專(zhuān)利名稱(chēng)：：乳腺癌分類(lèi)的相關(guān)材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乳腺癌分類(lèi)的材料和方法。特別地但非排他性地，本發(fā)明涉及基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)的乳腺癌分類(lèi)。這種分類(lèi)為患者預(yù)后(包括預(yù)測(cè)治療響應(yīng))、診斷和治療提供重要信息。
背景技術(shù)：
：基因組范圍繪譜技術(shù)如DNA微列陣和SAGE日益增長(zhǎng)地被研究人員用來(lái)表征多種癌癥類(lèi)型的分子表型。在乳腺癌的研究中，一些小組包括發(fā)明人在內(nèi)，以前已經(jīng)用基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)鑒定多種乳腺腫瘤"分子標(biāo)志物(molecularsignature)，，并界定了臨床相關(guān)的腫瘤亞型(1-5)。盡管就該主題已經(jīng)報(bào)道了這些工作，但大多數(shù)先前的研究通常采用標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)如等級(jí)聚類(lèi)(hierarchicalclustering,HC)和主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)來(lái)界定腫瘤或基因的組。本發(fā)明人以前已經(jīng)證實(shí)，乳腺癌中大部分固有基因表達(dá)的改變可被歸因于屬于不同的"分子亞型"的不同胂瘤(如ER+和ER-，和ERBB2+腫瘤)。盡管這些研究毫無(wú)疑問(wèn)是成功的，但許多這種標(biāo)準(zhǔn)算法同時(shí)也具有廣為人知的局限(6,7)。例如，傳統(tǒng)的HC算法通常根據(jù)基因在所有樣品(胂瘤)數(shù)據(jù)集中的總體表現(xiàn)來(lái)聚類(lèi)基因，實(shí)際上，某些基因可能僅在某些腫瘤亞型中被強(qiáng)烈地調(diào)控，而在其它腫瘤亞型中被弱化至極微小地調(diào)控(1)。另外，標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通常不能界定多種分子標(biāo)志物之間的相關(guān)性，于是不能鑒定它們之間潛在的相互作用。由于這些局限，發(fā)明人認(rèn)為大量的新的生物學(xué)信息仍然深埋于這些大規(guī)模數(shù)據(jù)集中，如果被挖掘出來(lái)，則可以加深我們對(duì)乳腺癌生物學(xué)的了解，致使診斷和治療方面得以改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容近年來(lái)，Barkai和他的同事們描述了一種新的分析方法，標(biāo)志物分析法(signatureanalysis,SA)。該方法;敗具體地i殳計(jì)用于克月良傳統(tǒng)的聚類(lèi)問(wèn)題(6，7)。當(dāng)把此方法用于表達(dá)數(shù)據(jù)集時(shí)，SA可鑒定出被稱(chēng)之為"轉(zhuǎn)錄模塊，，(transcriptionalmodules,TMs)的獨(dú)立單元，在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，這些單元含有被緊密地共調(diào)控的基因的群(6)。大多數(shù)聚類(lèi)方法是同時(shí)優(yōu)化所有的聚類(lèi)來(lái)對(duì)基因進(jìn)行分組，與此相反，SA對(duì)基因的指定依賴(lài)于背景(context-dependent)，并且在不同的TM之間可能存在基因的重疊。在預(yù)測(cè)基因功能和界定生物學(xué)相關(guān)性方面，SA和其變體已被證實(shí)優(yōu)于傳統(tǒng)的聚類(lèi)算法(6，7)。發(fā)明人首次將SA應(yīng)用于一組自制的(inhouse)乳腺癌表達(dá)譜。他們發(fā)現(xiàn)，SA可把腫瘤和基因分類(lèi)為不同的模塊(module)(命名為"腫瘤模塊"，TuM,來(lái)反映SA在腫瘤中的特定應(yīng)用)，許多模塊與先前報(bào)導(dǎo)的乳腺腫瘤標(biāo)志物和分子亞型相一致。例如參見(jiàn)PCT/GB2004/004195,其被引入此處作為參考文獻(xiàn)。除了這種證實(shí)原理的結(jié)果，SA還產(chǎn)生了幾個(gè)令人吃驚的新發(fā)現(xiàn)。第一，SA成功地把以前同源的標(biāo)志物分解到獨(dú)立的模塊，提示前者可能實(shí)際上由多個(gè)相關(guān)但可能又獨(dú)立的生物程序組成。第二，SA在雌激素受體陽(yáng)性(ER+)腫瘤中揭示了新的有關(guān)凋亡的基因標(biāo)志物，它與低組織學(xué)分級(jí)明顯相關(guān)(P<0.001)，但與ER狀態(tài)無(wú)關(guān)。在兩個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中進(jìn)一步證實(shí)了該標(biāo)志物與低組織學(xué)分級(jí)的相關(guān)性，證實(shí)了該標(biāo)志物的可靠性。第三，SA界定了腫瘤模塊之間的相關(guān)性，并意外發(fā)現(xiàn)ERBB2+腫瘤和免疫系統(tǒng)正向相關(guān)，提示兩種組織類(lèi)型之間存在實(shí)質(zhì)性的串話(cross一talk)。這些結(jié)果顯示即使經(jīng)過(guò)在先前的實(shí)質(zhì)性分析后，仍會(huì)有大量的新的生物學(xué)信息被深埋于這些大規(guī)模的數(shù)據(jù)集中，這些信息可以通過(guò)使用適當(dāng)?shù)姆治黾夹g(shù)使之顯現(xiàn)。特別地，發(fā)明人首次采用SA表征乳腺腫瘤表達(dá)i普的數(shù)據(jù)集。除了再次發(fā)現(xiàn)許多以前描述過(guò)的乳腺癌中的基因表達(dá)標(biāo)志物外，SA還鑒定出一個(gè)新的基因表達(dá)標(biāo)志物(TuMl)，該標(biāo)志物顯著地富含于與凋亡有關(guān)的基因中并獨(dú)立于ER狀態(tài)地與低組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。因此，TuMl標(biāo)志物與以前報(bào)導(dǎo)的低組織學(xué)分級(jí)標(biāo)志物不同，所述的以前報(bào)導(dǎo)的低組織學(xué)分極標(biāo)志物傾向于包含與ER狀態(tài)有關(guān)的基因，如GATA3(4)。