專利名稱：固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及生物技術(shù)，且更具體地說(shuō)，涉及遺傳工程在 生產(chǎn)固醇酯類中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物固醇類在降低作為人受試者的飲食組成部分的低密度脂蛋白 ("LDL")膽固醇中的能力已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到了確立。食品與醫(yī)藥管 理局("FDA")已經(jīng)批準(zhǔn)了具有治療價(jià)值的含植物固醇的食品的應(yīng)用并 且它們已經(jīng)上市。
然而，游離植物固醇類難以摻入食品中，這是由游離植物固醇類 的低溶解度所致。另一方面，植物固醇酯類可以以高于游離植物固醇 類10倍的濃度溶于油。因此，當(dāng)前的含植物固醇的食品的商業(yè)化生產(chǎn) 需要高成本的脂肪酸酰化程序。
此外，由于植物中的植物固醇的酯化過(guò)程可以代表一個(gè)限制植物 固醇生物合成和由此限制植物固醇類產(chǎn)量的生化瓶頸，所以對(duì)更有效 的生產(chǎn)固醇酯類的方法存在需求。
發(fā)明概述
在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定了固醇?；D(zhuǎn)移酶基因。固醇?；D(zhuǎn)移 酶基因可以在細(xì)胞中表達(dá)或超表達(dá)并且用于提高細(xì)胞中固醇酯的產(chǎn)
量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，固醇?；D(zhuǎn)移酶基因在植物中表達(dá)或超表
達(dá)以便提高固醇酯類在作物中的產(chǎn)量。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，植 物、植物種子或其子代包含固醇?；D(zhuǎn)移酶基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，固醇?；D(zhuǎn)移酶基因可以在細(xì)胞中表達(dá)或 超表達(dá)并且用于促進(jìn)固醇類在細(xì)胞中的生物合成和蓄積。在一個(gè)另外 的實(shí)施方案中，固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因在植物中表達(dá)或超表達(dá)以便增加 固醇類在作物中的總含量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物、植物種子或 其子代包含固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，披露了具有固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的載體。 該載體可以用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的重組 細(xì)胞。該細(xì)胞可以包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，該細(xì)胞表達(dá)固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因并且產(chǎn)生可以從該細(xì)胞中 分離或純化的固醇?；D(zhuǎn)移酶肽。所述分離或純化的固醇?；D(zhuǎn)移酶 肽可以用于產(chǎn)生在診斷或其它研究中具有效用的抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，披露了與固醇?；D(zhuǎn)移酶基因相關(guān)的核苷 酸和推定的氨基酸序列。該序列或其部分可以用于鑒定來(lái)自其它物的 編碼具有固醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的基因。所述的核苷酸序列可以 用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的重組細(xì)胞。該細(xì) 胞可以包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)固醇酯類的方法包括使用固醇?；?轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)固醇?；D(zhuǎn)移酶基因并且產(chǎn)生 固醇酯類?？梢詮闹亟M細(xì)胞或細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中分離或純化 固醇酯類，且隨后如本文所述摻入組合物。
在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，將使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的固醇酯類與 藥物或營(yíng)養(yǎng)組合物的活性組分，諸如，例如降膽固醇劑聯(lián)合給予。降 膽固醇劑的非限制性實(shí)例包括，但不限于植物固醇類、歐車前、P葡 聚糖、煙酸、guggul提取物、紅曲酵母提取物、甘蔗脂肪醇、大蒜、 胡蘆巴、米糠油、魚油、亞麻籽油、琉璃苣油、其它含co-3-脂肪酸的 油及其任意的組合。
在一個(gè)另外的典型實(shí)施方案中，將使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的固醇酯
類摻入食品，諸如飲料或食物，多組分營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或其任意的組合中。 可以摻入固醇酯類的食品的非限制性實(shí)例包括降膽固醇的人造黃油、 大豆蛋白、堅(jiān)果、亞麻籽、橄欖油、魚油、任何其它油及其任意的組 合。
