一種構(gòu)建重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構(gòu)建重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法，屬于代謝工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過在酵母中表達(dá)肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)，實(shí)現(xiàn)葡萄糖醛酸的生成途徑，同時(shí)表達(dá)來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脫氫酶(Udh)，成功構(gòu)建了葡萄糖二酸的合成途徑。其中，重組畢赤酵母在YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中生成葡萄糖二酸40mg/L，在YPD-MI(YPD培養(yǎng)基中加入60mM肌醇)發(fā)酵培養(yǎng)基中生成葡萄糖二酸60mg/L。本發(fā)明提出的重組酵母發(fā)酵生成葡萄糖二酸的方法，具有廣闊的發(fā)展前景，為生物合成葡萄糖二酸奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種構(gòu)建重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種構(gòu)建重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法，屬于代謝工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖二酸（glucuric acid, saccharic acid)又名葡萄糖質(zhì)酸，是葡萄糖的醒基 及C-6上羥基均被氧化成羧酸（如硝酸作用）而形成的糖酸。熔點(diǎn)125?126°C，溶于水和 乙醇，稍溶于乙醚，是β葡萄糖醛酸酶的抑制劑。
[0003] 葡萄糖二酸及其衍生物在一些植物及哺乳動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)，特別是在一些十字花 科蔬菜、草莓和柑橘類水果中含量豐富。葡萄糖二酸具有重要的生物功能，被美國能源部確 定為"最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品"。它可以降低膽固醇、用于癌癥的治療，同時(shí)其鈣鹽也是一 種食品添加劑。葡萄糖二酸在水溶液中不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟嵌醿?nèi)酯的形式，二者在水 溶液處于互變平衡狀態(tài)。葡萄糖二酸1，4內(nèi)酯也是一種重要的功能產(chǎn)品，它可使肝素、透明 質(zhì)酸、硫酸粘多糖以及葡萄糖醛酸的破壞大大減少，幫助身體有效的排除毒素，并能夠緩解 關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、氣喘和相關(guān)組織功能下降所引起的其他不適。
[0004] 葡萄糖二酸由于對(duì)人體無毒，并且其結(jié)構(gòu)域單糖結(jié)構(gòu)相似，可以通過糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，能夠在病灶部位聚集，并少量被缺血組織快速吸收，因此可以作為顯像劑應(yīng) 用于心肌梗死和腫瘤的研究中。同時(shí)，葡萄糖二酸也可用作聚合物的組成部分，比如新型尼 龍和超支化聚酯。葡萄糖二酸已成功利用在生產(chǎn)羥化尼龍上，這種材料是一種環(huán)保型的可 生物降解的新材料。
[0005] 目前葡萄糖二酸的制備方法主要為化學(xué)法，如硝酸氧化、以2, 2, 6, 6-四甲基哌啶 氧化物（TEMPO)為催化劑的共催化氧化等。硝酸氧化法主要是以葡萄糖為原料，通過硝酸 氧化為葡萄糖二酸及其小分子物質(zhì)。此種方法生成的產(chǎn)物較多，副產(chǎn)物復(fù)雜，同時(shí)產(chǎn)生大量 氣體，其反應(yīng)廢液對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染，因此逐漸被新方法取代。
[0006] 2, 2, 6, 6-四甲基哌啶氧自由基（TEMPO)氧化體系是近年來發(fā)展起來的一種新的 方法，TEMPO屬于亞硝酰自由基，是一種穩(wěn)定的自由基，其氮氧自由基通過不成對(duì)電子在氮 氧之間移動(dòng)形成了共振結(jié)構(gòu)。TEMPO氧化體系對(duì)糖類伯羥基的氧化選擇性高、反應(yīng)條件溫 和、能避免降解。由于葡萄糖二酸的水溶液易形成葡萄糖1，4-內(nèi)酯及葡萄糖6, 3-內(nèi)酯，所 以在制備過程中以制得單鉀鹽為最終產(chǎn)物。此方法所用TEMPO可回收利用，產(chǎn)物純化容易， 便于操作，是目前常用的一種方法。但是由于反應(yīng)過程中的反應(yīng)溫度及PH不易控制，因此 仍然需要改進(jìn)。
