酵母丙酮酸激酶基因的啟動(dòng)子上選擇XD基因與PPK的融合(fusion)來闡明用定點(diǎn)誘變技術(shù)將代謝木糖的基因準(zhǔn)確地融合到完整的啟動(dòng)子上。這些啟動(dòng)子可以是糖酵解啟動(dòng)子，也可以是那些被培養(yǎng)基中存在的葡萄糖抑制，也不需木糖來誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。如同例1中合成XD基因一樣，用PCK技術(shù)合成了從-910到+23的酵母丙酮酸激酶的啟動(dòng)子片段(Burke等，1983)。PPK片段和不含啟動(dòng)子的XD都被亞克隆到質(zhì)粒PKS(-)中，介于PPK和完整的XD結(jié)構(gòu)基因間的不必要的核苷酸采用位點(diǎn)專一誘變將其去掉，詳見Kunkel的方法(Kunkel，1987)。得到的融合基因含有丙酮酸激酶基因的-910到-1的啟動(dòng)子片段，畢赤氏酵母XD基因的+1到+1963核苷酸片段。生成的含PPK-XD(或XD)的質(zhì)粒PKS(-)被叫做PKS(-)KD或pKD2。實(shí)例3酵母丙酮酸激酶基因核苷酸序列的分析關(guān)于含有酵母丙酮酸激酶基因的一個(gè)7.0Kb酵母(釀造酵母)DNA片段的克隆已有報(bào)道(Ho和Chang，1989)。通過亞克隆使得XK基因位于一個(gè)2.4kb的片段上。這個(gè)2.4kb片段的核苷酸序列已經(jīng)分析出來。5′-端非編碼區(qū)域含有345個(gè)核苷酸。翻譯區(qū)域含有2118個(gè)核苷酸。由XK編碼的丙酮酸激酶基因含有591個(gè)氨基酸，如圖2所示。測(cè)定XK基因序列的方案見圖11。實(shí)例4完整的ADC1啟動(dòng)子的構(gòu)建PMA56質(zhì)粒(Ammerer，1983)含有酵母乙醇脫氫酶I啟動(dòng)子(PADC1)。申請(qǐng)人在其工作中利用這個(gè)啟動(dòng)子來修飾某些基因。例如，PADC1與XR融合在一起，生成的基因叫做PADC1-XR或AR。但是，這個(gè)PADC1是不完整的，缺少完整啟動(dòng)子ADC1的-1到-14核苷酸片段(Bennetzen和Hall，1982)。一個(gè)基因的-1到-14區(qū)域通常在控制蛋白質(zhì)合成方面有重要意義。任何與這種啟動(dòng)子融合的基因在控制基蛋白質(zhì)產(chǎn)物合成時(shí)必須依賴其原有的基因信號(hào)。為了更好地控制與啟動(dòng)子ADC1融合的基因的表達(dá)，申請(qǐng)人采用位點(diǎn)專一誘變將缺失的核苷酸序列(-1到-14)增加到克隆在PMA56上的啟動(dòng)子ADC1上。這個(gè)新的完整的啟動(dòng)子ADC1叫做p*ADC1。這個(gè)啟動(dòng)子與XR連接，生成的基因叫做p*ADC1-XR或A*R。實(shí)例5PLNH21質(zhì)粒的構(gòu)建(也叫pLSK15-KD-AR)以及用pLNH21轉(zhuǎn)化釀造酵母與1400pLNH21的構(gòu)建如圖12所示。在下述條件下采用電穿孔法用pLNH21轉(zhuǎn)化釀造酵母和菌株1400。取50ml生長到早對(duì)數(shù)期(克萊特單位(kleHUnit)(KU)130)的酵母細(xì)胞，離心除去培養(yǎng)基，用冷水洗兩遍，其中一次含有1M冷山梨醇，再重新懸浮于200μ11M山梨醇中。將60μl上述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)先滅菌的4μl塑料管(帶蓋)中，加入0.1～1μg質(zhì)粒DNA。用吸管吸取50μl生成的細(xì)胞和質(zhì)?；旌衔铮尤氲揭活A(yù)先冷卻的電極寬度為0.2cm的基因電擊杯中，杯中的混合物受到由基因電擊儀的電擊控制器(BioRad)控制的2.0KV，25μF，200ohms的電擊。立即將0.5mlYEPD(1％酵母提取液，2％蛋白胨，及2％葡萄糖)加入到電擊杯中，然后將杯中的細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的已滅菌的4ml塑料管中，30℃保溫1小時(shí)。取100μl細(xì)胞涂到含YEPD和50μg/mlG418(遺傳菌素)的瓊脂平板上。將迅速生長的菌落選出，重新涂在另一含相同培養(yǎng)基的平板上。這些選出的菌落用氨芐青霉素試驗(yàn)(Chevallier和Aigle，1979)檢測(cè)，直到一個(gè)陽性菌落被檢測(cè)出來。以上敘述的電穿孔步驟是基于Beeker和Guarente(1971)的報(bào)道。我們所用的抗G418轉(zhuǎn)化子的選擇方法是十分有效的，大多數(shù)選出的菌落在含YEPD和50μg/mlG418的平板上復(fù)制，用青霉素酶試驗(yàn)檢測(cè)都是陽性的。pLNH21或其它質(zhì)粒對(duì)菌株1400的轉(zhuǎn)化，其步驟與上述步驟類似。