通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的固醇酯類可以直接用作食品添加劑或與食 用性載體混合以便用作食品添加劑或食品組合物。本發(fā)明的一種食品 添加劑包括固醇酯類和食用性載體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，制品包括容納一定量的包含本發(fā)明固醇酯 類的組合物的容器和附隨于容器的標(biāo)簽。建立該標(biāo)簽是為了指導(dǎo)標(biāo)簽 的閱讀者攝取有效量的足以有助于降低或減少攝取該組合物的受試者 的膽固醇含量的組合物。
還考慮可以將通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的固醇酯類制備成定期給藥用 膠嚢、片劑或液體形式以便有助于治療涉及高膽固醇的疾病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的固醇酯類作為藥 物或營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)受試者給藥。這種組合物包括固醇酯類和藥學(xué)上可 接受的載體，諸如，例如乳糖、纖維素或等效物或包含在藥物劑型， 諸如膠嚢或片劑中，并且可以與其它藥物或營(yíng)養(yǎng)活性組分或改善固醇 酯類外觀(例如顏色)的化妝品組分聯(lián)用。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了編碼與SEQ ID No. 2具有至少70°/。同 源性的植物固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的分離或重組核酸分子。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了使用如上所述的分離或重組核酸分子 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了用于增加細(xì)胞中固醇酯產(chǎn)量的方法， 該方法包括使用編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的核酸分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞；并且使 細(xì)胞在表達(dá)所述固醇?；D(zhuǎn)移酶的條件下生長(zhǎng)。
本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了分離的植物固醇?；D(zhuǎn)移酶，它包含 與SEQ ID NO: 3至少70%同源的氨基酸序列。
本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了具有固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的基因組敲 除的植物。
本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了鑒定固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的方法，包
括
(a) 使用包含疑似編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的植物cDNA的核酸分子 轉(zhuǎn)化固醇酯合成不足的酵母突變體；和
(b) 檢測(cè)所述酵母中的固醇酯形成，其中存在固醇酯類表示所述 的植物cDNA編碼功能性固醇?；D(zhuǎn)移酶。
附圖簡(jiǎn)述
附

圖1為pYES2. 1/V5-His-T0P(^的遺傳學(xué)圖。
附圖2為At3 g51970的核苷酸序列(SEQ NO: 1)。
附圖3為鼠耳芥屬(Arabidopsis)的植物固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的
CDS的核苷酸序列(SEQ ID NO: 2)。
附圖4為At3g51970的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)。 附圖5例示了表示在使用At3g51970轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中固醇酯類產(chǎn)生
的HPLC色謙圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述
除非另有定義，否則，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本 發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文所述 的那些類似或等效的任何方法和材料都可以用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明， 但是目前描述優(yōu)選的方法和材料。將下文提及的所有出版物均引入本 文作為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用酵母互補(bǔ)手段與酵母提取物中的中性脂 質(zhì)的高效液相色鐠(HPLC)分析相結(jié)合鑒定固醇?；D(zhuǎn)移酶基因。具體 地說(shuō)，固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的基因組序列如附圖2中所示(SEQ IDNo. 1)，酰基轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列如附圖3中所示(SEQ ID No. 2)并且 ?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如附圖4中所示(SEQ ID No. 3)。
基于查詢基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合植物固醇酰基轉(zhuǎn)移酶為膜結(jié)合?；?轉(zhuǎn)移酶的推定可以在鼠耳芥屬中發(fā)現(xiàn)一類含有膜結(jié)合O-?；D(zhuǎn)移酶
