專利名稱：新細(xì)胞程序死亡調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的dna以及使用該蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有細(xì)胞程序死亡調(diào)節(jié)活性的新蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的重組DNA、含有該蛋白質(zhì)的組合物以及使用該蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞程序死亡是引起個體細(xì)胞死亡的正常生理過程。這一編程性細(xì)胞死亡過程涉及各種正?，F(xiàn)象和致病生物學(xué)現(xiàn)象，并且可以被大量非相關(guān)的刺激誘導(dǎo)。在衰老過程中也出現(xiàn)細(xì)胞程序死亡生物學(xué)調(diào)節(jié)的變化，這些變化引起許多與衰老有關(guān)的病態(tài)和疾病的發(fā)生。有關(guān)細(xì)胞程序死亡的最近的研究已表明，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的普通代謝途徑可以被許多信號(包括激素、血清生長因子喪失、化療劑、電離輻射和人免疫缺陷病毒(HIV)感染)引發(fā)(Wyllie(1980)，Nature 284555-556；Kanter et al.(1984)Biochem.Biophvs.Res.Commun.118392-399；Duke and Cohen(1986)Lymphokine Res.5289-299；Tomei et al._(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.155324-331；Kruman et al.(1991)J.Cell.Physiol.148267-273；Ameisen and Capron(1991)Immunology Today 12102；and Sheppard and Ascher(1992)J.AIDS 5143)。因此，在很多情況下調(diào)節(jié)細(xì)胞程序死亡生物學(xué)控制的藥劑具有治療實用性。
細(xì)胞程序死亡性細(xì)胞死亡以細(xì)胞萎縮、染色質(zhì)凝聚、胞質(zhì)水泡狀生長、膜通透性增加和核小體內(nèi)DNA斷裂為特征(kerr et al.(1992)FASEB J.62450；和Cohen and Duke(1992)Ann.Rev.Immunol.10267)。形成的泡(從細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞表面脫落的小的膜包裹的球狀物)可以繼續(xù)產(chǎn)生超氧化物自由基(損害周圍細(xì)胞組織)，并可以引起痰癥。
bcl-2在導(dǎo)致其異常過度表達(dá)的濾泡淋巴瘤中的染色體轉(zhuǎn)運位點t(1418)上被發(fā)現(xiàn)(Tsujimoto et al，(1984)Science 2261097-1099；和Cleary et al.(1986)Cell 4719-28)。bel-2的正常功能是阻止細(xì)胞程序死亡。人們認(rèn)為bcl-2在B細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致增殖性B細(xì)胞數(shù)量的增加(可能是淋巴瘤形成的關(guān)鍵因素)(McDonnelland Korsmeyer(1991)Nature 349254-256；綜述可見于Edgington(1993)Bio/Tech.11787-792)。bcl-2也能阻斷γ輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Sentman et al.(1991)Cell 67 879-888和(Strasser(1991)Cell 67889-899)?，F(xiàn)在已知bcl-2抑制大多數(shù)類型的細(xì)胞程序死亡性細(xì)胞死亡，并且bcl-2被認(rèn)為是通過調(diào)節(jié)抗氧化途徑(在自由基產(chǎn)生位點)和Ca2+流動(經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng))起作用(Lan et al，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.916569-6573；Hockenbery et al.(1993)Cell 75241-251)盡管細(xì)胞程序死亡是一種正常的細(xì)胞現(xiàn)象，但它也能被病理狀態(tài)和多種損傷誘導(dǎo)。細(xì)胞程序死亡在許多種疾病中涉及到，這些疾病包括但不限于心血管病、癌消退、免疫調(diào)節(jié)、病毒病、貧血、神經(jīng)性紊亂、胃腸病(包括但不限于腹瀉和痢疾)、糖尿病、脫發(fā)、器官移植排斥、前列腺肥大、肥胖、眼障礙、緊張和衰老。
bcl-2是其中某些已被克隆和測序的一族蛋白質(zhì)(Williams andSmith(1993)Cell 74777-779)。本文前后引用的參考文獻(xiàn)在此一并在本文中參考。
發(fā)明概述提供了編碼新Bcl-2同系物(稱為Cdn-1、Cdn-2和Cnd-3和其衍生物)的基本上純化的DNA、以及表達(dá)Cdn-1和Cdn-2核苷酸序列的重組細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動物。也提供了基本上純化的Cdn-1和Cdn-2蛋白質(zhì)以及它們的組合物。也提供了利用所述的核苷酸序列和蛋白質(zhì)的診斷和治療方法。也提供了篩選刺激或調(diào)節(jié)Cdn-1和Cdn-2表達(dá)和蛋白質(zhì)活性和相互作用的藥劑的方法。還提供了篩選與Cdns相互作用的蛋白質(zhì)的方法。
附圖簡要說明

圖1描述了用于分離Cnd-1探針的Bcl-2族PCR引物。
圖2描述了由實施例1的方法獲得的Cdn-1克隆。
圖3描述了Cdn-1 cDNA的核苷酸序列和編碼的Cdn-1蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
圖4描述了用對Bcl-2和Cdn-1兩者特異性的探針進(jìn)行的多種組織的Northern印跡分析的結(jié)果。
圖5表示了Cdn-2基因序列和側(cè)翼序列以及相應(yīng)的推定的Cdn-2蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
圖6表示了Cdn-1、Cdn-2和已知的Bcl-2族成員的N-末端氨基酸序列的比較。
圖7表示了Cdn-3基因的核苷酸序列和推定的Cdn-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
圖8表示了在0.1％FBS中Cdn-1和其某些衍生物在WI-L2轉(zhuǎn)化體的血清喪失誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡中的抗細(xì)胞程序死亡作用。
圖9(WI-L2轉(zhuǎn)化體對抗-Fas-Induced Apoptosis(50ng/ml抗-FAS)的反應(yīng))表示了Cdn-1和其某些衍生物在WI-L2細(xì)胞的FAS-誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡中的抗細(xì)胞程序死亡作用。
圖10表示在FL5.12細(xì)胞中由Cdn-1和Cdn-2產(chǎn)生的細(xì)胞程序死亡調(diào)節(jié)作用。