除了細(xì)胞生長到140-190KD而不是130KU，用于電穿孔后轉(zhuǎn)化子最初選擇的YEPD平板含有40μg/ml遺傳菌素G418而不是50g/ml。通過上述步驟對(duì)菌株1400的轉(zhuǎn)化不象釀造酵母的轉(zhuǎn)化那樣有效。實(shí)例6用基因工程SC(pLNH21)，SC(pLNH13-32)及非基因工程親代釀造酵母對(duì)木糖的發(fā)酵這三種酵母在同等條件下于豐富培養(yǎng)基YEPD中需氧培養(yǎng)(SC(pLNH13-32)通過一個(gè)叫做pLNH13-32的質(zhì)粒對(duì)釀造酵母轉(zhuǎn)化而建成，該質(zhì)粒僅含與啟動(dòng)子融合的XR和XD基因)。然后，同樣在同等條件下，在YEP(1％酵母提取液，2％蛋白胨)培養(yǎng)基中，這些酵母細(xì)胞被用于厭氧發(fā)酵5％的木糖。在發(fā)酵過程中，于適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔取樣，在下述條件下用HPLC分析樣品，以確定木糖的消耗量及乙醇和木糖醇的生成量。從培養(yǎng)基中取出含培養(yǎng)液(0.6ml～1.0ml)的樣品放入1.5ml的Eppendorf管中，離心除去細(xì)胞及其它殘?jiān)缓?，上清液用無菌的aerodisc(GelmanSciences)，0.2～0.45mm的針筒式濾器進(jìn)一步過濾。用高壓液相色譜(HPLC)分析每一種樣品濾液的乙醇、葡萄糖、木糖及木糖醇含量。測(cè)定時(shí)根據(jù)下列條件采用Hitachi系統(tǒng)。°柱子AminexHPX-87C，300X7.8mm°流動(dòng)相水°流速0.8ml/min°檢測(cè)HitachiL-3350RI檢測(cè)儀°溫度80℃°加樣體積20μl圖6A、6B及6C的結(jié)果表明(由于儀器靈敏度，在這些圖及其它圖中的乙醇峰實(shí)際上比他們應(yīng)該有的小21/2倍)，只有含克隆的XR、XD和XK的基因工程SC(pLNH21)能將高濃度的木糖(5％)發(fā)酵為乙醇，而非基因工程親代釀造酵母，以及僅含有克隆的XD、XR而不含XK的基因工程SC(pLNH13-32)則不能。SC(pLNH13-32)將大多數(shù)木糖發(fā)酵為木糖醇。實(shí)例81400(pLNH33)有效地將高濃度的葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇在相同的條件下，用菌株1400與1400(pLNH33)發(fā)酵葡萄糖和木糖的混合物(大約10％的葡萄糖和5％的木糖)。這些酵母保留在含有適當(dāng)培養(yǎng)基的瓊脂平板上，分別將其直接從平板上接種到裝有50mlYEPD培養(yǎng)液(1％酵母提取液，2％蛋白胨及2％葡萄糖)的250ml的Erlenmeyer燒瓶中，此燒瓶裝有側(cè)臂，使得用klett比色計(jì)能直接監(jiān)測(cè)酵母培養(yǎng)液的生長情況。培養(yǎng)液在30℃、200rpm的搖床上需氧培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到對(duì)數(shù)生長中期(400klett單位)，在每一個(gè)燒瓶中加入12.5ml(40％)葡萄糖，6.25ml(40％)木糖，混勻后，取出1ml培養(yǎng)液混合物作為對(duì)照。然后，用saran包裝膜將燒瓶封住，使得發(fā)酵在厭氧條件下進(jìn)行。每隔一定的時(shí)間(每24hr)，取出1ml發(fā)酵液(含細(xì)胞)作樣品，用于檢測(cè)發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的糖含量與乙醇含量。樣品中乙醇、葡萄糖、木糖及木糖醇的含量用HPLC來測(cè)定，詳細(xì)方法見例6。圖8A與8B的結(jié)果表明，基因工程酵母1400(pLNH33)在2-4天時(shí)間內(nèi)，并且不需要高密度的細(xì)胞，就可同時(shí)將10％葡萄糖與5％木糖發(fā)酵為乙醇。另一方面，親代酵母菌1400僅能將葡萄糖發(fā)酵為乙醇，不能將木糖發(fā)酵為乙醇。該發(fā)酵過程在常規(guī)條件下進(jìn)行，不需要特殊的培養(yǎng)基及pH，也不需要酵母細(xì)胞生長到高細(xì)胞密度。因此，含有XR、XD及XK基因的基因工程酵母1400(pLNH33)，其中各基因與糖酵解啟動(dòng)子相融合，并克隆到高拷貝質(zhì)粒pUCKm10上，在2-4天時(shí)間內(nèi)，可同時(shí)將高濃度的葡萄糖與木糖發(fā)酵為乙醇，并且只有極少的副產(chǎn)物木糖醇生成。