重要的是，發(fā)明人進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)新的表達(dá)標(biāo)志物可作為乳腺癌激素治療響應(yīng)的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。另外，凋亡相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)顯示這些胂瘤會(huì)對(duì)化療的敏感性增加。相應(yīng)地，整體上本發(fā)明提供了下述材料和方法，所述材料和方法用于使用標(biāo)志物分析法，尤其是迭代標(biāo)志物分析法(iterativesignatureanalysis,ISA)將乳腺腫瘤分類(lèi)為分子亞型和模塊；并且，本發(fā)明還提供了下述材料和方法，所述材料和方法用于基于SA和ISA分析所述腫瘤的表達(dá)鐠給出預(yù)后和/或治療方案。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于獲得差異表達(dá)的基因集的方法。本發(fā)明鑒定基因集，并提供乳腺腫瘤樣品中的這些基因的一部分或全部的表達(dá)水平在給出(assign)供樣患者的預(yù)后和/或治療方案(例如激素治療或化療)中的用途。第一方面，本發(fā)明提供了確定乳腺癌患者的預(yù)后的方法，該方法包括基于所述患者乳腺肺瘤中的基因集(此后稱(chēng)為"預(yù)后集")的表達(dá)水平為該患者給出預(yù)后，其中，所迷預(yù)后集包括示于表2的來(lái)自TuMl的多個(gè)基因。本發(fā)明進(jìn)一步提供了預(yù)后集在確定乳腺癌患者的預(yù)后和/治療中的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了表達(dá)鐠在確定乳腺腫瘤患者的預(yù)后和/或治療中的用途，該表達(dá)譜代表了腫瘤中預(yù)后集(theprognosticset)基因的表達(dá)水平。"預(yù)后，，就其最常規(guī)意義而言是可以定性和定量的。它可以用普通術(shù)語(yǔ)來(lái)表達(dá)，如"好"或"差"的預(yù)后，和/或就臨床可能的結(jié)果而言，如無(wú)病生存期(DFS)，在限定時(shí)期內(nèi)的生存可能性，和/或在限定時(shí)間內(nèi)的遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移可能性。定量測(cè)定預(yù)后一般來(lái)說(shuō)是可能的。此外，尤其是與醫(yī)學(xué)從業(yè)者或醫(yī)學(xué)從業(yè)者之間交流預(yù)后時(shí)，可能用其它預(yù)后指才示來(lái)表達(dá)，^口i若丁、漢指數(shù)評(píng)分(NottinghamPrognosticIndex(NPI)scale)。一般來(lái)說(shuō)，可能會(huì)用傳統(tǒng)的治療方案治療預(yù)后良好的患者?？赡軙?huì)用其它或更強(qiáng)的方案治療不良預(yù)后的腫瘤患者，一般不良預(yù)后的腫瘤患者在轉(zhuǎn)向更強(qiáng)的方案之前無(wú)需等到傳統(tǒng)治療失敗。而且，了解疾病可能的臨床進(jìn)程可以允許患者為將來(lái)做更現(xiàn)實(shí)的計(jì)劃，這也是癌癥治療中重要的社會(huì)性問(wèn)題。如上面提到的，發(fā)明人已經(jīng)確定TuMl表達(dá)標(biāo)志物預(yù)示患者將對(duì)激素和化療反應(yīng)良好。因此，前面提到的預(yù)后集可被用于預(yù)測(cè)治療響應(yīng)，尤其是在激素治療(例如他莫昔芬或?qū)嶋H上任何可選的雌激素受體調(diào)節(jié)劑)或化療中。為避免疑問(wèn)，術(shù)語(yǔ)"確定"并不意味著預(yù)后的絕對(duì)必然性。更貼切地說(shuō)，腫瘤中預(yù)后集的表達(dá)水平通常顯示患者的可能預(yù)后。表達(dá)水平通常用數(shù)字來(lái)表示。因此表達(dá)語(yǔ)通常包括一組數(shù)字，每個(gè)數(shù)字代表了預(yù)后集中一個(gè)基因的表達(dá)水平。本發(fā)明的第一方面的方法可以包括以下的步驟提供代表腫瘤中預(yù)后集基因表達(dá)水平的表達(dá)鐠；和基于表達(dá)謙給出患者預(yù)后和/或治療方案。該提供步驟可以包括從預(yù)存的數(shù)據(jù)集中提取預(yù)后集基因的表達(dá)水平的信息，其中可能還包含其它表達(dá)水平(如代表腫瘤中其它基因的表達(dá)水平的數(shù)據(jù))?；蛘撸梢园▽?shí)驗(yàn)性測(cè)定的表達(dá)水平。該測(cè)定步驟可以包括以下的步驟(a)從患者獲得乳腺腫瘤樣品；(b)測(cè)量樣品中預(yù)后集基因的表達(dá)水平。檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)水平，特別是它出現(xiàn)在表達(dá)謙中，可以以絕對(duì)定量方式，或相對(duì)于此樣品或整個(gè)樣品組中的某些其它因子的表達(dá)水平，舉例如下但不限于此，其它基因的表達(dá)水平，或一組基因(優(yōu)選預(yù)后集以外的基因，但也可為預(yù)后集中的基因)表達(dá)水平的平均值、中位值或模式。例如，基因的表達(dá)可以被測(cè)定或表示為樣品中的多個(gè)基因的平均表達(dá)水平的倍數(shù)或分?jǐn)?shù)。優(yōu)選地，用陽(yáng)性或陰性來(lái)表示在表達(dá)譜中的表達(dá)水平，來(lái)顯示表達(dá)相對(duì)于平均值的增加或減少。在一個(gè)非推薦的實(shí)施例中，數(shù)值集形式的表達(dá)i普信息已被轉(zhuǎn)化為分級(jí)排列的預(yù)后集基因，其中基因按照表達(dá)水平的順序排列，然后各基因的分級(jí)順序被用作分析參數(shù)(替代基因的表達(dá)值)。優(yōu)選地，步驟(b)包含把所述獲自樣品的表達(dá)產(chǎn)物與多種能與表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合的結(jié)合成員相接觸，所述的表達(dá)產(chǎn)物顯示預(yù)后集基因的表達(dá)，其中這樣的結(jié)合可被測(cè)量。一般來(lái)說(shuō)，結(jié)合成員不僅能夠檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的存在，而且能夠檢測(cè)它的相對(duì)豐度(也就是可獲得的產(chǎn)物的量)?？