圖11描述了Cdn-1衍生物蛋白質(zhì)Δ1、Δ2和Δ3。用箭頭表示出了N-末端殘基。衍生物蛋白質(zhì)的剩余部分與全長Cdn-1相同。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括基本上純化的編碼新Bcl-2類似物(Cdn-1和Cdn2)的核苷酸序列、該序列編碼的蛋白質(zhì)、包含Cdn-1和Cdn-2核苷酸序列或蛋白質(zhì)的組合物以及它們的使用方法。要注意，在共同未決美國專利申請08/160,067號中，Cdn-1被稱為cdi-1；在共同未決美國專利申請08/320,157中，Cdn被表示為cdn，Cdn被表示為CDN；盡管名稱已改變，但核苷酸和氨基酸序列保持相同。本發(fā)明還包括攜帶克隆Cdn-1或Cdn-2基因的重組細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動物。圖3表示出了Cdn-1的核苷酸序列和推斷的由其編碼的氨基酸殘基序列；圖5中表示出了Cdn-2的這些序列?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由Cdn基因編碼的蛋白質(zhì)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞程序死亡。在EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化體類淋巴母細(xì)胞系中，Cdn-1表現(xiàn)出使Fas-介導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡降低。在小鼠祖代B細(xì)胞系FL5.12中，Cdn-2和Cdn-1的衍生物的表達(dá)降紙IL-3誘導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡，而Cdn-1的表達(dá)稍微增加細(xì)胞程序死亡。因此，依據(jù)細(xì)胞類型、被表達(dá)的Cdn的衍生物或類型、以及誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的方式，可以通過控制Cdns的表達(dá)和Cdns的濃度以高度特異生的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞程序死亡。
這里使用的“Cdns”或“Cdn”指本文所述的核酸分子(核苷酸序列)(Cdn-1、Cdn-2、Cdn-3和其衍生物)，“Cdns”或“Cdn”指由上述分子編碼的蛋白質(zhì)(Cdn-1、Cdn-2、Cdn-3和其衍生物)。本發(fā)明包含Cdn-1和Cdn-2核苷酸序列。所述的核苷酸序列包括但不限于Cdn-1cDNA、基因組衍生的DNA和合成或半合成的核苷酸序列(例如編碼的和與編碼區(qū)互補(bǔ)的DNA和RNA)。所述核苷酸序列可以與編碼至少一種cdns片段的mRNA和能夠結(jié)合到編碼所述Cdns的DNA或mRNA上的其它核苷酸序列互補(bǔ)。這些互補(bǔ)核苷酸序列包括但不限于能夠形成三股螺旋和反義核苷酸序列的核苷酸序列。所述互補(bǔ)核苷酸序列可以被本文描述的一種載體內(nèi)源性地表達(dá)，或者也可以用本領(lǐng)域公知的寡核苷酸治療法(Reed et al.(1990)Cancer Res.506565-6570)外源性地添加。圖3表示了標(biāo)示出限制性內(nèi)切核酸酶位點位置的Cdn-1 cDNA的核苷酸序列。如本文實施例1所述，已通過Northern印跡分析在各種人器官和組織中檢測Cdn-1mRNA。這些器官包括肝、心、骨胳肌、肺、腎和胰，如圖4所示。
類似地，Cdn-2cDNA、基因組DNA和合成或半合成核苷酸序列是本發(fā)明另外的實施方案。圖5中給出了Cdn-2基因的核苷酸序列，同時也給出了推斷的Cdn-2蛋白質(zhì)的氨基酸序列和限制性內(nèi)切核酸酶識別位點的位置。
本文給出的實施例說明，Cdn-1在人染色體6上，Cdn-2在人染色體20上。也存在在人染色體11上的Cdn-3族成員。熒光原位雜交(FISH)表明Cdn-1的大概位置在6p21-23?？赡蹸dn-2和Cdn-3是假基因。盡管它們可能不被內(nèi)源性表達(dá)，但在合適的啟動子序列作用下，它們能被重組載體表達(dá)。因此，本發(fā)明包含了Cdn-2和Cdn-3兩者的核苷酸序列，以及它們的重組構(gòu)建體和由它們編碼的蛋白質(zhì)。
基因和蛋白質(zhì)的衍生物包括保持細(xì)胞程序死亡調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)或編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列的任何部分。圖11描述了已表現(xiàn)出保持細(xì)胞程序死亡調(diào)節(jié)活性的Cdn-1的三種這樣的衍生物。本發(fā)明包括了衍生物Cdn1-Δ1、Cdn1-Δ2和Cdn1-Δ3和由它們編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明包括對Cdn DNA序列的修飾(例如缺失、取代和添加)，特別是在基因組DNA的非編碼區(qū)進(jìn)行的這些修飾。這些改變對促進(jìn)克隆和改善基因表達(dá)是有用的。
本發(fā)明還包括各種取代的核苷酸序列?？稍诰幋a區(qū)內(nèi)進(jìn)行取代，該取代不改變編碼的氨基酸殘基，或者形成保守取代的氨基酸殘基。不改變編碼氨基酸殘基的核苷酸取代對在不同系統(tǒng)中使基因表達(dá)最佳化是有用的。合適的取代對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，例如，為了在特定的表達(dá)系統(tǒng)中反映較好的密碼的使用而進(jìn)行合適的取代。
本發(fā)明還包括可以增強(qiáng)、降低或不明顯影響Cdns性質(zhì)的Cdns功能性等價變體的衍生物。例如，不改變編碼的氨基酸序列的DNA序列中的變化和形成氨基酸殘基保守取代的這種變化、一個或幾個氨基酸缺失或添加、和用氨基酸類似物進(jìn)行的氨基酸殘基的取代產(chǎn)生不明顯影響其性質(zhì)的變體和衍生物。
可被相互保守取代的氨基酸殘基包括但不限于甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸，天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蛋氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。本發(fā)明包含任何不明顯影響Cdns性質(zhì)的保守氨基酸取代。
本發(fā)明還包括Cdns突變體，當(dāng)被表達(dá)時，該突變體影響內(nèi)源性表達(dá)的Cdns的活性。這種突變體可用本領(lǐng)域公知的任何方法制備，并且通過其影響天然Cdns活性的能力進(jìn)行活性篩選。
對本發(fā)明的實施有用的核酸操作技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，在許多參考文獻(xiàn)中都有描述，這些文獻(xiàn)包括但不限于Molecular CloningAlaboratory Manual，2nd ed.，Vol1-3，eds.Sambrooketal.Cold SpringHarbor laboratory press(1989)；和Current Protocols in Molecular Biol-ogy，eds.Ausubel et al.，Green Publishing and Wiley-InterscienceNew York(1987)和定期修訂本。
本發(fā)明還包括其中已克隆Cdn核苷酸序列的各種DNA載體。合適的載體在本領(lǐng)域是公知的，它們包括但不限于那些用于細(xì)菌、哺乳動物、醋母和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的載體。特異性載體是本領(lǐng)域公知的，不需要在此詳細(xì)描述。