實(shí)例9嘗試用基因工程SC(pLNH13-32)對(duì)木糖/葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵重復(fù)例8的發(fā)酵過程，只是用釀造酵母SC(pLNH13-32)(只含XR和XD基因)做為發(fā)酵微生物。圖13的結(jié)果表明，這種只含XR和XD基因的非基因工程酵母，當(dāng)葡萄糖與木糖同時(shí)存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)，只能發(fā)酵葡萄糖而不能發(fā)酵木糖。實(shí)例10嘗試用非基因工程樹干畢赤酵母發(fā)酵木糖/葡萄糖重復(fù)例8的發(fā)酵過程，除了用非基因工程樹干畢赤酵母做發(fā)酵微生物。用HPLC檢測(cè)發(fā)酵了(I)0天；(II)3天；及(III)5天的發(fā)酵液樣品，結(jié)果見圖14。結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖與木糖同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，樹干畢赤酵母只能發(fā)酵葡萄糖而不能發(fā)酵木糖。雖然已用附圖及前述的說明對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的敘述，但均為說明性的而非限定性的。應(yīng)當(dāng)明白，前面列出并加以說明的僅是優(yōu)選的實(shí)施方案，所有的在本發(fā)明構(gòu)思范圍內(nèi)的變化與修飾都要求受到保護(hù)。參考文獻(xiàn)下列文獻(xiàn)，均為提供示范性步驟或?qū)Υ税l(fā)明中提出的步驟給予細(xì)節(jié)補(bǔ)充，在此專門引入作為參考。Ammerer，G.，″ExpressionofgenesinyeastusingtheADC1promoter，″MethodsinEnzymol.101，192-201(1983).Amore，R.，M.Wilhelm，andC.P.Hollenberg，″ThefermentationofxyloseAnanalysisoftheexpressionofBacillusandActinoplanesxyloseisomerasegenesinyeast，″Appl.Microbiol.Biotechnol.，30(4)，351-357(1989).Becker，D.，andL.Guarente，″Highefficiencytransformationofyeastbyelectroporation，″MethodsinEnzymol.194，182-186(1991).Bennetzen，J.L.andB.D.Hall，″TheprimarystructureoftheSaccharomycescerevisiaegeneforalcoholdehydrogenaseI，″J.Biol.Chem.，257(6)，3018-3025(1982).Burke，R.L.，P.Tekamp-Olson，andR.Najarian，″Theisolation，characterization，andsequenceofthepyruvatekinasegeneofSaccharomycescerevisiae，″J.Biol.Chem.258(4)2193-2201(1983).Chang，S.F.andN.W.Y.Ho，″Cloningtheyeastxylulokinasegenefortheimprovementofxylosefermentation.″Appl.BiochemBiotechnol.17，313-318(1988).Chen，Zhengdao，andN.W.Y.Ho，″CloningandimprovingtheexPressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae，″Appl.Biochem.Biotechnol.，39-40，135-147(1993).Chevallier，M.R.andM.Aigle，″Qualitativedetectionofpenicillinaseproducedbyyeaststrainscarryingchimericyeast-coliplasmids，″FEBSLetters，108(1)179-184(1979).Chiang，L-C，H-Y.Hsiao，P.P.Ueng，L-F.Chem，andG.T.Tsao.″Ethanolproductionfromxylosebyenzymicisomerizationandyeastfermentation，″Biotechnol.Bioeng.，11，263-274(1981).D′Amore，C.G.，I.Russell，andG.G.Stewart，″Selectionandoptimizationofyeastsuitableforethanolproductionat40℃，″Enz.Microbiol.Technol.