墒褂媚芘c預(yù)后集的基因表達(dá)產(chǎn)物(例如mRNA,相應(yīng)的cDNA或cRNA或表達(dá)的多肽)相結(jié)合的結(jié)合成員來(lái)確定。通過(guò)標(biāo)記該表達(dá)產(chǎn)物或該結(jié)合成員，可以鑒定該表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)量或比例并確定預(yù)后集的表達(dá)譜。結(jié)合成員可以是互補(bǔ)的核酸序列或特異性抗體。該給定預(yù)后的步驟可以通過(guò)比較待測(cè)樣品的表達(dá)譜和其它先前已獲得的鐠來(lái)實(shí)施，后者與已知預(yù)后的和/或以前已經(jīng)確定的具有特定預(yù)后特征的"標(biāo)準(zhǔn)"i瞽相關(guān)?？蓮亩鄠€(gè)具有該預(yù)后的腫瘤的表達(dá)鐠生成特定預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)譜。一般由計(jì)算機(jī)來(lái)完成或由計(jì)算機(jī)輔助完成這種比較。優(yōu)選地，將表達(dá)鐠與不同的已知預(yù)后的已知語(yǔ)或標(biāo)準(zhǔn)譜(優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)譜)進(jìn)行比較。給出的患者預(yù)后是與待測(cè)表達(dá)譜最接近的已知譜或標(biāo)準(zhǔn)譜的預(yù)后。用于比較的標(biāo)準(zhǔn)譜也可以用于給出治療方案。優(yōu)選地，與被分類(lèi)為兩種不同預(yù)后(例如"好"和"壞"，或高或低(更佳的分割點(diǎn)(cut-off)在3.8和4.6之間)的已知譜或標(biāo)準(zhǔn)譜(優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)譜)進(jìn)行比較。已知譜或標(biāo)準(zhǔn)傳產(chǎn)生于已知預(yù)后的樣品，預(yù)后可用任何方便的方法來(lái)確定-或者通過(guò)取材后患者的實(shí)際臨床結(jié)果(即治療響應(yīng))，或者通過(guò)其它預(yù)后技術(shù)，例如組織病理學(xué)技術(shù)，例如利用NPI評(píng)分來(lái)確定。已知語(yǔ)或標(biāo)準(zhǔn)鐠也可來(lái)源于經(jīng)歷特定治療方案(例如激素治療和/或化療)后的樣品，并且其臨床結(jié)果是已知的。更有利的是，使用基因表達(dá)譜來(lái)給出預(yù)后和/或治療方案可以減少或者甚至可以消除給出腫瘤樣病預(yù)后臨床操作上的主觀性本質(zhì)。由于該方法需要在分子水平估測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，優(yōu)選定量地估測(cè)，因此這個(gè)方法提供了更加客觀，進(jìn)而可能更可靠的方法來(lái)給出預(yù)后。預(yù)后集可以將乳腺癌樣品分成離散的模塊，并且進(jìn)而減少或者甚至消除臨床指定預(yù)后中的主觀性分析。而且，可以指定預(yù)后的置信度，因此依據(jù)預(yù)后的"強(qiáng)度，，可以實(shí)現(xiàn)患者治療的知情選擇。預(yù)后集的表達(dá)i普在相似預(yù)后的獨(dú)立樣品之間可能稍微有所不同。不過(guò)，發(fā)明人認(rèn)識(shí)到當(dāng)將構(gòu)成預(yù)后集的特定基因的表達(dá)鐠組合使用以提供腫瘤樣品中的表達(dá)(表達(dá)譜)模式，這種模式就是腫瘤預(yù)后的特征。本發(fā)明的預(yù)后集(TuMl(表2或表2a))是ER+肺瘤的一個(gè)亞群。TuMl表達(dá)標(biāo)志物看來(lái)是ER+低組織學(xué)分級(jí)腫瘤的特異性分子特征，其它與ER狀態(tài)無(wú)關(guān)。使用預(yù)后集從患者獲得的表達(dá)譜不僅為預(yù)后也為可能的治療方案提供了有價(jià)值的信息。治療可以是化療和/或激素治療，例如他莫昔芬或其它可選擇的雌激素受體調(diào)控劑。本發(fā)明的方法可以包括比較乳腺癌治療前后腫瘤樣品中預(yù)后集的表達(dá)水平，以檢測(cè)指示預(yù)后改善或預(yù)后惡化的表達(dá)語(yǔ)的變化。表達(dá)譜代表腫瘤中一組基因的表達(dá)水平。每個(gè)表達(dá)語(yǔ)的基因并不需要完全一致，但每個(gè)表達(dá)譜的基因間必須有充分的重疊，以便將表達(dá)語(yǔ)進(jìn)行比較和分組。出于檢測(cè)目的，可以用現(xiàn)有技術(shù)中的用標(biāo)準(zhǔn)操作對(duì)結(jié)合成員進(jìn)行標(biāo)記?；蛘?，可以在從待檢樣品中分離后標(biāo)記表達(dá)產(chǎn)物。檢測(cè)的優(yōu)選方式是熒光標(biāo)記，可用光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。其它檢測(cè)方法包括電信號(hào)。例如，Motorola(Pasadena，California)電子傳感器系統(tǒng)有2個(gè)探針，一個(gè)是自由漂浮的"捕獲探針"，一個(gè)是附著在固定相表面(其作為電板表面而加倍)上的"信號(hào)探針，，。兩個(gè)探針都用作表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員。當(dāng)結(jié)合發(fā)生時(shí)，使得兩個(gè)探針互相緊緊密接近，結(jié)果導(dǎo)致可被檢測(cè)的電信號(hào)的產(chǎn)生。然而，近年來(lái)出現(xiàn)了許多更新的技術(shù)-利用"無(wú)標(biāo)記"技術(shù)來(lái)定量，例:i口Xagros(MountainView,California)戶斤生成的這些。引物和/或擴(kuò)增的核酸可以不帶任何標(biāo)記。通過(guò)測(cè)量?jī)蓷l引物結(jié)合在目的表達(dá)產(chǎn)物上隨后被聚合酶擴(kuò)增而引起的電阻改變來(lái)實(shí)現(xiàn)定量。如上迷討論的，結(jié)合成員可以是用于PCR的寡聚核苷酸引物(例如，mulU-plexedPCR),來(lái)特異地?cái)U(kuò)增遺傳標(biāo)識(shí)的表達(dá)產(chǎn)物成員。然后將產(chǎn)物在膠上進(jìn)行分析。不過(guò)，優(yōu)選地，結(jié)合成員是固定于固相支持物上的單個(gè)核酸探針或抗體。之后表達(dá)產(chǎn)物可以從固相支持物中通過(guò)，由此使它們與結(jié)合成員相接觸。