[0007] 由于化學(xué)法所存在的局限較多，通過生物法來制備葡萄糖二酸越來越受到研究者 的關(guān)注。葡萄糖二酸是存在于哺乳動(dòng)物的代謝途徑中，它與抗壞血酸是葡萄糖醛酸代謝途 徑的終產(chǎn)物。然而，從D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反應(yīng)。Prather 等通過重組大腸桿菌，分別從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)和小鼠體內(nèi)獲取肌 醇-1-磷酸合成酶（Inol)和肌醇氧化酶（MIOX)，從丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae) 獲得醛酸脫氫酶基因，克隆到大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖二酸的生物合成。
[0008] 酵母是單細(xì)胞低等真核生物，既有原核生物細(xì)胞容易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、操作簡(jiǎn) 單，又具有真核生物表達(dá)時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)的加工和修飾等功能。由于它培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)要求低、生 長(zhǎng)快、培養(yǎng)基廉價(jià)、可進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，因此是一種可用于生產(chǎn)目標(biāo)生物產(chǎn)品的優(yōu)良宿 主。
[0009] 目前尚未發(fā)現(xiàn)有通過重組酵母來發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸的報(bào)道，原始的酵母菌株并 不能生成葡萄糖二酸，鑒于此，本發(fā)明中構(gòu)建的新型重組工程菌，在微生物發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖 二酸方面，提供了新的方法與思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明通過將肌醇-1-磷酸合成酶基因（Inol)、肌醇加氧酶基因（MIOX)及醛酸脫 氫酶基因（Udh)克隆表達(dá)至酵母菌株中，構(gòu)建重組酵母，該重組酵母菌能以葡萄糖、甘油、 蔗糖或者肌醇為底物合成葡萄糖二酸。
[0011] 本發(fā)明提供一種重組酵母菌，該重組酵母菌同時(shí)表達(dá)肌醇-1-磷酸合成酶基因 InoU肌醇加氧酶基因 ΜΙ0Χ、醛酸脫氫酶基因 Udh。
[0012] 所述肌醇-1-磷酸合成酶基因 Inol來源于以下任意一種：釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母（Pichia pastoris)、閃爍古生球菌 (Archaeoglobus fulgidus)〇
[0013] 所述肌醇-1-磷酸合成酶基因 Inol，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，來源于Pichia pastoris GS115。
[0014] 所述肌醇加氧酶基因 MIOX來源于以下任意一種：小鼠（mouse)、畢赤酵母（Pichia pastoris GS115)、白假絲酵母（Candida albicans)。
[0015] 所述肌醇加氧酶基因 ΜΙ0Χ，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，來源于Pichia pastorisGS115〇
[0016] 所述醒酸脫氫酶基因 Udh來源于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)。
[0017] 所述肌醇-1-磷酸合成酶基因 InoU肌醇加氧酶基因 ΜΙ0Χ、醛酸脫氫酶基因 Udh， 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其氨基酸序列分別是SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 所示的序列。
[0018] 所述肌醇-1-磷酸合成酶基因 InoU肌醇加氧酶基因 ΜΙ0Χ、醛酸脫氫酶基因 Udh， 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其核苷酸序列分別是SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 所示的序列。
[0019] 所述醛酸脫氫酶基因 Udh前有GAP啟動(dòng)子。
[0020] 所述肌醇-1-磷酸合成酶基因 Inol前有畢赤酵母組成型啟動(dòng)子TEF。
[0021 ] 所述重組酵母菌的出發(fā)宿主菌為以下任意一種：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、解脂假絲酵母（Candida Iipolytica)、畢赤酵母（Pichia pastoris)。