，11，411(1989).D′Amore，T.，C.J.Panchal，I.Russell，andG.G.Stewart，″AstudyofethanoltoleranceinyeastCriticalReviews，″Biotechnol.，9，287(1990).Deng，X.X.andN.W.Y.Ho，″XylulokinaseactivityinvariousyeastsincludingSaccharomycescerevisiaecontainingtheclonedxylulokinasegene，″Appl.Biochem.Biotechnol.，24-25，193(1990).DuPreez，J.C.andJ.P.vanderWalt，″FermentationofD-xylosetoethanolbyastrainbyCandidashehatae，″Biotechnol.Lett.，5，357-362(1983).Grootjen，D.R.J.，R.G.J.M.vanderlans，andK.Ch.A.M.Luyben，″EffectsoftheaerationrateonthefermentationofglucoseandxylosebyPichiastipitisCBS5773，EnzymeMicrob.Technol.，12，20-23(1990).Hallborn，J.，M.Walfridsson，U.Airaksinen，H.Ojamo，B.Hahn-Hagerdal，M.Penttila，andS.Keranen，″XylitolproductionbyrecombinantSaccharomycescerevisiae，Bio./Technol.，9，1090(1991).Ho，N.W.Y.，andS-F.Chang，″CloningofyeastxylulokinasegenebycomplementationofE.coliandyeastmutations，″EnzymeMicrob.Technol.，11，417(1989).Ho，N.W.Y.，P.Stevis，S.Rosenfeld，J.J.Huang，andG.T.Tsao，″ExpressionofE.colixyloseisomerasegenebyayeastpromoter，″BiotechnologyandBioengineringSymposium，No.13，245-250(1983).Holland，J.P.andM.J.Holland，″Theprimarystructureofaglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasegenefromSaccharomycescerevisiae，″J.Biol.Chem.253(19)9839-9845(1979).Jeffries，T.W.，″EmergingtechnologyforfermentingD-xyloseTrendsinbiotechnology3(8)，208-212(1985).Jeffries，T.W.，″Utilizationofxylosebybacteria，yeasts，andfungi，″Adv.inBiochem.Engr.Biotechnol.27，1-32(1983).Ketter，P.，R.Amore，C.P.Hollenberg，andM.Ciriacy，″IsolationandcharacterizationofthePichiastipitisxylitoldehydrogenasegene，XYL2，andconstructionofaxylose-utilizingSaccharomycescerevisiaetransformant，″Curr.Genet.，18，493-500(1990).Ktter，P.andM.Ciriacy，″XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae，″Appl.Microbiol.Biotechnol.，38，776-783(1993).Kunkel，T.A.，J.P.Roberts，andR.a.Zakour，″Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection，″MethodsEnzymol.，154，367-382(1987).Lastick，S.，M.Y.Tucker，J.R.Beyett，G.R.Noll，andK.Grohmann.″Simultaneousfermentationandisomerizationofxylosetoethanol，″Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，574-579(1989).Rosenfeld，S.，P.Stevis，andN.W.Y.Ho，″CloningandcharacterizationofthexylgenesfromE.coli，″Mol.Gen.Genetics，194，410-415(1984).Sarthy，A.V.