固相支持物可以是玻璃表面，例如顯微玻片、珠子(lynx)或光纖。是珠子的情況下，每個(gè)結(jié)合成員可被固定于各個(gè)珠子上，然后與溶液中的表達(dá)產(chǎn)物相接觸?，F(xiàn)有技術(shù)中存在多種用于檢測(cè)特定基因集的表達(dá)語(yǔ)的方法，這些方法也可以用于本發(fā)明中，例如已知的基于珠子的技術(shù)(lynx)或分子條碼技術(shù)(Surromed)。在這些例子中，每個(gè)結(jié)合成員附著于珠子或"條碼"上，它們各自是可讀的，并且是自由浮動(dòng)的，很容易與表達(dá)產(chǎn)物相接觸。結(jié)合成員與表達(dá)產(chǎn)物(靶標(biāo))的結(jié)合在溶液中實(shí)現(xiàn)，之后標(biāo)記的磁珠或條碼通過(guò)儀器(如流式細(xì)胞儀)并讀取信息。一個(gè)更為人知的鐠檢測(cè)表達(dá)的方法是采用Illumina(SanDiego,California)開(kāi)發(fā)的叫作光纖的裝置。在這個(gè)方法中，每個(gè)結(jié)合成員被附著于光纖電纜末端一個(gè)特異的"地址"上。結(jié)合成員與表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合可以引起熒光的改變，這種改變可被光纖電纜另一端的裝置所讀取。在第二個(gè)方面，本發(fā)明為乳腺腫瘤樣品給出預(yù)后和/或治療方案提供了裝置，優(yōu)選微列陣。該裝置包含附著有(attached)多種結(jié)合成員的固相支持物，每個(gè)結(jié)合成員可以特異地結(jié)合預(yù)后集中的一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選地，附著于固相支持物上的結(jié)合成員可以特異地和獨(dú)立地與標(biāo)識(shí)在表2中的至少5個(gè)基因，更優(yōu)選地，至少I(mǎi)O個(gè)基因或至少15個(gè)基因，和最優(yōu)選的是，至少20個(gè)或30個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合。附著于固相支持物上的結(jié)合成員可以特異地與標(biāo)識(shí)在表2中的20到30個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，附著于固相支持物上的結(jié)合成員可以特異和獨(dú)立地與標(biāo)識(shí)在表2中的所有基因的表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合。支持物可以僅附著特異地和獨(dú)立地與標(biāo)識(shí)在表2中的基因或來(lái)自表2的預(yù)后集基因的表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合的結(jié)合成員。優(yōu)選地，結(jié)合成員是核酸序列，裝置為核酸微列陣。表2中列出了基因在Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)中的Unigene索引號(hào)。每個(gè)基因的序列可從國(guó)立衛(wèi)生研究院(NationalInstituteofHealth,NIH)Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到(http://www,ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=unigene)D表2a按重要順序列出了表2中的基因。因此，對(duì)本發(fā)明所有方面的內(nèi)容，優(yōu)選選自表2的基因集包含至少列在表2a中的前5個(gè)基因，更優(yōu)選列于表2a中的至少前6、7、8、10、12、15、17、20、25和30個(gè)基因。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因集包含至少10個(gè)選自表2的基因，其中這些基因中的至少5個(gè)是表2a所列基因的前5個(gè)。基因集中可以包含選自表2的至少15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)或30個(gè)基因，這些基因中的至少5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20或25個(gè)是列于表2a中的前5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)或25個(gè)。而且，Affymetrix(SantaClara,California)(www,affymetrix.com)為所有的基因提供了探針組的樣品，包括探針序列(即寡聚核苷酸序列形式的結(jié)合成員)，當(dāng)將其用在固相支持物上時(shí)，可檢測(cè)耙基因的表達(dá)。典型地，把高密度的核酸序列(通常是cDM或寡核苷酸)固定于非常小的固相支持物的離散區(qū)域或點(diǎn)陣上。固相支持物通常是底物包被的顯微玻片或?yàn)V膜(即"芯片")。核酸序列被安置(或打印)于包被的固相支持物上，這個(gè)過(guò)程通常由機(jī)器人體系完成，然后被固化或固定在支持物上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)源于樣品中的表達(dá)產(chǎn)物被標(biāo)記，典型地使用焚光標(biāo)記，然后與固化的核酸序列相接觸。雜交后，用檢測(cè)儀(如高分辨率激光掃描儀)檢測(cè)熒光標(biāo)記。另外一種方法，表達(dá)產(chǎn)物可以用非熒光標(biāo)記，如生物素。雜交后，微列陣可被與第一個(gè)非熒光標(biāo)記物(例如熒光標(biāo)記的鏈親和素，其結(jié)合生物素)結(jié)合的熒光染料"染色"。不過(guò)，如前面的討論的表達(dá)產(chǎn)物也可以無(wú)標(biāo)記。指示基因表達(dá)模式(表達(dá)模式或表達(dá)譜)的結(jié)合譜是由數(shù)字圖像軟件通過(guò)分析各離散點(diǎn)發(fā)射的信號(hào)獲得的。為了進(jìn)行差異分析，可以將實(shí)驗(yàn)樣品的基因表達(dá)模式與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)譜(即例如來(lái)源于已知好或差預(yù)后的組織樣品，或已知NPI值，或已知NPI評(píng)分范圍的組織樣品的表達(dá)譜)進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)譜可以來(lái)源于一個(gè)或多個(gè)先前已被判斷為例如"差"或"好"的特定預(yù)后特征的表達(dá)鐠，和/或特定NPI范圍如高和/或低NPI特征的表達(dá)諳，和/或一個(gè)或多個(gè)NPI值或一個(gè)或多個(gè)值范圍的特征的表達(dá)譜。