[0022] 所述肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇加氧酶基因及醛酸脫氫酶基因?yàn)檎媳磉_(dá)。
[0023] 本發(fā)明還提供一種所述重組酵母菌的構(gòu)建方法，包括：（1)在Udh基因前融合GAP 啟動(dòng)子構(gòu)成融合片段，連接到表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化到酵母宿主菌中，得到重組菌；（2)將MIOX基 因、組成型啟動(dòng)子TEF、Inol基因按順序融合，連接到表達(dá)載體上再轉(zhuǎn)化到步驟1得到的重 組菌中。
[0024] 所述構(gòu)建方法，具體是：（I)Pichia pastoris GS115/Udh的構(gòu)建：以惡臭假單胞 菌（Pseudomonas putida)的基因組為模板擴(kuò)增Udh基因，以pGAPZB質(zhì)粒為模板擴(kuò)增GAP 啟動(dòng)子，將GAP啟動(dòng)子與Udh基因融合成上下游分別引入了酶切位點(diǎn)SacI、NotI的融合片 段，并連接到表達(dá)載體PPIC9K上，篩選獲得正確的重組質(zhì)粒，命名為pPIC9K-GAP-Udh，將重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主 Pichia pastoris GS115 中即得到 Pichia pastoris GS115/Udh; (2) 以Pichia pastoris GSl 15基因組為模板擴(kuò)增MIOX基因、Inol基因，以pGAPZB質(zhì)粒為模 板擴(kuò)增畢赤酵母組成型啟動(dòng)子TEF，將MI0X、TEF、Inol按順序融合，并在融合片段兩端添加 XhoI，XbaI酶切位點(diǎn)，將融合片段連接到表達(dá)載體pGAPZB后，用BspHI線性化后電轉(zhuǎn)入步驟 1構(gòu)建的表達(dá)宿主Pichia pastoris GS115/Udh中，篩選正確的重組酵母菌，命名為Pichia pastoris GSl15/Udh-MTI。
[0025] 本發(fā)明還提供一種利用所述重組酵母菌生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法，其特征在于，是 以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇為底物催化合成葡萄糖二酸。
[0026] 所述方法具體是將重組酵母菌種子液以5% -10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 中，與 25°C -3(TC，180rpm-220rpm，培養(yǎng) 24h - 96h。
[0027] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其碳源為葡萄糖和/或肌醇。
[0028] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是將種子培養(yǎng)液按10 %接種量接種 至Ij含有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的量為500ml的搖瓶中，溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)60小 時(shí)。
[0029] 本發(fā)明提供了一種通過重組酵母發(fā)酵生成葡萄糖二酸的方法，重組畢赤酵母在 YH)培養(yǎng)基中產(chǎn)生葡萄糖二酸40mg/L，在YPD-MI (在YH)培養(yǎng)基中添加60mM肌醇）的培 養(yǎng)基中，產(chǎn)生葡萄糖二酸60mg/L,對(duì)照畢赤酵母Pichia pastorisGS115中，沒有檢測(cè)到葡 萄糖二酸。本發(fā)明所用的來源于畢赤酵母中的肌醇加氧酶基因與現(xiàn)有報(bào)道的來源于小鼠的 MIOX氨基酸差異較大，并且目前沒有來源于畢赤酵母中MIOX基因能夠?qū)⒓〈嫁D(zhuǎn)化為醛酸 的相關(guān)報(bào)道。重組酵母合成葡萄糖二酸，還具有培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)快、培養(yǎng)基廉價(jià)、遺 傳穩(wěn)定、表達(dá)水平高、可高密度發(fā)酵等許多優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用代謝工程的策略，改造微生物 菌株來合成目的產(chǎn)物葡萄糖二酸，為生物法高效生產(chǎn)葡萄糖二酸打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1 :重組畢赤酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖二酸；1為對(duì)照菌株P(guān)ichia pastorisGSl 15, 2 為重組畢赤酵母 Pichia pastoris GSl 15/Udh-MTI 在 YH)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 結(jié)果，3為重組畢赤酵母Pichia pastoris GSl 15/Udh-MTI在YPD-MI中培養(yǎng)結(jié)果；