7
基元的基因。由于預(yù)計(jì)并非所有的cDNA都能編碼功能性固醇?；D(zhuǎn)移 酶，所以對(duì)固醇酯產(chǎn)生不足的酵母菌林中的基因產(chǎn)物進(jìn)行了生化功能 表征，以便發(fā)現(xiàn)固醇?；D(zhuǎn)移酶基因。通過(guò)RT-PCR，使用幼苗和/或 長(zhǎng)角果RNA作為模板獲得使用查詢方法發(fā)現(xiàn)的基因cDNA的成員。將 cDNA克隆入酵母表達(dá)栽體，諸如，例如易于得到和可商購(gòu)的質(zhì)粒 pYES2. 1/V5-His- T0P0 (附圖1)，并且將具有所述cDNA的質(zhì)粒導(dǎo)入 酵母突變林，諸如，例如為固醇酯合成不足的
為了進(jìn)行選擇，將轉(zhuǎn)化的酵母在-力"-7ew-wra信息遺失的SC培 養(yǎng)基中于28。C下培養(yǎng)2天。所述的酵母表達(dá)栽體攜帶URA基因并且雙 重突變酵母自身能夠合成組氨酸和亮氨酸。酵母轉(zhuǎn)化體在被半乳糖誘 導(dǎo)時(shí)受到中性脂質(zhì)提取物的正相HPLC分析，以便檢測(cè)對(duì)應(yīng)于固醇酯的 獨(dú)特的峰。如果峰在真正的固醇酯保留時(shí)間時(shí)出現(xiàn)，那么就可鑒定出 其產(chǎn)物具有酰化固醇功能的可產(chǎn)生固醇酯類的基因。正如本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以意識(shí)到的，可以使用在固醇?；矫嬗腥毕莼虿蛔愕钠渌?適的突變體或突變體組合代替arelare2。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了鑒定固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的方 法，包括
(a) 使用包含疑似編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的植物cDNA的核酸分子 轉(zhuǎn)化固醇酯合成不足的酵母突變體；和
(b) 檢測(cè)所述酵母中的固醇酯形成，其中與對(duì)照相比存在提高的 固醇酯水平表明所述的植物cDNA編碼功能性固醇?；D(zhuǎn)移酶。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到的，對(duì)照可以為未轉(zhuǎn)化的、模擬 轉(zhuǎn)化的或載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照，并且該對(duì)照不一定需要每次重復(fù)。
在其中突變體在固醇?；矫嬗腥毕莸哪切?shí)施方案中，例如， 突變體為arelare2,注意到存在固醇酯類只是表明所述的植物cDNA 編碼功能性固醇?；D(zhuǎn)移酶并且對(duì)照并不是必要的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，披露了在其整個(gè)長(zhǎng)度范圍內(nèi)與編碼本發(fā)明 的固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，即與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2 和與這類多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸至少50%， 60%， 70%, 80%， 81%，
82%， 83%, 84%, 85%, 86%, 87%， 88%, 89%， 90%, 91%， 92%， 93%, 94%或95%相同的核苷酸。
在其它實(shí)施方案中，披露了編碼與本文披露的固醇?；D(zhuǎn)移酶具 有基本上相同功能的多肽的多核苷酸。明確地包括保守置換。
在其它實(shí)施方案中，披露了純化或分離的植物固醇?；D(zhuǎn)移酶， 其包含至少60%, 65%， 70%， 75%， 76%, 77%, 78%, 79%, 80%， 81%， 82%, 83%, 84%, 85%, 86%， 87%， 88%, 89%, 90%或95%與SEQ ID No. 3同源的氨基酸序列。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到的，'分離的' 意指已經(jīng)'分離'自其天然環(huán)境中，在本案中，分離自植物細(xì)胞的多肽， 而'純化的'不一定指絕對(duì)純度，而是指在純度上至少增加2， 3， 4或 5倍。進(jìn)一步值得注意的是本文描述了用于鑒定這類植物固醇酰基轉(zhuǎn) 移酶的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，披露了與以上披露的序列雜交的多核苷酸。 雜交條件可以為嚴(yán)格的，即如果與編碼本發(fā)明的固醇?；D(zhuǎn)移酶的多 核苷酸具有至少90%, 95°/。或97%同一性，那么就會(huì)發(fā)生雜交。嚴(yán)格條 件可以包括那些用于已知DNA雜交的條件，諸如，例如在42t:的溶液 中孵育過(guò)夜，所述的溶液含有50%甲酰胺、5xSSC (150mMNaCl、 15 mM 檸檬酸三鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、 5 x Denhardt雜交溶液、10% 疏酸葡聚糖和20微克/毫升變性的已剪切鮭精DNA，隨后在約65r下 在O.l x SSC中洗滌雜交支持物。其它已知的雜交條件為眾所周知的 并且描述在Sambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第三版，Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)中，將該文獻(xiàn)完整地引 入本文作為參考。