載體也可以提供表達(dá)Cdn核苷酸序列的誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子是那些基本上不允許基因的組成型表達(dá)或者說僅在某些條件下允許表達(dá)的啟動子。這些啟動子可以被許多刺激誘導(dǎo)，所述刺激包括但不限于含有載體的細(xì)胞與配體，金屬離子、其它化學(xué)品接觸和改變溫度。所述啟動子也可以是細(xì)胞特異性的，即僅在特定的細(xì)胞類型且通常僅在特定的時間期限是可誘導(dǎo)的。所述啟動子還可以是細(xì)胞周期特異性的，即僅在細(xì)胞周期的特定階段被誘導(dǎo)或是可誘導(dǎo)的。所述啟動子還可以既是細(xì)胞類型特異性的又是細(xì)胞周期特異性的。任何本領(lǐng)域公知的誘導(dǎo)型或非誘導(dǎo)型啟動子均適用于本發(fā)明。所使用的啟動子最好是誘導(dǎo)型啟動子。
本發(fā)明還包括各種用載體轉(zhuǎn)染的表達(dá)系統(tǒng)。合適的表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于細(xì)菌、哺乳動物、酵母和昆蟲。特定的表達(dá)系統(tǒng)和其使用是本領(lǐng)域公知的，在此不作詳細(xì)描述。
本發(fā)明包括用Cdn核苷酸序列進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)染。其中用含有Cdn核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)染從包括人在內(nèi)的動物移取的細(xì)胞，并再引入到動物中。
合適的轉(zhuǎn)染細(xì)胞包括單個細(xì)胞或包含在整個組織內(nèi)的細(xì)胞。此外，體外轉(zhuǎn)染可以包括得自動物的細(xì)胞(而而細(xì)胞最后要引入其中的動物或人受試者)的轉(zhuǎn)染。這種移植包括但不限于同種異體移植、異種移植和胎組織移植。此外，可以使用體內(nèi)轉(zhuǎn)染，例如，經(jīng)各適載體的肺部施用。
基本上可以用這一方式處理任何細(xì)胞或組織類型。合適的細(xì)胞包括但不限于心肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。例如，用重組DNA轉(zhuǎn)染移取的淋巴細(xì)胞，并重新引入到HIV-陽性病人中，可以增加重新引入的T細(xì)胞的半壽期。
作為一個例子，在用上述方法處理HIV-感染的病人中，從病人移除白血細(xì)胞，選來產(chǎn)生CD4+細(xì)胞。然后，用含有Cdn核式酸的載體轉(zhuǎn)染CD4+細(xì)胞，并重新引入到病人中。另一種方法是，可以在細(xì)胞特異性啟動子的控制下，用具有至少一種Cdn核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)染未選擇的淋巴細(xì)胞，以便僅CD4+細(xì)胞表達(dá)所述的核苷酸。
此外，本發(fā)明包括用載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。體內(nèi)轉(zhuǎn)染的合適方法是本領(lǐng)域公知的，這些方法包括但不限于Zhu et al(1993)Science261209-211所述的方法。體內(nèi)轉(zhuǎn)染作為對患動脈粥樣硬化病人的一個預(yù)防性治療方法可能是特別有用的。Cdn水平的調(diào)節(jié)可以用來預(yù)防引起大腦和心肌梗塞形成的細(xì)胞程序死亡相關(guān)的再輸注(reperfusion)損壞。在這些具有中風(fēng)和心臟病發(fā)作的很大的危險性的病人中，與動脈阻塞相關(guān)的細(xì)胞程序死亡和再輸注損壞可被阻止或至少被減輕。
由于產(chǎn)生肉眼可見的壞死區(qū)的栓子、血栓或壓力，梗塞由動脈或靜脈供血的突然不足引起。心、腦、脾、腎、腸、肺和睪丸很可能受影響。細(xì)胞程序死亡發(fā)生在因所述區(qū)的血再輸注發(fā)生的梗塞周圍的組織上。因此，調(diào)節(jié)Cdn水平會有效降低由心臟病發(fā)作和中風(fēng)引起的損害嚴(yán)重程度，調(diào)節(jié)Cdn水平是經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)染或反義治療，以內(nèi)說產(chǎn)生方式由生物修飾劑誘導(dǎo)的變化實現(xiàn)的。
本發(fā)明也包括含有重組DNA載體的轉(zhuǎn)基因動物，所述載體包含核苷酸序列。制備轉(zhuǎn)基因動物的方法是本領(lǐng)域公知的，不需在此詳細(xì)描述。為了回顧用于制備轉(zhuǎn)基因動物的方法，可參見例如PCT出版物WO93/04169。這種動物最好在細(xì)胞特異性(尤其是細(xì)胞周期特異性)啟動子控制下表達(dá)重組Cdns。
在另一實施方案中，診斷方法被提供來檢測蛋白質(zhì)水平上或mRNA水平上的Cdns表達(dá)。任何特異性識別Cdns的抗體均適用于Cdn診斷中。有患有與不適當(dāng)?shù)募?xì)胞程序死亡相關(guān)的疾病的病人的組織中很可能發(fā)現(xiàn)異常水平的Cdns。因此，診斷方法對檢測和監(jiān)測與這種細(xì)胞程序死亡缺陷相關(guān)的生物學(xué)狀態(tài)是有用的。檢測方法在監(jiān)測Cdn-相關(guān)治療是否成功上也是有用的。
由重組DNA表達(dá)的或從生物說(例如組織)獲得的Cdns的純化或分離可用本領(lǐng)域公知的任何方法完成。蛋白質(zhì)純化方法是本領(lǐng)域公知的。一般來說，基本上純化的蛋白質(zhì)是無其它沾污細(xì)胞的物質(zhì)(特別是蛋白質(zhì))的那些蛋白質(zhì)。純化的Cdns的純度優(yōu)選地為大于80％，最優(yōu)選地為大于95％。為了以下所述的臨床用途時，Cdns最好是高度純化的，純度至少約99％，且不含有熱原質(zhì)和其它污染物。
合適的蛋白質(zhì)純化方法是本領(lǐng)域公知的，這些方法包括但不限于親合層析、免疫親和層折，大小排阻層折、HPLC和FPLC。不引起蛋白質(zhì)實質(zhì)上降解的任何純化方案均適用于本發(fā)明。
本發(fā)明也包括分別具有圖3和5描述的氨基酸殘基序列的基本上純化的Cdns。本發(fā)明包含Cdns的功能性等價變體(不明顯影響Cdns的性質(zhì))和保持相同的總體氨基酸序列但具有增強(qiáng)的或降低的活性的變體。例如，氨基酸殘基的保守取代、一個或幾個氨基酸缺失或添加，由氨基酸類似物取代氨基酸殘基均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明包括不明顯影響Cdns性質(zhì)的任何保守氨基酸取代。
用Cdns或最好用包含Cdn區(qū)的肽為抗元產(chǎn)生合適的抗體，所述區(qū)缺乏與其它Bcl-2族基因產(chǎn)物的基本的同源性。用抗體檢測蛋白質(zhì)和用蛋白質(zhì)或合成多肽產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域公知的，在此不作詳述。
也可以通過測定Cdn mRNA的水平來監(jiān)測Cdn蛋白質(zhì)的表達(dá)。檢測特定mRNA種類的任何方法均適用于這一方法。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)容易完成這一方法。選擇來進(jìn)行PCR的引物最好相應(yīng)于Cdn基因區(qū)，所述基因區(qū)缺乏與Bcl基因族其它成員的基本的同源性。另外，經(jīng)采用對Cdns特異性的探針，Northern印跡也可用于檢測Cdn mRNA。采用PCR和Northern印跡的方法是本領(lǐng)域公知的，在此不作詳述。