[0031] 圖2 :LC_MS檢測(cè)發(fā)酵液中葡萄糖二酸的結(jié)果；A為葡萄糖二酸標(biāo)樣，B為重組畢赤 酵母發(fā)酵液。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 葡萄糖二酸的檢測(cè)：液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS)，儀器島津離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 LCMS-IT-T0F。葡萄糖二酸標(biāo)樣的配制：準(zhǔn)確稱取IOmg葡萄糖二酸鈣粉末溶于20%甲酸中， 將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至IOOml容量瓶中定容，其濃度為100mg/L。再用去離子水分別稀釋至 50、20、10、5 和 lmg/L。
[0033] 樣品制備：1ml發(fā)酵液在8000rpm下離心IOmin,取上清經(jīng)0· 22um濾膜過濾，濾液 供液相質(zhì)譜分析。
[0034] 分析條件：
[0035] 流動(dòng)相：A :ImM甲酸銨+0. 01%甲酸+水；B : ImM甲酸銨+乙腈
[0036] 洗脫程序：0-12min30 % B ;12-30min30 % -65 % ;30-31min65 % -95 % ; 31-35min95%
[0037] 35-36min95% -30% B ；36-40min30%
[0038] 色譜柱：Shim-packVP-0DS(150LX2. 0)
[0039] 流速：0· 15ml/min 進(jìn)樣量：5ul
[0040] 離子化模式：電噴霧負(fù)離子模式
[0041] 霧化氣流速：1. 5L/min
[0042] CDL 溫度：200°C HB 溫度：200°C
[0043] 掃描范圍：MSI，m/zl50_300
[0044] 實(shí)施例1重組畢赤酵母Pichia pastoris GS115/Udh的構(gòu)建
[0045] 以惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida KT2440)基因組為模板，udh_F(序列如SEQ ID NO. 7所示）、udh-R(序列如SEQ ID NO. 8所示）為引物擴(kuò)增Udh基因，同時(shí)以pGAPZB 質(zhì)粒為模板，G-F (序列如SEQ ID NO. 9所示）、G-R(序列如SEQ ID NO. 10所示）為引物擴(kuò) 增GAP啟動(dòng)子。使用融合PCR方法，將GAP啟動(dòng)子與Udh基因融合，通過引物在融合片段上 下游分別引入酶切位點(diǎn)SacI和Notl。通過對(duì)融合片段雙酶切，連接至具有相應(yīng)切口的表 達(dá)載體PPIC9K上，轉(zhuǎn)化至E. coliJM109中，在確保閱讀框正確的前提下鑒定出重組表達(dá)質(zhì) 粒pPIC9K-GAP-Udh，經(jīng)DNA測(cè)序比對(duì)，重組序列正確。重組質(zhì)粒經(jīng)Sail線性化后電轉(zhuǎn)入表 達(dá)宿主Pichia pastoris GS115中，重組克隆子經(jīng)PCR驗(yàn)證正確，命名為Pichia pastoris GS115/Udh。
[0046] 實(shí)施例 2 重組菌 Pichia pastoris GS115/Udh_MTI 的構(gòu)建
[0047] 以Pichia pastoris GS115基因組為模板，用引物M_F(序列如SEQ ID NO. 11所 示）、M-R(序列如SEQ ID NO. 12所示）擴(kuò)增MIOX基因，用引物I-F (序列如SEQ ID NO. 13 所示）、I-R(序列如SEQ ID NO. 14所示）擴(kuò)增Inol基因。同時(shí)以pGAPZB質(zhì)粒為模板，用引 物T-F (序列如SEQ ID NO. 15所示）、T-R(序列如SEQ ID NO. 16所示）擴(kuò)增畢赤酵母組成 型啟動(dòng)子TEF。將獲得的MI0X、TEF、Inol基因按順序融合，通過設(shè)計(jì)引物，在融合片段兩端 添加 Xhol，XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。經(jīng)雙酶切，連接至具有相應(yīng)切口的表達(dá)載體pGAPZB上，轉(zhuǎn) 化E. coli T0P10中，在確保閱讀框正確的前提下，鑒定出重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZB-MTI，經(jīng)測(cè) 序比對(duì)，序列正確。重組質(zhì)粒經(jīng)BspHI線性化后電轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主Pichia pastoris GS115/ Udh中，重組克隆子經(jīng)PCR驗(yàn)證正確，命名為Pichia pastoris GS115/Udh-MTI。