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及獲自其它生物， 諸如，例如植物的本文所述的固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的同源物。這類本 文所述的固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的同源物可以通過(guò)篩選包括所述同源物 的合適的文庫(kù)獲得，其中使用本發(fā)明的植物固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的核 苷酸序列或其部分或探針進(jìn)行篩選。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序 列(附圖2， SEQ ID No. 1)、編碼區(qū)(附圖3, SEQ ID No. 2)或預(yù)測(cè)
的氨基酸序列(附圖4， SEQ ID No. 3)可以用于使用為檢索同源序列 設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序檢索同源序列。例如，可以用于這類檢索的易于商 購(gòu)的計(jì)算機(jī)程序包括，但不限于可以用于檢索核苷酸序列的BLASTN、 BLASTX和TBLASTX和可以用于檢索氨基酸序列的BLASTP和TBLASTN。 這類計(jì)算機(jī)程序易于在www. ncbi. nlm. nih. gov.網(wǎng)址上進(jìn)入。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化 到植物中。正如本領(lǐng)域中已知的，存在許多可以將基因和基因構(gòu)建體 導(dǎo)入植物的方式，并且已經(jīng)成功地將植物轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)技術(shù)的組合 綜合成了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因作物的有效策略?？梢杂糜诒景l(fā)明的這些方法在 其它文獻(xiàn)中已經(jīng)有描述(Potrykus， 1991 ; Vasil， 1994; Walden和 Wingender， 1995; Songstad等，1995)，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)是眾所周知的。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)疑會(huì)了解到，除通過(guò)真空 滲透(Bechtold等，1993)或創(chuàng)傷接種(Katavic等，1994)對(duì)鼠耳芥屬 進(jìn)行土壤桿菌屬(Jgro6ac&W咖)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化外，同樣還能夠轉(zhuǎn)化其 它植物和作物物種，使用土壤桿菌屬Ti-質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如下胚軸 (DeBlock等，1989)或子葉柄(Moloney等，1989)創(chuàng)傷感染)、粒子轟 擊/生物彈射法(Sanford等，1987; Nehra等，1994; Becker等，1994) 或聚乙二醇輔助的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Rhodes等，1988; Shimamoto等， 1989)法。
正如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是而言顯而易見(jiàn)的并且在其它文獻(xiàn)中所 述的(Meyer， 1995; Dada等，1997)，能夠使用植物啟動(dòng)子指導(dǎo)使用 組成型啟動(dòng)子(例如那些基于CaMV35S的啟動(dòng)子)或通過(guò)使用可以使基 因表達(dá)靶向至特定細(xì)胞、組織(例如用于表達(dá)正在發(fā)育的種子子葉中的 轉(zhuǎn)基因的油菜籽蛋白啟動(dòng)子)、器官(例如根)、至特定的發(fā)育階段或?qū)?br> 達(dá)的增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)。
可以修飾或用于本發(fā)明的固醇酯產(chǎn)生的植物包括，但不限于琉璃 苣(琉璃苣屬的種("orago spp.))、蕓苔、荒麻0 /c!./2[;s co邁/z;^51); 可可豆(可可(f力eo6ro邁a cacao))、玉米(Zea mays)、棉花(草棉屬
的種(Cos^j7^'w/z7spp))、兩節(jié)齊屬的種(Cra邁6espp.)、專多巨花屬 的種(spp.)、亞麻(亞麻屬的種旱金蓮屬的種(Z/z 咖spp.))、 Zes《were/7a和Z^邁"a/7f力es spp. 、Z/力o/a、旱金蓮(rro; aeo/w歷spp.)、 ^a/2W力era spp.、橄欖(木犀欖屬的種(Wes spp.))、棕櫚(油棕 屬的種(f/ae/s spp.))、花生(花生屬的種(Jrac力/s spp.))、油 菜籽、紅花(紅花屬的種(Ca"力a/Z7M spp.))、大豆(大豆屬的種
(67/c/刀e and勿'a spp.)、向曰葵(向曰葵屬的種(Helianthus spp.))、煙草(煙草屬的種(治'co〃a/ a spp.))、斑鳩菊屬的種
(re/720/ /a spp、)、小麥(小麥屬的種(7W〃c咖spp.))、大麥(大 麥屬的種()7ar^咖spp.))、稻米(稻屬的種類(^Twspp.))、燕 麥(燕麥屬的種(J^/2aspp.))、高梁(高梁屬的種("/^"邁spp.))、 黑麥(黑麥屬的種(^eca/e spp.))或禾本科(6^邁/z2eae)中的其它 成員。另外對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以使用本發(fā)明的核苷
