專利名稱：一種分階段補(bǔ)糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分階段補(bǔ)糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丁醇是重要的精細(xì)化工原料，也是新型的可再生能源，有著十分廣泛的用途。在世界未來的能源結(jié)構(gòu)中，可再生生物能源將占重要比重。近年來，科研人員在改良丁醇發(fā)酵菌種，改進(jìn)丁醇發(fā)酵技術(shù)，提高丁醇產(chǎn)量和產(chǎn)率，降低丁醇成本等方面取得很大進(jìn)展[鄭海洲等.丁醇生物發(fā)酵的研究進(jìn)展.河北化工.2008，31(12)，36 37]。生物丁醇具有高能量、可混合性、低揮發(fā)性、污染少等優(yōu)點(diǎn)，可以取代乙醇作為一種可再生的燃料添加劑 [Richard VN. Biobutanol enters battle of the alcohols[J]. Chemistry World, 2008, 5(2) :21 21]。工業(yè)上生產(chǎn)丁醇的方法有3種羰基合成法、醇醛縮合法和發(fā)酵法。其中羰基合成法和醇醛縮合法均屬于化學(xué)合成法，二者都以石油為原料，投資大，技術(shù)設(shè)備要求高。而丁醇生物發(fā)酵一般是利用丙酮丁醇梭菌在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行的，其主要產(chǎn)物是丁醇、丙酮和乙醇，含量約為6:3:1，簡稱AB或ABE發(fā)酵[陳駒聲.發(fā)酵法丙酮和丁醇生產(chǎn)技術(shù).北京化學(xué)工業(yè)出版社，1991]。然而實(shí)際發(fā)酵過程中丁醇轉(zhuǎn)化碳源的產(chǎn)率要比乙醇低的多，因此限制了丁醇燃料的發(fā)展[何景昌，張正波，裘娟萍.生物丁醇合成途徑中關(guān)鍵酶及其基因的研究進(jìn)展. 食品與發(fā)酵工業(yè).2009，35(2), 116 120]。制約丙酮、丁醇發(fā)酵產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素主要是溶劑產(chǎn)率、生產(chǎn)強(qiáng)度、生產(chǎn)成本，尤其是溶劑產(chǎn)率(單位質(zhì)量的原料產(chǎn)生的總?cè)軇┵|(zhì)量)低， 以玉米原料為例，總?cè)軇┊a(chǎn)率一般只有30%左右，這樣低的溶劑產(chǎn)率使得發(fā)酵法在和化學(xué)法競(jìng)爭(zhēng)時(shí)處于劣勢(shì)。高濃度的底物對(duì)丙酮丁醇梭菌有較強(qiáng)的抑制作用，為防止底物對(duì)生物體的毒害作用，以一定的稀釋比率流加高濃度的底物，可以減小底物的抑制作用。不同的碳氮比對(duì)丁醇發(fā)酵特定的發(fā)酵時(shí)期——產(chǎn)酸期和產(chǎn)醇期有著不同的影響，可以使溶劑的產(chǎn)量得到提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種分階段補(bǔ)糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，以提高丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量和產(chǎn)率，達(dá)到碳源的高效利用。為了解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案在于
一種分階段補(bǔ)糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三步驟，其特征在于在厭氧發(fā)酵步驟中，在原始不含碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10 20 g/L的葡萄糖、木糖或者其組合，接入種子液開始厭氧發(fā)酵，發(fā)酵進(jìn)行8 12小時(shí)后再向發(fā)酵體系補(bǔ)加入40 50 g/L的葡萄糖、木糖或者其組合，至完成厭氧發(fā)酵。其中，本發(fā)明所述的發(fā)酵菌種是丙酮丁醇梭菌(C/^irii/i acetobutylicum)； 本發(fā)明所述的丙酮丁醇梭菌是 Clostridium acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M2010011)，丙酮丁醇梭菌 C/osirii/i腫 acetobutylicum ASl. 134(CGMCC 1. 134)，或者丙酮 Til Clostridium acetobutylicum ASl. 135 (CGMCC 1. 135)。本發(fā)明所述的菌種活化步驟是常規(guī)的丙酮丁醇梭菌所采用的菌種活化方法。在本發(fā)明中，菌種由凍存的甘油管中接入50 mL血清瓶的pH為6. 0 7. 0的含有淀粉的能提供碳源、氮源以及無機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基中，通入隊(duì)或CO2，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為30 40°C，活化培養(yǎng)12 M h，用于種子培養(yǎng)基接種和菌種保存。本發(fā)明所述的種子培養(yǎng)步驟是常規(guī)的丙酮丁醇梭菌所采用的種子培養(yǎng)方法。在本發(fā)明中，種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PH 6. 0 7. 0的含有糖類的能提供碳源、氮源以及無機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)將500 mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基100 400 mL，通入隊(duì)或0)2，115 121°C滅菌15 30 min，冷卻后接入活化的種子液，培養(yǎng)溫度為30 40°C，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為8 16 h，用于發(fā)酵罐接種。本發(fā)明所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. 0 7. 0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機(jī)鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基，5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為2 4 L ；且厭氧發(fā)酵的操作和發(fā)酵條件也是常規(guī)的利用丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法，在本發(fā)明中，接種量為體積比5% 10%，溫度為35 40°C，發(fā)酵罐通入隊(duì)或C02， 以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在100 200 rpm，發(fā)酵時(shí)間為48 72 h。