標(biāo)準(zhǔn)謙可以來(lái)自于一個(gè)或多個(gè)以前已被判斷為具有特定NPI值或NPI范圍(或?qū)︻A(yù)后評(píng)分的其它定義值)特征的表達(dá)i普。該標(biāo)準(zhǔn)可以包括正常樣品的表達(dá)語(yǔ)特征。這些這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)鐠可以被可讀取地作為數(shù)據(jù)庫(kù)的一部分保存在數(shù)據(jù)栽體上。大多數(shù)微列陣?yán)靡粋€(gè)或兩個(gè)熒光團(tuán)。對(duì)于雙色列陣而言，最常用的熒光團(tuán)是Cy3(綠光通道激發(fā))和Cy5(紅光通道激發(fā))。微列陣圖像分析的目的就是從每個(gè)表達(dá)產(chǎn)物中提取雜交信號(hào)。對(duì)于單色列陣而言，信號(hào)是測(cè)定的給出靶標(biāo)(尤其是與單個(gè)樣品雜交的列陣)的絕對(duì)強(qiáng)度。對(duì)于雙色列陣而言，信號(hào)是測(cè)定的不同熒光標(biāo)記的兩個(gè)表達(dá)產(chǎn)物的比例(例如，樣品和對(duì)照(對(duì)照是已知的"參照"))。本發(fā)明中的裝置優(yōu)選包括多個(gè)離散點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)含有一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，并且每個(gè)點(diǎn)代表了用于與選自表2的基因的表達(dá)產(chǎn)物的不同的結(jié)合成員。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微列陣包含用于表2提供的每個(gè)基因的點(diǎn)。每個(gè)點(diǎn)將包含多個(gè)同樣的寡核苷酸，每個(gè)該寡核苷酸可與表2中提供的一個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物如mRNA或cDNA相結(jié)合。優(yōu)選地，每個(gè)基因由多個(gè)不同的寡核苷酸來(lái)代表。本發(fā)明的笫三方面，提供了用于為乳腺癌患者給出預(yù)后和/或治療方案的試劑盒。所述試劑盒包含可以與預(yù)后集的基因表達(dá)產(chǎn)物特異性地結(jié)合的多個(gè)結(jié)合成員及檢測(cè)試劑。該試劑盒可以包括數(shù)據(jù)分析工具，優(yōu)選地以計(jì)算機(jī)程序的形式。該數(shù)據(jù)分析工具優(yōu)選包含適合用于區(qū)分不同預(yù)后的腫瘤的表達(dá)鐠的算法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑盒包括本發(fā)明的第二方面的裝置。優(yōu)選地，在該試劑盒中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合成員(抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或核酸序列，如寡核苷酸)固定于一個(gè)或多個(gè)固相支持物上，例如用于微列陣或光纖分析的單個(gè)支持物，或如磁珠這樣的多個(gè)支持物。檢測(cè)工具優(yōu)選用于對(duì)待檢樣品的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記的標(biāo)記(放射活性或染料，如熒光)。該試劑盒也可以包含用于檢測(cè)和分析待檢樣品表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合鐠的試劑?；蛘撸Y(jié)合成員可以是能與標(biāo)識(shí)在表2中的基因的表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合的核苷酸引物，因此可以用PCR的方法擴(kuò)增它們。引物可進(jìn)一步包含檢測(cè)工具，也就是標(biāo)記其可被用鑒定擴(kuò)增的序列及它們相對(duì)于其它擴(kuò)增序列的豐度。乳腺癌樣品可獲自切除的乳腺組織活檢或細(xì)針穿刺抽取。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了制作乳腺腫瘤樣品的核酸表達(dá)鐠的方法，包括以下步驟(a)從所述乳腺腫瘤樣品分離表達(dá)產(chǎn)物；(b)鑒定預(yù)后集基因的表達(dá)水平；和(c)從所述乳腺腫瘤樣品的表達(dá)水平制作表達(dá)鐠。該表達(dá)鐠可被加入基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。該方法可以進(jìn)一步包括與第二表達(dá)譜(或多個(gè)第二表達(dá)譜)進(jìn)行比較的步驟。第二表達(dá)譜可以使用基本上相同的預(yù)后集從第二乳腺腫瘤樣品制作而成，其中第二樣品的預(yù)后是已被給出或確定的。第二表達(dá)語(yǔ)可以是特定預(yù)后特征的標(biāo)準(zhǔn)鐠，如"好"預(yù)后或"差"預(yù)后，或高NPI或低NPI，或至少一個(gè)特定的NPI值或至少一個(gè)范圍NPI值的預(yù)后?；蛘?，標(biāo)準(zhǔn)語(yǔ)可以指示特定的治療方案。優(yōu)選預(yù)后是以預(yù)后測(cè)定的形式的，優(yōu)選是按臨床上接受的預(yù)后分類(lèi)體系如NPI。預(yù)后可從基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)再一次預(yù)測(cè)，所述基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于臨床技術(shù)如組織病理技術(shù)，或基于笫二表達(dá)謙供樣患者的疾病結(jié)果來(lái)回顧性的給出預(yù)后。利用預(yù)后集的知識(shí)，可以設(shè)計(jì)出許多確定特定待檢樣品中的基因表達(dá)模式或譜的方法。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以從樣品分離表達(dá)的核酸(RNA、raRM)。