處理Cdns的方法也包括通過提高或降低mRNA或蛋白質(zhì)的水平調(diào)節(jié)Cdns的細(xì)胞表達(dá)。調(diào)節(jié)Cdn細(xì)胞表達(dá)的合適方法包括但不限于用生物修飾劑增加內(nèi)源表達(dá)；用含有Cdn核苷酸的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞以便Cdn基因被過度表達(dá)或者反義核苷酸被表達(dá)；表達(dá)干擾內(nèi)源Cdn與其它蛋白質(zhì)(例如Bcl-2族的其它成員)相互作用的突變型Cdns。細(xì)胞轉(zhuǎn)染已在以上討論過，并且是本領(lǐng)域公知的，調(diào)節(jié)Cdn內(nèi)源水平的合適標(biāo)志包括但不限于惡性腫瘤和心臟特異性表達(dá)。心臟特異性表達(dá)特別適用于指示包括但不限于易患心臟病并事先經(jīng)心臟中毒性治療(包括但不限于化療，例如阿霉素化療)以獲得心臟保護(hù)的病人。
可以通過將細(xì)胞露置于生物修飾劑下來完成調(diào)節(jié)Cdns的內(nèi)源表達(dá)。所述修飾劑通過調(diào)節(jié)Cdns表達(dá)或通過調(diào)節(jié)Cdn mRNA降解直接或間接改變Cdns水平。合適的生物修飾劑包括但不限于分子和其它細(xì)胞。合適的分子包括但不限于藥物、細(xì)胞因子、小分子、激素、白介素的組合體、凝集素和其它刺激劑(例如PMA、LPS)、雙特異性抗體和修飾細(xì)胞功能或蛋白質(zhì)表達(dá)的其它試劑。優(yōu)選地，合適的生物修飾劑是在HT-29細(xì)胞中增加Cdn表達(dá)水平的γIFN。而且，生物修飾劑包括Cdn核苷酸(它修飾內(nèi)源Cdn的表達(dá))和突變型Cdns(它干擾內(nèi)源Cdns的活性)。將細(xì)胞露置于生理學(xué)有效濃度的生物修飾劑中，相對于不露置于生物修飾劑中的對照測定cdns的表達(dá)。相對于對照來說改變Cdns表達(dá)的那些生物修飾劑選來進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
降低Cdns內(nèi)源水平的方法包括但不限于反義核苷酸治療、將有義核苷酸傳送到反義構(gòu)建體上和用生物修飾劑使表達(dá)下調(diào)。反義治療是本領(lǐng)域公知的，其應(yīng)用對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
通過將細(xì)胞露置于生物修飾劑下來篩選治療有效的生物修飾劑。所述修飾劑可通過改變Cdn mRNA或Cdns的表達(dá)或改變它們的半壽期直接或間接地調(diào)節(jié)Cdns的水平。該生物修飾劑也可以干擾Cdn-1與其它Bcl-2族成員和其它基因產(chǎn)物(例如蛋白酶)兩者的相互作用。合適的生物修飾劑包括但不限于分子和其它細(xì)胞。合適的分子包括但不限于藥物、細(xì)胞因子、小分子、激素、白介素的組合、凝集素和其它刺激劑(例如PMA、LPS)、雙特異性抗體、Cdn核苷酸、Cdn突變體和修飾細(xì)胞功能或蛋白質(zhì)表達(dá)的其它試劑。將細(xì)胞在已知使至少一種Cdn(最好是Cdn-1)表達(dá)的條件下培養(yǎng)，露置于生理學(xué)有效濃度的這類生物修飾劑F，相對于未露置于生物修飾劑下的對照測定Cdns的表達(dá)。相對于對照來說改變Cdns表達(dá)的那些生物修飾劑選來進(jìn)行進(jìn)一步的研究。也監(jiān)測細(xì)胞的生存力，以確保改變的cdn表達(dá)不是由于細(xì)胞死亡引起的。
在測定生物修飾利調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或降低)Cdn表達(dá)的能力中，可以檢測內(nèi)源表達(dá)水平或者可以檢測在Cdn-特異性啟動子序列控制下的重組融合蛋白的水平。所述融合蛋白由報道基因編碼。
報道基因在本領(lǐng)域是公知的，它包括但不限于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)和β-半乳糖苷酶。Cdn-1和Cdn-2的表達(dá)可以按以上所述通過蛋白質(zhì)或mRNA水平來監(jiān)測。報道基因的表達(dá)可以通過酶促試驗或基于抗體的試驗(類似ELISAs和RIAs)來監(jiān)測，這些也是本領(lǐng)域公知的。潛在的藥劑可以是本領(lǐng)域已知的任何治療劑或化學(xué)品，或者是來自天然源(例如真菌培養(yǎng)液和植物提取物)的任何未確定特征的化合物。合適的藥劑最好是那些缺乏基本細(xì)胞毒性和致癌力的藥劑。
調(diào)節(jié)Cdns內(nèi)源水平的合適病癥是其中涉及Cdn-介導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡的任何病癥。這些病癥包括但不限于各種惡性腫瘤和導(dǎo)致細(xì)胞生長失控的其它紊亂(例如濕疹)或正常編程性細(xì)胞死亡缺陷(例如惡性腫瘤，它包括并不限于B細(xì)胞淋巴瘤)。
本發(fā)明也包括用生物修飾劑調(diào)節(jié)Cdns表達(dá)的有關(guān)病人治療的治療方法和組合物。有效濃度和用藥方案可以經(jīng)驗性地推斷出，這種推斷在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)，它取決于，例如，病人的年齡、體重和性別以及疾病的類型和嚴(yán)重程度。另一種方法是，病人可以直接用天然或重組Cdns處理。所述Cdns應(yīng)是基本上純的且不含熱原。為了保證正確的糖基化，用哺乳動物細(xì)胞系產(chǎn)生重組Cdns比較好。也可以用昆蟲細(xì)胞系產(chǎn)生Cdns。
就治療組合物而言，將治療有效量的基本上純的Cdn或調(diào)節(jié)其表達(dá)或活性的生物修飾劑或寡核苷酸懸浮到生理學(xué)可接受的緩沖溶液(包括但不限于鹽水和磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS))中，并給病人用藥。較好的用藥方式是靜脈內(nèi)給藥。其它的用藥方法包括但不限于皮下、腹膜內(nèi)，胃腸給藥和直接對特定器官(例如為治療與心肌梗塞相關(guān)的細(xì)胞死亡，對心臟內(nèi))給藥。
合適的緩沖溶液和用藥方法是本領(lǐng)域公知的。Cdn和其生物修飾劑的有效濃度需要經(jīng)驗性地確定，它取決于疾病的類型和嚴(yán)重程度，病程和病人的健康狀態(tài)。這種確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
人們認(rèn)為Bcl-2在抗氧化途徑中起作用(Veis et al.(1993)Cell75229-240)。因此，涉及Cdns的治療法適用于其中涉及超氧化物的病態(tài)。Cdn表達(dá)調(diào)節(jié)劑的使用導(dǎo)致增加的Cdns細(xì)胞間濃度，這被認(rèn)為提供了直接抑制可以由與細(xì)胞程序死亡相關(guān)的泡產(chǎn)生的超氧化物積累。因此，所述治療方法包括但不限于抑制超氧化物介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。
Cdns或其生物修飾劑治療用途的合適病癥是涉及游離自由基介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的那些，它包括但不限于以前被認(rèn)為可用超氧化物歧化酶治療的病態(tài)。這類病癥包括但不限于HIV感染、自體免疫病、心肌病、神經(jīng)元疾病、肝炎和其它肝臟疾病、骨質(zhì)疏松癥和休克綜合癥(包括但不限于敗血癥)。
克隆Cdn DNA與得自腦各區(qū)的信使mRNA雜交表明Cdn-1在所研究的各區(qū)的高水平表達(dá)。因此，神經(jīng)疾病是Cdns表現(xiàn)出治療用途的另一領(lǐng)域。
本發(fā)明還包括試驗Cdns與特異性結(jié)合到Cdns上的蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。該試驗是使純化的Cdns與含蛋白質(zhì)的細(xì)胞溶解物接觸，并試驗所述蛋白質(zhì)的存在，其中的細(xì)胞溶解物在足以使蛋白質(zhì)結(jié)合的條件下可以結(jié)合到Cnds上。