發(fā)明的植物固醇酰基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的序列或與之同源的其它序列。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到的，植物中固醇酯類的水平 一般
為種子中總油的約0. 5°/ 。照此，包含本文所述的非天然固醇?；D(zhuǎn)移
酶基因的轉(zhuǎn)基因植物會(huì)產(chǎn)生具有高于0.5%固醇酯類的種子。
在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，構(gòu)建了植物的敲除突變體。通過(guò)使用
已知技術(shù)敲除編碼與本發(fā)明的固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因同源的固醇?；D(zhuǎn)
移酶的植物基因組中的核苷酸序列來(lái)構(gòu)建這些植物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，研究使用編碼固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的本發(fā)明的
核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物和敲除突變體的表達(dá)編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)
化的核香酸序列的效果或在敲除突變體中固醇?；D(zhuǎn)移酶的核普酸序
列表達(dá)的缺乏。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使使用編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的本發(fā)明的核 苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物生長(zhǎng)。收集轉(zhuǎn)基因植物的種子并且提取種子中的 閨醇酯類。提取的固醇酯類用于隨后摻入藥物組合物、營(yíng)養(yǎng)組合物或 食品組合物中。
現(xiàn)在通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步解釋和說(shuō)明本發(fā)明；然而，應(yīng)理解這些實(shí) 施例不一定要限定本發(fā)明并且主要用于說(shuō)明的目的。
實(shí)施例i
通過(guò)RT-PCR,使用可購(gòu)自Invitrogen的用于RT-PCR的 Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(First-Strand Synthesis System)的 商購(gòu)試劑盒克隆相應(yīng)于編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的基因的鼠耳芥屬cDNA， 即At3g51970 (附圖2)。對(duì)cDM進(jìn)行測(cè)序并且插入可購(gòu)自Invitrogen 的栽體pYES2. 1/V5-His-TOPO (附圖1)中，且按照制造商的方案使用。 使用如來(lái)自Invitrogen的pYES2. 1/V5-His-TOP(^手冊(cè)中所述的確立 的小規(guī)模酵母轉(zhuǎn)化程序?qū)⒕哂胁迦氲腁t3g5197G cDNA的載體轉(zhuǎn)化到酵 母are7/are^突變體中。對(duì)酵母的中性脂質(zhì)提取物進(jìn)行正向HPLC分析 以便檢測(cè)酵母中固醇酯類的產(chǎn)量。附圖5的上圖例示了使用At3g51970 轉(zhuǎn)化的酵母中固醇酯類的產(chǎn)量，而如附圖5中下圖中所示缺乏 At3g51970的載體，即pYES2. 1用作缺乏固醇酯類的陰性對(duì)照。
鼠耳芥屬基因At3g51970為新的植物固醇?；D(zhuǎn)移酶基因并且全 長(zhǎng)編碼序列如附圖3中所示。At3g51970的氨基酸序列如附圖4中所 示。
實(shí)施例II.蕓莒屬(Ara^/ca)固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的鑒定
將來(lái)自鼠耳芥屬的核苷酸和推定的氨基酸序列信息用于檢索蕓苔 屬基因組的cDNA和/或表達(dá)的序列標(biāo)記信息以便鑒定來(lái)自其它蕓苔屬 的種，即歐洲油菜(Ara^/cs /3a/7i/s)的固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，At3g51970的基因和/或cDNA用作進(jìn)行核苷酸雜交 的標(biāo)記探針以便鑒定編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的基因。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，按照At3g51970的序列信息產(chǎn)生或生成的多肽用于產(chǎn)生用于固醇 酰基轉(zhuǎn)移酶cDNA的cDM文庫(kù)的抗體。
實(shí)施例III.使用植物固醇?；D(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化植物
轉(zhuǎn)化方案根據(jù)Bechtold等，(1993)所述的方案改編。使鼠耳芥 (々a6油p"i ^a/2'a/ a)生態(tài)型Columbia的植物以10-12林植物/ 盆的密度生長(zhǎng)在4-平方英寸的盆中的濕潤(rùn)土壤中并且用彈性帶固定 就位的尼龍網(wǎng)覆蓋。當(dāng)植物達(dá)到抽苔階段時(shí)，給植物澆水，修剪莒和 一些葉并且如下概述的將植物浸潤(rùn)在土壤桿菌屬混懸液中。