對(duì)應(yīng)于表2所給出的遺傳標(biāo)識(shí)的基因成員的表達(dá)的核酸序列可被使用特異于該表達(dá)序列的核苷酸引物在PCR中擴(kuò)增。如果分離的表達(dá)的核酸是mRNA，則可使用標(biāo)準(zhǔn)方法將其轉(zhuǎn)化成cDNA以進(jìn)^f亍PCR反應(yīng)。引物可以很方便地向擴(kuò)增的核酸中引入標(biāo)記。由此其可被鑒定。理想情況下，標(biāo)記可以指示擴(kuò)增事件后該核酸序列存在的相對(duì)量或比例，借此可以反映在初始檢測(cè)樣品中存在的相對(duì)量或比例。例如，如果標(biāo)記是熒光團(tuán)或有放射活性，信號(hào)的強(qiáng)度可以指示表達(dá)的序列的相對(duì)含量/比例甚至絕對(duì)量。每個(gè)遺傳標(biāo)識(shí)的表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)量或比例將建立待測(cè)樣品的特定表達(dá)譜。檢測(cè)表達(dá)水平的基因數(shù)目越多，表達(dá)諳分類(lèi)越可靠。已知的微列陣和芯片技術(shù)允許利用大量的結(jié)合成員。因此，更優(yōu)選的方法是代表表2全部基因的結(jié)合成員。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以省略這些基因中的一部分，不過(guò)仍以可靠而且統(tǒng)計(jì)學(xué)上精確的方式來(lái)實(shí)施該方法。在本發(fā)明的任何一方面的預(yù)后集包含所有或幾乎大部分表2中的基因或由所有或幾乎大部分表2中的基因構(gòu)成。在本發(fā)明的不同方面之間，預(yù)后集基因在內(nèi)容和數(shù)量上可以有所不同。預(yù)后集可以包括至少5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)或全部表2中的基因。預(yù)后集的提供可使診斷工具(diagnostictool)(如核酸微列陣)按需定制，并用于腫瘤的預(yù)測(cè)、診斷和分型(subtype)。而且，這樣的診斷工具可以與程序化的計(jì)算機(jī)結(jié)合使用來(lái)確定用診斷工具(如微列陣)獲得的表達(dá)譜，并進(jìn)行比較。如前面所談?wù)摰?，與"標(biāo)準(zhǔn)"表達(dá)譜或已知預(yù)后的表達(dá)鐠數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。在此過(guò)程中，計(jì)算機(jī)不僅可以為用戶提供用于診斷患者胂瘤存在或類(lèi)型的信息，同時(shí)還可以通過(guò)確定"標(biāo)準(zhǔn)，，表達(dá)譜來(lái)進(jìn)一步獲得表達(dá)譜及更新它自身的數(shù)據(jù)庫(kù)。本發(fā)明首次使用特制的芯片(微列陣)，它包含與預(yù)后集相對(duì)應(yīng)的探針。列陣的精確物理結(jié)構(gòu)可以不同，并且按從附著于2維固相基板上的寡核苷酸探針到自由浮動(dòng)(free-floating)的每個(gè)都帶有獨(dú)特標(biāo)記(例如"條碼")的探針排列。檢索已知預(yù)后的表達(dá)語(yǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)可以采用直接或間接的方式。"直接"的方式是用患者的表達(dá)譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中其它個(gè)體的表達(dá)傳相比較，來(lái)確定與哪個(gè)表達(dá)謙(因此與其預(yù)后和/或治療方案)給予最佳匹配?，F(xiàn)在以示例的方式同時(shí)參考下面的附圖對(duì)本專(zhuān)利的內(nèi)容和實(shí)施方案進(jìn)行闡述。更多方面的內(nèi)容和實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。本文中所有提到的文獻(xiàn)都引作參考文獻(xiàn)方案。圖1:乳腺癌的肺瘤模式A)通過(guò)ISA以不同的分辨率水平鑒定的腫瘤模塊(TuM)的模式樹(shù)。每個(gè)節(jié)點(diǎn)(實(shí)心藍(lán)色方形)代表轉(zhuǎn)錄模塊，分支代表一定閾值范圍內(nèi)起源于同一根的TuM。B)腫瘤模塊內(nèi)基因表達(dá)模式的全局圖。每行代表一個(gè)基因且每列代表一個(gè)腫瘤。8個(gè)對(duì)角塊(diagonalblock)(由黃色格子分開(kāi))表示圖1A中的8個(gè)模塊(基因閾值為3.0)。8個(gè)模塊的圖例列于圖中。非對(duì)角塊顯示一個(gè)模塊中的基因如何在另一個(gè)模塊中發(fā)揮作用。紅色箭頭顯示在不同模塊之間共同出現(xiàn)的基因和腫瘤的示例。圖2:兩個(gè)獨(dú)立患者群體疾病結(jié)果的Kaplan-Meier分析。A)來(lái)自Stanford數(shù)據(jù)集的82個(gè)ER+患者的總體生存率。B)來(lái)自Rosetta數(shù)據(jù)集的71個(gè)ER十患者的無(wú)轉(zhuǎn)移生存率。綠線表示高表達(dá)TuMl基因的ER陽(yáng)性腫瘤患者，粉色線表示所有其它ER+的腫瘤患者。圖3:不同模塊的腫瘤標(biāo)志物間的關(guān)系。每行代表一個(gè)腫瘤，線的顏色根據(jù)指定給胂瘤的分?jǐn)?shù)變化(顏色條)。A)8個(gè)TuM間共調(diào)控的總體視圖。對(duì)角框是相應(yīng)腫瘤的模塊。對(duì)角框內(nèi)的線表示在其它模塊中共有該腫瘤。比較對(duì)角框和非對(duì)角框內(nèi)的線條的顏色揭示兩個(gè)模塊的相關(guān)程度。TuMl，TuM2和TuM3用藍(lán)色方形加亮。B)TuMl(低分級(jí))和TuM7(細(xì)胞增殖)間的相關(guān)性；和C)TuM4(免疫反應(yīng))和TuM8(ERBB2+)肺瘤的相關(guān)性。圖4:迭代標(biāo)志物算法(ISA)的流程圖圖5:TuM7和NPI-ES之間的重疊基因圖6:轉(zhuǎn)錄模塊的腫瘤分?jǐn)?shù)。通過(guò)腫瘤分?jǐn)?shù)分類(lèi)腫瘤。Y軸為腫瘤的分?jǐn)?shù)，X軸為腫瘤指數(shù)，其在不同模塊之間有所變化。圖7:不同乳腺癌數(shù)據(jù)集中的分級(jí)和ER狀態(tài)的分布。深色線為分級(jí)；淺色線為ER狀態(tài)。Y軸表示分級(jí)(l-3)。ER陽(yáng)性指定為1，同時(shí)ER陰性為O，樣品分別按分級(jí)和ER狀態(tài)分類(lèi)。