，etal.，″ExpressionoftheE.colixyloseisomerasegeneinS.cerevisiae，Appl.Environ.Microb.，53，1996-2000(1987).Stevis，P.A.，J.J.Huang，N.W.Y.Ho，″CloningofthepachysolentannophilusxylulokinasegenebycomplementationinEscherichiacoli.″ApplEnviron.Micro.(53)1，2975-2977(1987).Stevis，P.A.andN.W.Y.Ho，″OverproductionofD-xyloseisomeraseinE.colibyCloningtheD-xyloseIsomerasegene″，EnzymeMicrob.Technol.，Vol.7，pp.592-596(1985).Strasser，A.W.M.，C.P.Hollenberg，M.Ciriacy，P.Ketter，R.Amore，M.Piontek，andJ.Hagedorn，″Cloningofyeastxylosereductaseandxylitoldehydrogenasegenesandtheiruse，″Germanpatentapplication(1990).Takuma，S.，N.Nakashima，M.Tantirungkij，S.Kinoshita，H.Okada，T.Seki，andT.Yoshida，″IsolationofxylosereductasegeneofPichiastipitisanditsexpressioninSaccharomycescerevisiae，″Appl.Biochem.Biotechnol.，27-28，327(1991).Toivola，A.，D.Yarrow，E.vandenBosch，J.P.vanDijken，andW.A.Scheffers.″AlcoholicfermentationofD-xylosebyyeasts，″Appl.Environ.Microbiol.，47(6)，1221-1223(1984).Wilhelm，M.，andC.P.Hollenberg，″SelectivecloningofBacillussubtilisxyloseisomeraseandxylulokinaseinEcoligenesbyIS5-mediatedexpression，″theEMBOJournal，3，2555-2560(1984).Zalkin，H.andC.Yanofsky，J.Biol.Chem.257，1491-1500(1982).(1)一般資料(i)申請(qǐng)人NancyHo和GeorgeT.Tsao(ii)發(fā)明題目能有效發(fā)酵葡萄糖與木糖的重組酵母(iii)序列號(hào)1(iv)相應(yīng)地址(A)戶主ThomasQ.Henry(B)街道BankOneTower，Suite3700，111MonumentCircle(C)城市Indianapolis(D)州Indiana(E)國家USA(F)郵編46204(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)中介類型軟盤，3.50inch，1.4Mb內(nèi)存(B)計(jì)算機(jī)COMPAQ(C)操作系統(tǒng)MSDOS(D)軟件ASCII(vi)現(xiàn)在的申請(qǐng)日期(A)申請(qǐng)?zhí)?8/148,581(B)申請(qǐng)日期1993，11，8(C)分類(vii)在先的申請(qǐng)日期無(viii)代理人資料(A)姓名ThomasQ.Henry(B)注冊(cè)號(hào)28，309(C)參考/摘要號(hào)PUR17/18(ix)電信資料(A)電話(317)634-3456(B)電傳(317)637-7561(2)1號(hào)序列ID資料(i)序列特征(A)長度2467堿基對(duì)(B)類型核苷酸氨基酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子(ii)分子類型基因組DNA(xi)序列圖序列ID1號(hào)GGATCCAAGACCATTATTCCATCAGAATGGAAAAAAGTTTAAAAGATCAC50GGAGATTTTGTTCTTCTGAGCTTCTGCTGTCCTTGAAAACAAATTATTCC100GCTGGCCGCCCCAAACAAAAACAACCCCGATTTAATAACATTGTCACAGT150ATTAGAAATTTTCTTTTTACAAATTACCATTTCCAGCTTACTACTTCCTA200TAATCCTCAATCTTCAGCAAGCGACGCAGGGAATAGCCGCTGAGGTGCAT250AACTGTCACTTTTCAATTCGGCCAATGCAATCTCAGGCGGACGAATAAGG300GGGCCCTCTCGAGAAAAACAAAAGGAGGATGAGATTAGTACTTTAATGTTG351MetLeu1TGTTCAGTAATTCAGAGACAGACAAGAGAGGTTTCCAACACA393CysSerValIleGlnArgGlnThrArgGluValSerAsnThr51015ATGTCTTTAGACTCATACTATCTTGGGTTTGATCTTTCGACC435MetSerLeuAspSerTyrTyrLeuGlyPheAspLeuSerThr202530CAACAACTGAAATGTCTCGCCATTAACCAGGACCTAAAAATT477GlnGlnLeuLysCysLeuAlaIleAsnGlnAspLeuLysIle3540GTCCATTCAGAAACAGTGGAATTTGAAAAGGATCTTCCGCAT519ValHisSerGluThrValGluPheGluLysAspLeuProHis455055TATCACACAAAGAAGGGTGTCTATATACACGGCGACACTATC561TyrHisThrLysLysGlyValTyrlleHisGlyAspThrIle606570GAATGTCCCGTAGCCATGTGGTTAGGGGCTCTAGATCTGGTT603GluCysProValAlaMetTrpLeuGlyAlaLeuAspLeuVal758085CTCTCGAAATATCGCGAGGCTAAATTTCCATTGAACAAAGTT645LeuSerLysTyrArgGluAlaLysPheProLeuAsnLysVal9095100ATGGCCGTCTCAGGGTCCTGCCAGCAGCACGGGTCTGTCTAC687MetAlaValSerGlySerCysGlnGlnHisGlySerValTyr105110TGGTCCTCCCAAGCCGAATCTCTGTTAGAGCAATTGAATAAG729TrpSerSerGlnAlaGluSerLeuLeuGluGlnLeuAsnLys115120125AAACCGGAAAAAGATTTATTGCACTACGTGAGCTCTGTAGCA771LysProGluLysAspLeuLeuHisTyrValSerSerValAla130135140TTTGCAAGGCAAACCGCCCCCAATTGGCAAGACCACAGTACT813PheAlaArgGlnThrAlaProAsnTrpGlnAspHisSerThr145150155GCAAAGCAATGTCAAGAGTTTGAAGAGTGCATAGGTGGGCCT855AlaLysGlnCysGlnGluPheGluGluCysIleGlyGlyPro160165170GAAAAAATGGCTCAATTAACAGGGTCCAGAGCCCATTTTAGA897GluLysMetAlaGlnLeuThrGlySerArgAlaHisPheArg175180TTTACTGGTCCTCAAATTCTGAAAATTGCACAATTAGAACCA939PheThrGlyProGlnIleLeuLysIleAlaGlnLeuGluPro185190200GAAGCTTACGAAAAAACAAAGACCATTTCTTTAGTGTCTAAT981GluAlaTyrGluLysThrLysThrIleSerLeuValSerAsn205210215TTTTTGACTTCTATCTTAGTGGGCCATCTTGTTGAATTAGAG1023PheLeuThrSerIleLeuValGlyHisLeuValGluLeuGlu220225230GAGGCAGATGCCTGTGGTATGAACCTTTATGATATACGTGAA1065GluAlaAspAlaCysGlyMetAsnLeuTyrAspIleArgGlu235240245AGAAAATTCATGTATGAGCTACTACATCTAATTGATAGTTCT1107ArgLysPheMetTyrGluLeuLeuHisLeuIleAspSerSer250255TCTAAGGATAAAACTATCAGACAAAAATTAATGAGAGCACCC1149SerLysAspLysThrIleArgGlnLysLeuMetArgAlaPro260265270ATGAAAAATTTGATAGCGGGTACCATCTGTAAATATTTTATT1191MetLysAsnLeuIleAlaGlyThrIleCysLysTyrPheIle275280285GAGAAGTACGGTTTCAATACAAACTGCAAGGTCTCTCCCATG1233GluLysTyrGlyPheAsnThrAsnCysLysValSerProMet290300305ACTGGGGATATTTTAGCCACTATATGTTCTTTACCCCTGCGG1275ThrGlyAspAsnLeuAlaThrIleCysSerLeuProLeuArg310