典型的試驗步驟涉及將蛋白質(zhì)與特異生結(jié)合的配偶體(例如可被直接或間接標(biāo)記的抗體)接觸。合適的試驗包括ELISA(它采用直接針對蛋白質(zhì)的抗體、體外翻譯的Cdn和含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞溶解物)。酵母遺傳系統(tǒng)(例如Matchmaker(Clontech))也適用于所述試驗中。
提供下列實施例用于說明但不用于限制本發(fā)明。除非有別的說明，所有克隆技術(shù)均基本上按Sambrook等(1989)描述的技術(shù)，所有試劑均按制造者的說明使用。
實施例1Cdn-1cDNA的識別和克隆6個已知的Bcl-2族成員的氨基酸序列比較(圖6)揭示出具有很大的序列一致性的兩個區(qū)，稱為氨基酸144-150和191-199。在識別新Bcl-2族成員的嘗試中，設(shè)計基于這些區(qū)中的序列的簡并的PCR引物(圖1)，用人心臟cDNA和人β類淋巴母細(xì)胞系(WI-L2)cDNA進(jìn)行PCR。采用Hot Start/Ampliwax技術(shù)(Perkin ElmerCetus)進(jìn)行PCR。PCR引物和模板cDNA的最終濃度分別為4μM和0.1-0.2ng/ml。cDNA合成的條件與以下描述的用于cDNA文庫的第一條cDNA鏈合成的條件相同。除前10個循環(huán)期間的退火和延伸溫度為36℃外，按Kiefer et al.(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.176219-225描述的方法在Perkin Elmer CetusDNA Thermal Cycler中進(jìn)行PCR。PCR后，將樣品在地37℃下用5單位DNA聚合酶I克列諾片段處理30分鐘，然后輕7％聚丙烯酰胺、1×TBE(Tris/硼酸鹽/EDTA)膠上的電泳分級分離。從凝膠上切下在170-210堿基對間遷移的DNA，用在10mM Tris-Hcl(PH7.5)、1mMEDTA(TE)中輕輕振動被動洗脫16小時，經(jīng)Elutip-D柱(Schleicher and Schuell)上的通道純化，連接到pCR-Script載體(Stratagene)上并且純化。將該cDNA亞克隆進(jìn)pBlsc并測序。心臟cDNA也編碼Cdn-1。
圖3示出了W7 DNA序列以及推斷的氨基酸殘基序列。也比較了推斷的Cdn-1氨基酸序列與其它Bcl-2族成員的最大序列一致性，并在圖6中表示出?？梢钥闯觯珻dn-1和其它族成員間氨基酸100到200有很大的序列一致性。在這一中心區(qū)之外，序列保守明顯降低。與Bcl-2一樣，Cdn-1顯示出是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中不含有疏水信號肽或N-連糖基化位點。Cdn-1確實含有疏水C-末端(從除LMW5-HL外的所有Bcl-2族成員也觀察到)，表明其抗細(xì)胞程序死亡活性位點與Bcl-2的一樣，位于結(jié)合細(xì)胞器的膜(例如線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或核膜)上(Hockenbery et al.(1990)；Chen-Levy et al.(1989)Mol.Cell.Biol.9.701-710；Jacobsen etal.(1993)Nature 361365-369；和Monighan et al.(1992)J.His-tochem.Cytochem.401819-1825)。
實施例2
cDNA克隆的Northern印跡分析按照Lehrach et al.(1977)Biochem.164743-4651和Thomas(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 775201-5205中描述的方法進(jìn)行Northern印跡分析。此外，從Clontech購得人多種組織Northern印跡。用Feinberg and Vogelstein(1984)Anal.Biochem.137226-267描述的隨機(jī)引導(dǎo)法標(biāo)記Bcl-2和Cdn-1cDNA編碼區(qū)。按Kiefer等(1991)描述的方法進(jìn)行雜交和洗滌。具體地說，將Bcl-2和Cdn-1克隆的克列諾標(biāo)記的片段以每個探針1×106cpm/ml的終濃度雜交到多種人組織Northern印跡(Clontech 7760-1)上。在高度嚴(yán)格的條件下洗滌印跡。
圖4給出的結(jié)果表明，Cdn-1在所有受試器官(心、腦、胎盤、肺、肝、骨胳肌、腎和胰)中被表達(dá)，而Bcl-2而不被表達(dá)或在心、腦、肺和肝中被低水平地表達(dá)。因此Cdn-1表現(xiàn)出被通過人器官表達(dá)比Bcl-2更廣泛，在調(diào)節(jié)這些組織中的細(xì)胞程序死亡中可能更重要。
實施例3重組Cdn-1的表達(dá)為了在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)重組Cdn-1，按實施例1描述的PCR方法，采用來源于含有促進(jìn)克隆的限制位點的基因的3’和5’側(cè)翼區(qū)的引物，將實施例1中產(chǎn)生的Cdn-1cDNA用于產(chǎn)生新的Cdn-1載體。用測序試劑盒(USB，Sequenase version 2.0)和內(nèi)引物經(jīng)雙胱氧終子法(Sanger et al.，1977)對該質(zhì)檢測序。這是為了證實無PCR引起的突變。
經(jīng)所述質(zhì)抗的重疊序列與AcNPV野生型桿狀病毒間的體內(nèi)同說重組用一個克隆產(chǎn)生重組病毒。在昆蟲Spodoptera frugiperda克隆9(SF9)細(xì)胞中48小時后轉(zhuǎn)染后，收集重組病毒，用PCR識別并進(jìn)一步純化。進(jìn)行重組桿狀病毒的選擇、篩選和增殖的標(biāo)準(zhǔn)過程(Invitrogen)。將在桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺膠電泳(SDS-PAGE)上的分子質(zhì)量與按照氨基酸序列推定的Cdn-1分子質(zhì)量比較。
此外，可以通過任何本領(lǐng)域公知的方法在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)中優(yōu)先表達(dá)類似的克隆，所述方法包括Barr et al.(1992)Transgen-esis ed.JAH Murray，(Wiley and Sons)pp.55-79中描述的方法。
實施例4Cdn-1在哺乳動物系統(tǒng)中的表達(dá)從實施例1產(chǎn)生的質(zhì)粒切下Cdn-1編碼序列，并在匹配限制酶位點引入到質(zhì)粒pCEP7、pREP7和pcDNA3(Invitrogen)。通過用XbaI/Asp718除去pREP7的RSV3′-LTR和從pCEP4(Invitrogen)取代CMV啟動子產(chǎn)生pCEP 7。將25mg各種含Cdn-1的質(zhì)粒電穿孔進(jìn)B淋巴母細(xì)胞系WI-L2，選擇表達(dá)Cdn-1的穩(wěn)定的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化體或G418抗性轉(zhuǎn)化體(pcDNA3構(gòu)建體，圖8)。
也可以將Cdns編碼區(qū)連接進(jìn)能穩(wěn)定整合進(jìn)其它細(xì)胞類型(包括但不限于心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞系(例如GTI-7)和TNF敏感細(xì)胞(例如人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT297)的表達(dá)載體中，以提供監(jiān)測Cdn-1調(diào)節(jié)細(xì)胞程序死亡的試驗系統(tǒng)。