圖8:顯示了Stanford數(shù)據(jù)集(僅為ER陽(yáng)性的腫瘤)圖9:Rosetta數(shù)據(jù)集(僅為ER陽(yáng)性的腫瘤)圖10:基因集富集分析。按對(duì)照/處理過(guò)的細(xì)胞系的信噪比(S2N)排列基因。信噪比(分級(jí))越高，處理過(guò)的細(xì)胞系與對(duì)照相比表達(dá)值越低。圖11:基于TuMl基因表達(dá)鐠對(duì)不同的細(xì)胞系進(jìn)行層次聚類(lèi)。該分析中使用皮爾森相關(guān)值進(jìn)行平均連鎖層次聚類(lèi)。以黃色方形加亮MCF7中TuMl基因的表達(dá)。圖12:對(duì)以死亡風(fēng)險(xiǎn)因素(Uppsala和Stanford)或轉(zhuǎn)移(Ma)作為第一事件的多變分析-還可見(jiàn)表6。圖13A:MCF-7細(xì)胞中沉默RLN2基因用代表RLN2基因的3個(gè)不同區(qū)域的特異性siRM轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，7U、時(shí)時(shí)分析RLN2的mRNA的量。在他莫昔芬響應(yīng)率檢測(cè)中組合使用有效的siRNA(C)和siRM(B)抑制(knockdown)RLN2的表達(dá)。圖13B:流式細(xì)胞分析沉默RLN2基因的MCF-7細(xì)胞對(duì)他莫昔芬處理的敏感性。用1^M他莫昔芬或等量的載體處理RLN2沉默的細(xì)胞和對(duì)照組的細(xì)胞48小時(shí)，隨后撤消處理。72小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀對(duì)Annexin-V染色陽(yáng)性的細(xì)胞打分，檢測(cè)他莫昔芬誘導(dǎo)的凋亡。材料和方法乳腺組織和臨床信息經(jīng)新加坡國(guó)家癌癥中心(NCC)組織儲(chǔ)藏處和倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，共從NCC組織儲(chǔ)藏處獲得96個(gè)侵入性乳腺癌樣品。作鐠的樣品至少包含50%的腫瘤組織。對(duì)樣品收集、存檔和肺瘤組織學(xué)評(píng)價(jià)，包括技術(shù)和參數(shù)的詳細(xì)描述以前已經(jīng)報(bào)道過(guò)(5)。樣品制備和微列陣雜交用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)從纟且織提取RNA,并且按照廠商的說(shuō)明書(shū)使用U133A基因芯片加工以用于與Affymetrix基因芯片(AffymetrixInc.SantaClara，CA)雜交。數(shù)據(jù)加工用GeneDataRefiner(Genedata，Basel,瑞士)控制原始基因芯片掃描質(zhì)量，并將數(shù)據(jù)存入中央數(shù)據(jù)保存裝置。通過(guò)去掉所有樣品中都不表達(dá)的基因(即"A"calls)來(lái)完成預(yù)加工，把余下的基因(9116個(gè)探針)做log2轉(zhuǎn)化，并用樣品的中位平均數(shù)進(jìn)行歸一化。標(biāo)志物算法(SignatureAlgorithm,SA)和迭代標(biāo)志物算法(IterativeSignatureAlgorithm,ISA)文獻(xiàn)6中詳細(xì)地提供了SA方法，所述文獻(xiàn)引入此處作為參考。筒而言之，SA操作如下l)選擇一組"輸入基因，，輸入SA算法中；2)SA選擇出這樣的腫瘤，該腫瘤中"輸入基因"平均表達(dá)高于預(yù)設(shè)閾值；總體表達(dá)鐠進(jìn)行檢測(cè)，以選出其它平均表達(dá)水平高于基因闊值的基因。SA的輸出是"腫瘤模塊"(TuM)，包含在特定腫瘤組中表達(dá)水平高于特定基因閾值的基因集。發(fā)明人應(yīng)用了SA的擴(kuò)展，迭代標(biāo)志物算法(ISA)，它利用大量的隨機(jī)基因集作為初始的輸入基因，隨后通過(guò)SA多輪迭代來(lái)精煉TuM(7)。由于輸入基因是隨機(jī)的，ISA并不需要先前的知識(shí)，并因此形成了一種完全未監(jiān)控的分析方法?；谙惹暗膱?bào)道，選擇基因閾值3.G為最佳閾值進(jìn)行進(jìn)一步的深入分析(6)。每個(gè)TuM中的基因列表包含在"補(bǔ)充信息"中。腫瘤模塊間的相關(guān)性按(6)所述進(jìn)行計(jì)算。SA軟件可在http://barkai-serv.weizmann.ac.i1/GroupPage/software.htm獲得。TuM和臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)用卡方檢驗(yàn)(Chi-squaretest)來(lái)計(jì)算每個(gè)TuM與下列臨床參數(shù)的關(guān)聯(lián)患者年齡，淋巴結(jié)(LN)狀態(tài)，雌激素受體(ER)狀態(tài)，黃體酮受體(PR)狀態(tài)，肺瘤大小，組織學(xué)分級(jí)及淋巴血管侵襲(LVI)。還用超幾何概率密度函數(shù)分析法來(lái)證實(shí)每種相關(guān)的顯著性。技術(shù)人乳房組織獲自新加坡國(guó)家癌癥中心(NCC)組織儲(chǔ)藏庫(kù)，在獲得NCC儲(chǔ)藏庫(kù)和倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)后。樣品在手術(shù)室手術(shù)切取后立即大體上分割，在液氮中快速凍存。樣品沒(méi)有經(jīng)過(guò)術(shù)前化療處理。為了腫瘤和腋前線淋巴結(jié)的組織學(xué)鑒定，使用福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤組織來(lái)確定腫瘤亞型(WHO分類(lèi))、組織學(xué)分級(jí)及淋巴血管侵襲。僅基于侵襲組分用肉眼評(píng)定腫瘤大小，并用顯微鏡證實(shí)。對(duì)于小腫瘤，在這種組織切片上測(cè)量大小。ER狀態(tài)用免疫組化測(cè)定，陽(yáng)性結(jié)果是MO%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)至少+2強(qiáng)度的核反應(yīng)性。對(duì)于ERBB2免疫組化，采用Dako分類(lèi)體系，O分和1+被認(rèn)為是陰性，2+和3+是陽(yáng)性。當(dāng)良性乳房上皮是免疫反應(yīng)的，則得出不明確結(jié)論。作語(yǔ)的樣品至少包含50%的腫瘤內(nèi)容。ISA工作方案迭代標(biāo)志物算法(ISA)是可被用作總體解析基因表達(dá)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)標(biāo)志物算法的擴(kuò)展。