320325AAGAATGACGTTCTCGTTTCCCTAGGAACAAGTACTACAGTT1317LysAsnAspValLeuValSerLeuGlyThrSerThrThrVal330335CTTCTGGTCACCGATAAGTATCACCCCTCTCCGAACTATCAT1359LeuLeuValThrAspLysTyrHisProSerProAsnTyrHis340345350CTTTTCATTCATCCAACTCTGCCAAACCATTATATGGGTATG1401LeuPheIleHisProThrLeuProAsnHisTyrMetGlyMet355360365ATTTGTTATTGTAATGGTTCTTTGGCAAGGGAGAGGATAAGA1443IleCysTyrCysAsnGlySerLeuAlaArgGluArgIleArg370375380GACGAGTTAAACAAAGAACGGGAAAATAATTATGAGAAGACT1485AspGluLeuAsnLysGluArgGluAsnAsnTyrGluLysThr385390400AACGATTGGACTCTTTTTAATCAAGCTGTGCTAGATGACTCA1527AsnAspTrpThrLeuPheAsnGlnAlaValLeuAspAspSer405410GAAAGTAGTGAAAATGAATTAGGTGTATATTTTCCTCTGGGG1569GluSerSerGluAsnGluLeuGlyValTyrPheProLeuGly415420425GAGATCGTTCCTAGCGTAAAAGCCATAAACAAAAGGGTTATC1611GluIleValProSerValLysAlaIleAsnLysArgValIle430435440TTCAATCCAAAAACGGGTATGATTGAAAGAGAGGTGGCCAAG1653PheAsnProLysThrGlyMetIleGluArgGluValAlaLys445450455TTCAAAGACAAGAGGCACGATGCCAAAAATATTGTAGAATCA1695PheLysAspLysArgHisAspAlaLysAsnIleValGluSer460465470CAGGCTTTAAGTTGCAGGGTAAGAATATCTCCCCTGCTTTCG1737GlnAlaLeuSerCysArgValArgIleSerProLeuLeuSer475480GATTCAAACGCAAGCTCACAACAGAGACTGAACGAAGATACA1779AspSerAsnAlaSerSerGlnGlnArgLeuAsnGluAspThr485490495ATCGTGAAGTTTGATTACGATGAATCTCCGCTGCGGGACTAC1821IleValLysPheAspTyrAspGluSerProLeuArgAspTyr500505510CTAAATAAAAGGCCAGAAAGGACTTTTTTTGTAGGTGGGGCT1863LeuAsnLysArgProGluArgThrPhePheValGlyGlyAla515520525TCTAAAAACGATGCTATTGTGAAGAAGTTTGCTCAAGTCATT1905SerLysAsnAspAlaIleValLysLysPheAlaGlnValIle530535540GGTGCTACAAAGGGTAATTTTAGGCTAGAAACACCAAACTCA1947GlyAlaThrLysGlyAsnPheArgLeuGluThrProAsnSer545550TGTGCCCTTGGTGGTTGTTATAAGGCCATGTGGTCATTGTTA1989CysAlaLeuGlyGlyCysTyrLysAlaMetTrpSerLeuLeu555560565TATGACTCTAATAAAATTGCAGTTCCTTTTGATAAATTTCTG2031TyrAspSerAsnLysIleAlaValProPheAspLysPheLeu570575580AATGACAATTTTCCATGGCATGTAATGGAAAGCATATCCGAT2073AsnAspAsnPheProTrpHisValMetGluSerIleSerAsp585590595GTGGATAATGAAAATTGGATCGCTATAATTCCAAGATTGTCC2115ValAspAsnGluAsnTrpIleAlaIleIleProArgLeuSer600605610CCTTAAGCGAACTGGAAAAGACTCTCATCTAAAATATGTTTGAATAATTTATC2168ProATGCCCTGACAAGTACACACAAACACAGACACATAATATACATACATATA2218TATATATCACCGTTATTATGCGTGCACATGACAATGCCCTTGTATGTTTC2268GTATACTGTAGCAAGTAGTCATCATTTTGTTCCCCGTTCGGAAAATGACA2318AAAAGTAAAATCAATAAATGAAGAGTAAAAAACAATTTATGAAAGGGTGA2368GCGACCAGCAACGAGAGAGACAAATCAAATTAGCGCTTTCCAGTGAGAAT2418ATAAGAGAGCATTGAAAGAGCTAGGTTATTGTTAAATCATCTCGAGCTC246權(quán)利要求1.