實施例5Cdn-1和其衍生物在野生型β類淋巴母細(xì)胞系WI-L2-729HF2和表達(dá)過量Cdn-1的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的抗細(xì)胞程序死亡的作用將用按實施例4所述的編碼Cdn-1的載體轉(zhuǎn)化的2×105 WI-L2和WI-L2細(xì)胞在RPMI中生長，所述RPMI補(bǔ)加有10％胎牛血清(用于抗-fas實驗)或0.1％FBS(用于血清喪失實驗)。在抗-fas實驗的情況下，在用新鮮培養(yǎng)基洗滌后，將細(xì)胞懸浮在補(bǔ)加有10％FBS的RPMI中，露置于抗-fas抗體下，用帶FACScan的流動細(xì)胞計數(shù)器分析應(yīng)答細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的細(xì)胞死亡動力學(xué)。在血清喪失實驗的情況下，將WI-L2細(xì)胞懸浮在補(bǔ)加有0.1％FBS的RPMI中，按Henderson et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908479-8483中所述的方法監(jiān)測細(xì)胞程序死亡。誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的其它方法包括但不限于初級心肌細(xì)胞中的氧喪失、神經(jīng)細(xì)胞系GII-7中的NGF退隱和谷胱甘肽排除或TNF添加到HT29細(xì)胞系。通過檢測細(xì)胞死亡期間的細(xì)胞收縮和對碘化丙錠(PI)的通透性來估測細(xì)胞程序死亡。此外，也可以使用估測細(xì)胞程序死亡性細(xì)胞死亡的其它方法。
圖9示出了各種WI-L2轉(zhuǎn)化體對抗-Fas處理的抗細(xì)胞程序死亡應(yīng)答。圖8示出了各種WI-L2轉(zhuǎn)化體對血清喪失的抗一細(xì)胞程序死亡應(yīng)答。在圖9中，將重復(fù)試驗孔中的3×105細(xì)胞與50ng/ml東細(xì)胞的抗-Fas抗體一起溫育24小時。然后用帶FACS can的流動細(xì)胞計數(shù)器分析細(xì)胞死亡。從各構(gòu)建體表達(dá)的蛋白質(zhì)表示在柱狀體的下面。因為許多構(gòu)建體是截短或缺失變體，所以也表示出了表達(dá)的精確氨基酸?？梢钥闯?，與含有單獨的pREP7載體的對照轉(zhuǎn)化體比較，所有轉(zhuǎn)化體均具有某些保護(hù)作用。最強(qiáng)細(xì)胞程序死亡抗性的轉(zhuǎn)化體是Cdn-1Δ2表達(dá)細(xì)胞系，其中抗-fas處理后90％以上的細(xì)胞存活。在表達(dá)全長cdn-1(1-211)和Cdn-1Δ1轉(zhuǎn)化體以及Bel-2Δ和Bcl-2表達(dá)細(xì)胞系中也觀察到明顯的保護(hù)作用。
Cdn-1Δ1和Cdn-1Δ2分別缺乏編碼全長Cdn-1的N-端59和70氨基酸的核苷酸。在阻斷細(xì)胞程序死亡上Cdn-1Δ2的表達(dá)比全長Cdn-1的表達(dá)更有效的觀察結(jié)果表明較小的截短的Cdn-1分子可能是有效的治療劑。
實施例6其它Cdn基因的測定和Cdn-2基因的克隆人基因組DNA和一系列人/嚙齒動物體細(xì)胞DNA的Southern印跡分析表明有至少3種Cdn相關(guān)基因，且它們位于染色體6、11和20上。三種雜交DNA的PCR/序列分析表明Cdn-1位于染色體6上，另外兩個密切相關(guān)的序列位于染色體20(指定為Cdn-2)和染色體11(指定為Cdn-3)上。我們已克隆了Cdn-2和Cdn-3基因并對它的測序。有趣的是，Cdn-2和Cdn-3兩者均不含有內(nèi)含子并具有已回復(fù)到基因組的處理基因的所有特征。Cdn-3具有核苷酸缺失，導(dǎo)致讀框移位和早期終子，因此很可能是假基因。然而，當(dāng)用Cdn-2和Cdn-3識別的探針經(jīng)northern印跡分析時，兩者具有啟動子元件[CCAAT，TATAAA盒]但很可能不被轉(zhuǎn)錄。
用含有Cdn-1完全編碼區(qū)的950 bp BglII-HindIII CDNA探針篩選在粘粒載體pWE15(Stratagene，La Jolla，CA)中的來源于人胎盤的900,000個克隆的基因組文庫。探針是按照Feinberg andVogelstein(1984)Anal.Biochem.137266-267所述方法32p-標(biāo)記的。在按Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring harbor laboratory Press描述的高度嚴(yán)格的雜交和洗滌條件下處理和篩選文庫。經(jīng)重新鋪成平板和進(jìn)行以上的篩選進(jìn)一步純化10個雙陽性的克隆。按供給者(Promega Corp.，Madison，WI)的描述用Wizard Maxiprep DNA純化系統(tǒng)純化質(zhì)粒DNA，并且用EcoRI限制酶作圖和Southern印跡法分析。用于Southern印跡法和雜交步驟的探針與以上的相同。
當(dāng)用Eco RI限制分析和Southern印跡分析判斷時，粘?？寺》殖蓛山M。粘?？寺?cos)1-4和7顯示出Eco RI產(chǎn)生的DNA片段的一個不同的模式，并含有單個6.5kb雜交Eco RI DNA片段。Cos2和Cos9落于第二組(以5.5kb雜交EcoRI DNA片段為特征)。用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)(Sambrook et al.同上)將Cos2的6.5kbDNA片段和cos9的5.5kb DNA片段亞克隆進(jìn)pBluescript SK(Stratagene，La Jolla，CA)中。分離質(zhì)粒DNA，用Bam HI、HindIII和EcoRI對兩個亞克隆A4(來自Cos2)和C5(來自Cos9)的DNA插入物進(jìn)行作圖，并按以上的描述進(jìn)行Southern印跡分析。將兩種克隆的較小的限制片段亞克隆進(jìn)MB測序載體，并測定DNA序列。
A4序列含有顯示與Cdn-197％氨基酸一致性的開放讀框(圖5)。這一基因與Cdn-1的高度的序列一致性表明，它是一個新的Cdn-1相關(guān)基因，因此將被稱作Cdn-2。圖6示出了編碼的Cdn-2蛋白質(zhì)和Bcl-2族其它成員的序列比較。Cdn-2含有保守區(qū)BH1和BH2(這是Bcl-2族的特點)并顯示出與其它成員的低和總體序列一致性(20-30％)(這也是Bel一族的特征)。Cdn-3具有讀框移位(產(chǎn)生短的非相關(guān)的多肽)，并且因此不含有Cdn-1、Cdn-2或其它Bcl-2族成員的結(jié)構(gòu)特征。
實施例7Cnd-1、Cdn-2和Cdn-3基因的染色體定位將一系列人/嚙齒動物體細(xì)胞雜交DNA(Panel2#DNA，從theWIGMS，Camden，NJ獲得)的Southern印跡分析和中期染色體的螢光原位雜交(FISH)用于人染色體Cdn基因的作圖。進(jìn)行Southern印跡分析時，將5mg雜交組DNA用EcoRI或BamHI/HindIII消化，在0.8％或1％瓊脂糖凝膠上分級分離，轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上并用Cnd-1探針雜交。按以上描述進(jìn)行雜交和洗滌。進(jìn)行FISH時，將Cdn-2亞克隆A4用Bionick Labeling System(Gibco BRL，Gaithers-burg，MD)進(jìn)行生物素?；碫iegas-Pequignot in In Situ Hy-bridization，A Practical Approch，1992，ed.D.G.wilkinson，pp.137-158，IRL Press，Oxford描述的方法雜交到正常人成纖維細(xì)胞的中期染色體上。按Pinkel et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 859138-9142描述的方法，用FITC-綴合的親和素和生物素化的山羊抗一親和素進(jìn)行探針檢測。