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明通過在微生物發(fā)酵的不同階段控制補(bǔ)糖，達(dá)到葡萄糖的高效利用，提高了丁醇以及總?cè)軇┑漠a(chǎn)率。本發(fā)明采在不同階段控制補(bǔ)糖，對(duì)于控制發(fā)酵的產(chǎn)酸和產(chǎn)醇，提高分批和連續(xù)發(fā)酵的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量，高效利用碳源都有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。該方法同樣可以用于利用低劣生物質(zhì)進(jìn)行的丁醇發(fā)酵。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1
菌種丙酮丁醇梭菌 CZo1SiriiZi腫 acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M 2010011) 種子培養(yǎng)基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L，NaCl 2g/L， MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基(P2):碳源(葡萄糖 60 g/L 分消)，K2HPO4 0. 5g/L, KH2PO4 0. 5g/L， CH3COONH4 2. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, MnSO4 · H2O 0. Olg/L, NaCl 0. Olg/L, FeSO4 · 7H20 0.01g/L;玉米漿 lg/L。5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50 mL血清瓶中30 mL的種子培養(yǎng)基中，通入隊(duì)，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng) 12h后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300 mL種子培養(yǎng)基的500mL血清瓶中，擴(kuò)大培養(yǎng)，1 后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10% (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在120rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入N2，通氣量為0. 25 vvm，IOmin后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。補(bǔ)糖方式1 發(fā)酵培養(yǎng)基的總碳源需求為分消的葡萄糖，其總濃度為60 g/L;在原始不含碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中先加入10 g/L的葡萄糖后開始接入種子液發(fā)酵，發(fā)酵進(jìn)行12 h后將余下的50 g/L的葡萄糖補(bǔ)入發(fā)酵罐中，并與對(duì)照組的發(fā)酵結(jié)果對(duì)比，發(fā)酵至總?cè)軇┊a(chǎn)量不再變化。結(jié)果如表1。
表1補(bǔ)糖方式1與對(duì)照組的發(fā)酵結(jié)果對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種分階段補(bǔ)糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三步驟，其特征在于在厭氧發(fā)酵步驟中，在原始不含碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10 20 g/L的葡萄糖、木糖或者其組合，接入種子液開始厭氧發(fā)酵，發(fā)酵進(jìn)行8 12小時(shí)后再向發(fā)酵體系補(bǔ)加入40 50 g/L的葡萄糖、木糖或者其組合，至完成厭氧發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分階段補(bǔ)糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的微生物菌種為丙酮丁醇梭菌(C/osirii/i腫eicetobutylicum)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分階段補(bǔ)糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于所述的丙酮丁醇梭菌是 Clostridium acetobutylicum XY16，丙酮丁醇梭菌 Clostridium acetobutylicum ASl. 134,Clostridium acetobutylicum ASl. 135。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分階段補(bǔ)糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇三步驟，且根據(jù)丙酮丁醇梭菌在不同的碳氮比時(shí)顯示出的不同發(fā)酵特性，在同樣的總糖(濃度下調(diào)整了發(fā)酵的補(bǔ)糖策略，當(dāng)選擇在發(fā)酵開始補(bǔ)糖10～20g/L，8～12h后再將余下的糖一次性補(bǔ)足，與在發(fā)酵開始補(bǔ)糖相比，丁醇產(chǎn)量提高了18.4%，總?cè)軇┊a(chǎn)量提高了19.3%，丁醇產(chǎn)率提高了39.5%，總?cè)軇┊a(chǎn)率可以達(dá)到0.424gABE/g糖，提高了35.9%。此方法提高了丁醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率，操作簡便，碳源得到了更有效地利用，可顯著地提高丁醇的工業(yè)產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12R1/145GK102174596SQ20111006906
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者奚永蘭, 姜岷, 孫佰軍, 杜騰飛, 歐陽平凱, 賀愛永, 郭亭, 陳可泉 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)