使使用本發(fā)明的固醇?；D(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化的土壤桿菌屬生長(zhǎng)在 25 ml包含濃度為50 pg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基的混懸液中。將 土壤桿菌屬培養(yǎng)2 - 3天。在浸滲前那天，將這種"種子培養(yǎng)物"加入到 400 ml包含50 lig/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。當(dāng)在600 nm處的吸 光度>2.0時(shí)，通過(guò)離心(5， 000 xg，在室溫下在GSA旋轉(zhuǎn)器中10分 鐘)收集細(xì)胞并且重新懸浮于3個(gè)體積的浸滲培養(yǎng)基(1/ xMurashige & Skoog鹽，lxB5維生素，5.0°/。蔗糖，0.044 nM千氨基嘌呤)中至在 600nm處的光密度為0. 8。將土壤桿菌屬混懸液傾入燒杯中并且將盆栽 植物倒置于燒杯中，使得苔和完整鏈座叢被浸沒(méi)。將燒杯放入大的鐘 形玻璃罩中并且使用真空泵抽真空，直到氣泡在葉和莖表面上形成并 且該溶液開(kāi)始產(chǎn)生一點(diǎn)氣泡，然后快速釋放真空。將必要的時(shí)間和壓 力從一種實(shí)驗(yàn)室設(shè)置轉(zhuǎn)向至下一種設(shè)定；但良好的浸滲顯然表現(xiàn)為均 勻的深色的水浸泡的組織。從燒杯中取出盆，將其側(cè)面置于塑料盤中 并且蓋上塑料圓蓋，以便保持濕度。第二天，給植物揭開(kāi)蓋子，使其 處于直立狀態(tài)并且使其在如Katavic等，(1995)所述的連續(xù)光照條件 下在生長(zhǎng)室內(nèi)生長(zhǎng)約4周。當(dāng)長(zhǎng)角果成熟并且干燥時(shí)，收獲種子并且 選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例IV.推定的轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)基因植物)的選擇和轉(zhuǎn)基因植物的生 長(zhǎng)和分析
從真空滲入的轉(zhuǎn)化程序中收獲種子并且通過(guò)在乙醇中處理1分鐘 和在含有50°/ 漂白劑/0. 05% Tween 20TM的無(wú)菌蒸餾水中處理5分鐘滅 菌。用無(wú)菌蒸餾水將種子沖洗幾次。通過(guò)在室溫下使種子重新懸浮于 無(wú)菌0. 1%瓊脂糖中(對(duì)每500-1000粒種子而言約lmL瓊脂糖)并且將
相當(dāng)于約2， 000-4， 000粒種子的體積涂布在150x15 mm選擇平板上 (1/2 xMurashige & Skoog鹽，0. 8%瓊脂，高壓滅菌，冷卻并且加入 lxB5維生素和終濃度為50 iug/mL的卡那霉素)將種子鋪板。在層流 罩中干燥平板，直到當(dāng)使平板傾斜時(shí)種子不再流動(dòng)。使平板在4'C下 和暗處春化兩夜并且將其移至生長(zhǎng)室(如Katavic等，19"所述的條 件)。在7-IO天后，轉(zhuǎn)化體可以清楚地確認(rèn)為深綠色植物，它們帶有 健康的遍布并且進(jìn)入選擇培養(yǎng)基的綠色次生葉和根。
將幼苗移植入土壤，使植物生長(zhǎng)至成熟并且釆集和分析成熟的種 子(如Katavic等，1994所定義的T2代)。使T2種子繁殖。通過(guò)測(cè)定 枝條組織干重和/或通過(guò)對(duì)截止到植物開(kāi)始進(jìn)入生殖(開(kāi)花)階段時(shí)存 在的鏈座葉的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)模式。通過(guò)每天記錄花蕾第
生殖期的開(kāi)始)(如Zhang等，1997所述)。以在種植后指定天(d. a. p.) 時(shí)植物開(kāi)花/抽莒的百分比報(bào)告數(shù)據(jù)。
實(shí)施例V.固醇酯類的分析
使使用本發(fā)明的固醇?；D(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植物生長(zhǎng)至成 熟并且收獲成熟的種子。從使用該固醇?；D(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或 植物中提取中性脂質(zhì)。對(duì)中性脂質(zhì)進(jìn)行正向HPLC分析以便測(cè)定轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞或植物中固醇酯類的產(chǎn)量。
盡管上文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是公認(rèn)并可以理解的 是可以在其中進(jìn)行各種變型，并且所附加權(quán)利要求用于涵蓋所有這類 可以屬于本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的變型。
參考文獻(xiàn)
(將這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容各自引入本文)
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權(quán)利要求
1.編碼與SEQ ID No.2具有至少70％同源性的植物固醇?；D(zhuǎn)移酶的分離或重組核酸分子。
2. 載體，包含權(quán)利要求1的分離或重組核酸分子。
3. 具有使用權(quán)利要求1的分離或重組核酸分子或權(quán)利要求2的栽 體轉(zhuǎn)化的基因組的植物、植物種子或其子代。