在人DNA對照中，Southerns印跡分析顯示三個雜交EcoRI帶，其長度約12kb、11kb和5.5kb。體細(xì)胞雜交DNA分析表明，12kb帶在兩個不同的樣品中，這兩個樣品是NA10629(僅含人染色體6)和NA07299(含人染色體1和X兩者，且更重要地含染色體6端粒到p21的部分。11kb帶在NA13140(含人染色體20)中。5.5kb雜交帶僅在樣品NA10927A(含人染色體11)中發(fā)現(xiàn)。用Cdn-1、Cdn-2或Cdn-3引物進(jìn)行的這些雜交DNA樣品的PCR/DNA測序分析顯示出在NA10629(含染色體6的雜交DNA)和NA07299(染色體1、X和6pter＞含p21的雜交DNA)中存在Cdn-1序列，這說明Cdn-1基因位于染色體6(端粒到p21)上。Cdn-2序列在NA13140中發(fā)現(xiàn)，表明Cdn-2基因位于染色體20上。Cdn-3序列在NA10927A中發(fā)現(xiàn)，表明Cdn-3基因位于染色體11上。
實施例8在FL5.12細(xì)胞中Cdn-1和Cdn-2對細(xì)胞程序死亡的調(diào)節(jié)作用FL5.12是一種IL-3依賴性淋巴祖細(xì)胞系(Mckearn et al.(1985)Proc.Natl.Acad.SciUSA 827414-7418)，已闡明該細(xì)胞系經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡，接著是IL-3退隱，但由Bcl-2過度表達(dá)阻止細(xì)胞死亡(Nunez et al.(1990)J.Immuno.1443602-3610；和Hockenbery et al.(1990)Nature 348334-336)。為了估價Cdn-1和Cdn-2調(diào)節(jié)細(xì)胞程序死亡的能力，將cDNA編碼Cdn-1、Cdn-2、Cdn-1的兩種截短形式(以下描述)和Bcl-2連接到哺乳動物表達(dá)載體(pcDNA3，Invitrogen，San Diego，CA)上，并用電穿孔引入到小鼠祖代B淋巴細(xì)胞系FL5.12中，然后在含抗生素G418的培養(yǎng)基上選擇。然后按以下的描述在集團(tuán)轉(zhuǎn)化體上進(jìn)行試驗。
在IL-3退隱后的不同時間檢測過度表達(dá)的基因?qū)L5.12細(xì)胞生存力的影響，并示于圖10中。在流動細(xì)胞計數(shù)器(Becton Dick-inison FACScan)上用碘化丙錠排阻估測細(xì)胞生存力。當(dāng)與載體對照比較時，Bcl-2表達(dá)明顯阻止細(xì)胞死亡，而Cdn-1顯得增加細(xì)胞死亡。Cdn-2表達(dá)在早期時對細(xì)胞死亡具有低水平的阻止作用，但在后期的各點上不明顯。令人感興趣的是，Cdn-1Δ2給出阻止細(xì)胞死亡的中等水平。盡管比Bcl-2水平低，Cdn-1-112(一種含Cdn-1 N未端112個氨基酸的分子)也表現(xiàn)出對FL5.12細(xì)胞的部分保護(hù)。
如實施例7所示，Cdn-1和Cdn-1Δ2在WI-L2細(xì)胞中的表達(dá)在應(yīng)答抗-Fas-介導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡和血清退隱中導(dǎo)致細(xì)胞存活的增加?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，各種Cdn分子均能以正的或負(fù)的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞程序死亡，正負(fù)方式取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞程序死亡的刺激物。因此，它們在例如心臟的局部缺血后的再輸注組織損傷中阻止細(xì)胞死亡上或者在已不受細(xì)胞程序死亡控制的細(xì)胞(各種癌中正是這種情況)中誘導(dǎo)細(xì)胞互亡上是有效的。
實施例9IFN-γ誘導(dǎo)Cdn-1m RNA在HT-29細(xì)胞中表達(dá)已闡明，人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29僅在用IFN-γ處理后對抗-Fas抗體或TNF的細(xì)胞毒作用敏感(Yonehara et al.(1989)J.Exp.Med.1691747-1756)。這些IFN-γ處理過的細(xì)胞在血清去除(deviation)或放線菌酮處理后也表現(xiàn)出增加的細(xì)胞程序死亡。HT-29細(xì)胞對細(xì)胞程序死亡刺激的這一誘導(dǎo)的敏感性可能部分由于表現(xiàn)為IFN-γ處理后的TNF受體和Fas抗原的伴隨性上調(diào)(up-regulation)(yonehare et al.(1989))。然而，血清去除或放線菌酮處理后觀察到增加的細(xì)胞死亡說明IFN-γ可能誘導(dǎo)其它細(xì)胞程序死亡機(jī)制。
IFN-γ對Bcl-2族成員水平的調(diào)節(jié)作用是誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞對細(xì)胞程序死亡刺激的敏感性的另一種可能的機(jī)制。Cdn-1、Bax或Bcl-x表達(dá)增加和/或Bcl-2或Bcl-XL表達(dá)降低可能會導(dǎo)致細(xì)胞對殺細(xì)胞劑增加的敏感性。為了試驗這種可能性，用實施例2中所述的方法和條件經(jīng)Northern印跡分析檢測未處理的和IFN-γ處理的HT-29細(xì)胞中Bcl-2族成員的mRNA水平。在用IFN-γ誘導(dǎo)后Cdn-1mRNA水平增加約10倍。而Bax和Bel-xmRNA水平保持不變。在未處理的和IFN-γ處理的細(xì)胞兩者中，Bcl-2mRNA低于可檢測的水平。有一種可能性是，經(jīng)IFN-γ處理，Bcl-Xs對Bcl-Xl轉(zhuǎn)錄物的比率可能已增加，但由于轉(zhuǎn)錄物間大小的小的不同，該比率可能不能被Northern印跡分析檢測。Boise等((1993)Cell 74597-608)用未刺激的對PMA加離子霉素刺激的胸腺細(xì)胞進(jìn)行的測定就是這種情況。用半定量PCR，它們表現(xiàn)出刺激后Bcl-Xs對Bcl-Xl的比率增加。采用類似的PCR技術(shù)說明，在HT-29細(xì)胞用IFN-γ處理后，Bcl-Xs對Bcl-Xl mRNA的比率保持不變，主要的轉(zhuǎn)錄物是Bel-Xl(79％)因此，IFN-γ處理后Cdn-1轉(zhuǎn)錄物和HT-29細(xì)胞系的上調(diào)與細(xì)胞死亡敏感性的增加之間存在正相關(guān)。這些結(jié)果表明，在腫瘤細(xì)胞中存在Cdn-1的正調(diào)節(jié)劑，當(dāng)與合適的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑共同給藥時，它們在治療某些腫瘤上可能是有用的。
盡管為清楚說明的目的以說明和實施例的方式用某些詳細(xì)的內(nèi)容描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，可以進(jìn)行某些變化和修改。因此，所描述和實施例不構(gòu)成對所附權(quán)利要求描繪的本發(fā)明發(fā)明范圍的限制。
權(quán)利要求
1.一種組合物，該組合物包含基本上純化的編碼Cdn的核苷酸序列。
2.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所說的核苷酸序列是從基因組DNA衍生的。
3.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所說的Cdn是Cdn-1。
4.按照權(quán)利要求3的組合物，該組合物具有圖3描述的核苷酸序列。
5.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所說的Cdn是Cdn-2。
6.按照權(quán)利要求5的組合物，該組合物具有圖5描述的核苷酸序列。
7.一種組合物，該組合物包含編碼Cdn的重組DNA載體。