[0048] 表1為實(shí)施例1、2中用到的引物。
[0049] 表1引物
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組酵母菌，其特征在于，所述重組酵母菌同時(shí)表達(dá)肌醇-1-磷酸合成酶基因 InoU肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脫氫酶基因Udh。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因 Inol來源于以下任意一種：釀酒酵母、畢赤酵母、閃爍古生球菌；所述肌醇加氧酶基因MIOX 來源于以下任意一種：小鼠、畢赤酵母、白假絲酵母；所述醛酸脫氫酶基因Udh來源于惡臭 假單胞菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因 InoU肌醇加氧酶基因MI0X、醛酸脫氫酶基因Udh的氨基酸序列分別是SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 所示的序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的重組酵母菌，其特征在于，所述重組酵母菌的出發(fā)宿主菌 為以下任意一種：釀酒酵母、解脂假絲酵母、畢赤酵母。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的重組酵母菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基 因、肌醇加氧酶基因及醛酸脫氫酶基因?yàn)檎媳磉_(dá)。
6. -種權(quán)利要求1或3所述重組酵母菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：（1) 在Udh基因前融合GAP啟動(dòng)子構(gòu)成融合片段，連接到表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化到酵母宿主菌中，得到 重組菌；（2)將MIOX基因、組成型啟動(dòng)子TEF、Inol基因按順序融合，連接到表達(dá)載體上再 轉(zhuǎn)化到步驟1得到的重組菌中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括：（I)Pichia pastoris GS115/Udh的構(gòu)建：以惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)的基因組為模板擴(kuò)增Udh基 因，以pGAPZB質(zhì)粒為模板擴(kuò)增GAP啟動(dòng)子，將GAP啟動(dòng)子與Udh基因融合成上下游分別引 入了酶切位點(diǎn)SacI、NotI的融合片段，并連接到表達(dá)載體pPIC9K上，篩選獲得正確的重組 質(zhì)粒，命名為pPIC9K-GAP-Udh，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主Pichia pastoris GS115中即得到 Pichiapastoris GS115/Udh; (2)以Pichia pastoris GS115基因組為模板擴(kuò)增MIOX基因、 Inol基因，以pGAPZB質(zhì)粒為模板擴(kuò)增畢赤酵母組成型啟動(dòng)子TEF，將MIOX、TEF、Inol按順 序融合，并在融合片段兩端添加XhoI，XbaI酶切位點(diǎn)，將融合片段連接到表達(dá)載體pGAPZB 后，用BspHI線性化后電轉(zhuǎn)入步驟1構(gòu)建的表達(dá)宿主Pichia pastoris GS115/Udh中，篩選 正確的重組酵母菌,命名為Pichia pastoris GS115/Udh-MTI。
8. -種利用權(quán)利要求1所述重組酵母菌生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法，其特征在于，是以葡 萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇為底物催化合成葡萄糖二酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法具體是將重組酵母菌種子液以 5%-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，與251：-301：，180印111-220印111，培養(yǎng)2411-9611。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖和/或 肌醇。
【文檔編號(hào)】C12P7/58GK104312935SQ201410568277
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】康振, 陳堅(jiān), 堵國成, 王淼, 劉葉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)