4. 權(quán)利要求3的植物、植物種子或其子代，其中該植物、植物種 子或其子代屬于選自如下的種琉璃苣(琉璃苣屬的種(Borago spp.))、蕓荅、荒麻(A/c/z iAy co腳i7/2/s);可可豆(可可(7!6eo6royz7a cacao))、玉米(Zea鵬/s)、棉花(草棉屬的種(^^//7/咖spp ))、 兩節(jié)齊屬的種(Cra邁6e spp.)、萼距花屬的種(spp.)、亞 麻(亞麻屬的種("/ "邁spp. ) )、 Ze^were"a和"咖s/7f力es spp.、 Z7/ o/a、 旱金蓮(旱金蓮屬的種(rro/7aeo/w邁spp.) ) 、 0ea/ c^力era spp.、橄欖(木犀欖屬的種(Wea spp.))、棕櫚(油棕屬的種(f/ae" spp.))、花生(花生屬的種(Jrac力/s spp.))、油菜籽、紅花(紅花 屬的種(Carf力aizws spp.))、大豆(大豆屬的種(f/yc/fle and 5V 7a spp.)、向日葵(向日葵屬的種(i7e//a^A"s spp.))、煙草(煙草屬 的種(治.co〃a/ a spp.))、斑鳩菊屬的種(rei7zo/7/a spp、)、小 麥(小麥屬的種(7>/〃cwz spp.))、大麥(大麥屬的種("or(/eu邁 spp.))、稻米(稻屬的種(Or/wspp.))、燕麥(燕麥屬的種(J^/2S spp.))、高梁(高梁屬的種(&w力咖spp.))、黑麥(黑麥屬的種(Se"/e spp.)); 或禾本科(6^fl邊2'/7e3e)中的其它成員。
5. 權(quán)利要求1的分離或重組核酸分子，其中所述的核酸分子包含 SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2。
6. 使用權(quán)利要求1或5的分離或重組核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
7. 權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
8. 增加細(xì)胞中固醇酯產(chǎn)量的方法，該方法包括 使用編碼固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞；和 在表達(dá)所述固醇?；D(zhuǎn)移酶的條件下使細(xì)胞生長(zhǎng)。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中固醇酰基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQ IDN0: 3 的氨基酸序列至少7 0%同源的氨基酸序列。
10. 權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法，其中所述的核酸分子包含 與SEQ ID NO: 1或2至少70°/。同源的核苷酸序列。
11. 權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括從細(xì)胞中分離 或純化固醇酯類。
12. 權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括將分離或純化的固醇酯類與 食品組合物或藥學(xué)上可接受的栽體混合。
13. 權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括將分離或純化的固醇酯類與 降膽固醇劑混合，所述的降膽固醇劑選自植物固醇類、歐車前、p葡 聚糖、煙酸、guggul提取物、紅曲酵母提取物、甘蔗脂肪醇、大蒜、 胡蘆巴、米糠油、魚油、亞麻籽油、琉璃苣油、其它含co-3-脂肪酸的 油或其任意的組合。
14. 權(quán)利要求8-13中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的細(xì)胞為細(xì)菌細(xì) 胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。
15. 權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括分離固醇?；?轉(zhuǎn)移酶。
16. 分離的植物固醇?；D(zhuǎn)移酶，包含與SEQ ID NO: 3至少70% 同源的氨基酸序列。
17. 具有固醇?；D(zhuǎn)移酶基因的基因組敲除的植物。
18. 鑒定固醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的方法，包括(a) 使用包含疑似編碼固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的植物cDNA的核酸分子 轉(zhuǎn)化固醇酯合成中有缺陷的酵母突變體；和(b) 檢測(cè)所述酵母中的固醇酯形成，其中存在固醇酯類表明所述 的植物cDNA編碼功能性固醇?；D(zhuǎn)移酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及遺傳工程在生產(chǎn)固醇酯類中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，披露了編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的分離或重組核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，披露了使用編碼固醇?；D(zhuǎn)移酶的分離或重組核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。還披露了使用轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生產(chǎn)固醇酯類的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，披露了分離或重組固醇?；D(zhuǎn)移酶。
文檔編號(hào)C12N15/54GK101184844SQ200680014822
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2006年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月30日
發(fā)明者鄒吉濤, 陳啟林 申請(qǐng)人:加拿大國(guó)家研究委員會(huì)