一種重組酵母，它含有引入的能編碼木糖還原酶、木糖醇掊氫酶及木酮糖激酶的基因，和該酵母能有效地將木糖發(fā)酵為乙醇。2.權(quán)利要求1的重組酵母，其中該酵母也能有效地將葡萄糖發(fā)酵為乙醇。3.權(quán)利要求2的重組酵母，其中該酵母是酵母屬(Saccharomyces)的。4.權(quán)利要求3的重組酵母，其中所述各基因與不被葡萄糖抑制的啟動(dòng)子融合，和該酵母能同時(shí)有效地將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇。5.重組DNA分子，它含有編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因。6.權(quán)利要求5的重組DNA分子，其中所述各基因與不被葡萄糖抑制的啟動(dòng)子融合。7.一種載體，它能有效轉(zhuǎn)化酵母并含有能編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因。8.權(quán)利要求8的載體，其中所述各基因與不被葡萄糖抑制的啟動(dòng)子融合。9.得到能有效地將木糖發(fā)酵為乙醇的重組酵母的方法，包括將DNA引入到酵母中，使得該酵母具有引入的編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶及木酮糖激酶的基因。10.權(quán)利要求9的方法，其中該引入的DNA包含編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶及木酮糖激酶的基因。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述的酵母是酵母屬(Saccharomyces)的。12.一種將木糖發(fā)酵為乙醇的方法，包括用一含引入的能編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因的重組酵母發(fā)酵含木糖的培養(yǎng)基，并有效地將木糖發(fā)酵為乙醇。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述培養(yǎng)基也含有葡萄糖，酵母也能有效地將該葡萄糖發(fā)酵為乙醇。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述酵母是酵母屬(Saccharomyces)的。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述基因與不被葡萄糖抑制的啟動(dòng)子融合，該酵母能同時(shí)有效地將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇。16.一種將葡萄糖發(fā)酵為乙醇的方法，包括用一含引入的編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶及木酮糖激酶基因的重組酵母發(fā)酵一含有葡萄糖的培養(yǎng)基，并有效地將木糖和葡萄糖發(fā)酵為乙醇。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述培養(yǎng)基也含有木糖。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述酵母是酵母屬(Saccharomyces)的。19.一種重組酵母，它含有編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶及木酮糖激酶的基因，其中，所述各基因與不被葡萄糖抑制的啟動(dòng)子融合，所述酵母能有效地將木糖發(fā)酵為乙醇。20.權(quán)利要求19的重組酵母，其中該酵母也能有效地將葡萄糖發(fā)酵為乙醇。全文摘要本發(fā)明描述的是含有編碼木糖還原酶，木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因的重組酵母，DNA分子，載體及生產(chǎn)此類酵母的方法。此類重組酵母能有效地將木糖發(fā)酵為乙醇，優(yōu)選的酵母能同時(shí)將葡萄糖和木糖發(fā)酵為二醇，使得存在于農(nóng)作物中的這兩種糖源能得以充分利用。文檔編號(hào)C12N15/00GK1141057SQ94194767公開日1997年1月22日申請(qǐng)日期1994年11月8日優(yōu)先權(quán)日1993年11月8日發(fā)明者N·W·Y·何,G·T·曹申請(qǐng)人:普渡研究基金會(huì)