8.按照權(quán)利要求7的組合物，其中所說的Cdn是Cdn-1。
9.按照權(quán)利要求8的組合物，其中所說的核苷酸序列是圖3描述的核苷酸序列。
10.按照權(quán)利要求7的組合物，其中所說的Cdn是Cdn-2。
11.按照權(quán)利要求10的組合物，其中核苷酸序列是圖5描述的核苷酸序列。
12.按照權(quán)利要求7的重組DNA載體，其中編碼Cdn的序列的表達(dá)在誘導(dǎo)型啟動子控制下。
13.一種組合物，該組合物包含用編碼Cdn的重組DNA載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
14.按照權(quán)利要求13的組合物，其中所說的Cdn是Cdn-1。
15.按照權(quán)利要求14的組合物，其中所說的核苷酸序列是圖3描述的核苷酸序列。
16.按照權(quán)利要求13的組合物，其中所說的Cdn是Cdn-2。
17.按照權(quán)利要求16的組合物，其中所說的核苷酸序列是圖5描述的核苷酸序列。
18.一種轉(zhuǎn)基因動物，該轉(zhuǎn)基因動物包含編碼Cdn的重組DNA載體。
19.按照權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因動物，其中所說的Cdn是Cdn-1。
20.按照權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因動物，其中所說的Cdn核苷酸序列是圖3描述的核苷酸序列。
21.按照權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因動物，其中所說的Cdn是Cdn-2。
22.按照權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)基因動物，其中所說的Cdn核苷酸序列是圖5描述的核苷酸序列。
23.一種組合物，該組合物包含基本上純化的Cdn蛋白質(zhì)。
24.按照權(quán)利要求23的組合物，其中所說的蛋白質(zhì)是Cdn-1。
25.按照權(quán)利要求24的組合物，其中所說的核苷酸序列是圖3描述的核苷酸序列。
26.按照權(quán)利要求23的組合物，其中所說的Cdn是Cdn-2。
27.按照權(quán)利要求26的組合物，其中所說的核苷酸序列是圖5描述的核苷酸序列。
28.按照權(quán)利要求23的組合物，其中所說的蛋白質(zhì)由重組DNA表達(dá)。
29.按照權(quán)利要求23的組合物，其中所說的蛋白質(zhì)是天然蛋白質(zhì)。
30.一種組合物，該組合物包含按照權(quán)利要求23的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的緩沖液。
31.按照權(quán)利要求30的組合物，其中所說的蛋白質(zhì)以治療有效量存在。
32.一種組合物，該組合物包含識別Cdn，但基本上不與Bcl族的其它成員反應(yīng)的單克隆或多克隆抗體。
33.一種在生物樣品中檢測Cdn蛋白質(zhì)存在的方法，該方法包括以下步驟a)獲得細(xì)胞樣品；b)溶解細(xì)胞或使細(xì)胞對抗體透化；c)向細(xì)胞樣品中添加抗-Cdns-特異性抗體；d)在使抗體與Cdn復(fù)合的條件下保存細(xì)胞樣品；和e)檢測形成的抗體-Cdn復(fù)合物。
34.按照權(quán)利要求33的方法，其中所說的Cdn是Cdn-1。
35.按照權(quán)利要求34的方法，其中所說的核苷酸序列是圖3描述的核苷酸序列。
36.按照權(quán)利要求33的方法，其中所說的Cdn是Cdn-2。
37.按照權(quán)利要求36的方法，其中所說的核苷酸序列是圖5描述的核苷酸序列。
38.按照權(quán)利要求32的方法，其中所說的細(xì)胞樣品包含T細(xì)胞。
39.一種在生物樣品中檢測Cdn基因表達(dá)的方法，該方法包括識別編碼所述Cdn的RNA存在的步驟。
40.按照權(quán)利要求39的方法，其中識別Cdn-1或Cdn-2mR-NA的方法是Northern印跡法。
41.一種識別Cdn mRNA的方法，該方法包括以下步驟a)獲得細(xì)胞樣品；b)從細(xì)胞樣品獲得RNA；c)用相應(yīng)于Cdn特定區(qū)的引物在RNA上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)；和d)檢測聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的存在。
42.一種調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡性細(xì)胞死亡的方法，該方法包括調(diào)節(jié)Cdn內(nèi)源水平。
43.按照權(quán)利要求40的方法，其中所說的Cdn是Cdn-1。
44.按照權(quán)利要求43的方法，其中所說的核苷酸序列是圖3描述的核苷酸序列。
45.按照權(quán)利要求42的方法，其中所說的Cdn是Cdn-2。
46.按照權(quán)利要求45的方法，其中所說的核苷酸序列是圖5描述的核苷酸序列。
47.按照權(quán)利要求41的方法，其中Cdn經(jīng)調(diào)節(jié)內(nèi)源Cdn基因的表達(dá)而增加。
48.按照權(quán)利要求46的方法，其中表達(dá)的Cdn基因被重組基因編碼。
49.按照權(quán)利要求48的方法，其中所述基因的表達(dá)在誘導(dǎo)型啟動子控制下。
50.按照權(quán)利要求49的方法，其中所說的基因是體外轉(zhuǎn)染的，該方法還包括將轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新引入到動物中。
51.按照權(quán)利要求50的方法，其中所說的細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞。
52.按照權(quán)利要求49的方法，其中所說的重組基因被轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞體內(nèi)。
53.一種在需要處理細(xì)胞程序死亡的病人中處理細(xì)胞程序死亡的方法，該方法包括給病人使用治療有效量的Cdn。
54.按照權(quán)利要求53的方法，其中所說的Cdn是Cdn-1。
55.按照權(quán)利要求54的方法，其中所說的核苷酸序列是圖3描述的核苷酸序列。
56.按照權(quán)利要求53的方法，其中所說的Cdn是Cdn-2。
57.按照權(quán)利要求56的方法，其中所說的核苷酸序列是圖5描述的核苷酸序列。
58.按照權(quán)利要求53的方法，其中對需要超氧化物歧化酶的任何病癥施用Cdn。
59.一種檢測Cdns和特異性結(jié)合到Cdns上的蛋白質(zhì)之間的相互作用的方法，該方法包括以下步驟a)使純化的Cdn與含蛋白質(zhì)的胞溶物接觸，所述蛋白質(zhì)在允許蛋白質(zhì)和Cdn結(jié)合的條件下可以結(jié)合到Cdn上；b)分離Cdn；c)使分離的Cdn在允許結(jié)合配偶體和Cdn結(jié)合的條件下與對蛋白質(zhì)特異的結(jié)合配偶體接觸；和d)測定結(jié)合到所述蛋白質(zhì)上的結(jié)合配偶體的量。
60.按照權(quán)利要求59的方法，其中的胞溶物是酵母溶解物。
61.按照權(quán)利要求59的方法，其中的結(jié)合配偶體是抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組具有細(xì)胞程序死亡調(diào)節(jié)活性的新蛋白質(zhì)，其核苷酸和氨基酸殘基序列及其衍生物以及其使用方法。
文檔編號C12N15/85GK1139871SQ94194717
公開日1997年1月8日 申請日期1994年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月30日
發(fā)明者M.C.吉夫爾, P.J.巴爾 申請人:Lxr生物技術(shù)有限公司