一般來(lái)說(shuō)，ISA是一個(gè)自反饋體系，并如下應(yīng)用1)產(chǎn)生輸入種子的大(充足的)樣品；2)通過(guò)多迭代確定對(duì)應(yīng)于每個(gè)種子的強(qiáng)壯模塊(與SA相似)。圖4是ISA的圖示。ISA詳細(xì)的技術(shù)報(bào)告可在Bergmannetal.2003Mar;67(3Pt1):031902中找到。所用參數(shù)如下所示。每個(gè)參數(shù)的定義可在http://barkai-serv.weizmann.ac.i1/GroupPage/software.htm.找到。ISA的春數(shù)設(shè)定條件閾值基因閾值范圍最小重現(xiàn)最小無(wú)基因隨機(jī)大小i.a,412105,10:1:20分級(jí)和ER狀態(tài)的相關(guān)性為研究分級(jí)和ER狀態(tài)的關(guān)系，發(fā)明人檢測(cè)了4個(gè)乳腺癌數(shù)據(jù)集1)Standford數(shù)據(jù)集(參考文獻(xiàn)3);2)NCI數(shù)據(jù)集(參考文獻(xiàn)4);3)Rosetta數(shù)據(jù)集(參考文獻(xiàn)10);和4)他們的自制數(shù)據(jù)集。圖7顯示每個(gè)乳腺腫瘤的分級(jí)和ER狀態(tài)。ER陰性腫瘤是高分級(jí)的傾向是明顯的。細(xì)胞培養(yǎng)和他莫昔芬處理從美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心(AmericanTypeCultureCollectioncenter,Manassas,VA)獲得MCF-7乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞在Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco，GrandIsland,NY)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基添加有10%胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素和2mML-谷氨酰胺。在他莫昔芬處理前，細(xì)胞用PBS洗3次，并在加有5%葡聚糖炭脫色的FBS(HyCloneLaboratories,Pittsburgh,PA)的無(wú)酚紅DMEM中培養(yǎng)24小時(shí)。隨后細(xì)胞用IOjiM他莫昔芬(Sigma)處理細(xì)胞，在第48小時(shí)收獲。對(duì)照培養(yǎng)用相等體積的溶媒處理(0.1%乙醇)?；蚣患治鍪褂肎SEA來(lái)回答腫瘤模塊基因的表達(dá)是否可被他莫昔芬處理所影響。4個(gè)對(duì)照樣品和2個(gè)處理后(見(jiàn)材料和方法)樣品用于GSEA分析。3個(gè)模塊(TuM4，5和6)由于在MCF7細(xì)胞系中表達(dá)的基因數(shù)目不足(<10)而被濾掉。TuMl是唯一表現(xiàn)出與對(duì)照樣品顯著相關(guān)的模塊(即，在處理的MCF7細(xì)胞系中下調(diào)；見(jiàn)表和圖10)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>siRNA介導(dǎo)的RLN2抑制及他莫昔芬誘導(dǎo)的凋亡的分析MCF-7細(xì)胞(ATCC)在添加有10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100U/raL鏈霉素和2mML-谷氨酰胺的DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，LifeTechnologies)，向MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染20nMRLN2特異性siRM(Ambion)或?qū)φ誷iRNA。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在加有5%DCC的DMEM中培養(yǎng)24小時(shí)，并用l)iM他莫昔芬或溶媒處理。48小時(shí)后終止處理，并在加有5%DCC的DMEM中培養(yǎng)72小時(shí)。RLN2沉默和對(duì)照細(xì)胞用lnM他莫昔芬或等體積溶媒處理48小時(shí)候，并隨后通過(guò)將培養(yǎng)基更換為加有5%DCC的DMEM來(lái)撤消處理。72小時(shí)后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用Annexin-V-熒光素和碘化丙叮按廠商(Roche)推薦的方法染色，并用流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter)分析。Annexin-V陽(yáng)性的細(xì)胞群被記分，以表示凋亡細(xì)胞百分率。在第72小時(shí)從對(duì)照和RLN2沉默的MCF-7細(xì)胞中分離RNA。4吏用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶通過(guò)oligo-T引發(fā)對(duì)等量的RNA進(jìn)4亍逆轉(zhuǎn)錄，并使用RLN2特異性寡核苷酸進(jìn)行RT-PCR來(lái)評(píng)價(jià)RLN2沉默的效率。(用于RT-PCR的引物RLN2-F:TGCCATCCTTCATCAACAAA，RLN2-R:CAACCAACATGGCAACATTT，肌動(dòng)蛋白-F:CGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG,肌動(dòng)蛋白-R:TGATCTCCTTCTGCATCCTGTCGG)。結(jié)果鑒定和解析乳腺癌中的TuM發(fā)明人把ISA(基礎(chǔ)SA的擴(kuò)展)應(yīng)用到一組96個(gè)乳腺癌基因表達(dá)譜中。ISA中關(guān)鍵的參數(shù)是"基因閾值"，該參數(shù)反映共調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)性的度量值-基因閾值越高，每個(gè)TuM中個(gè)別基因的相關(guān)性越緊密。當(dāng)在一系列不同的基因閣值條件下工作時(shí)，ISA會(huì)產(chǎn)生不同分辨率的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的模塊分解(7)。圖la用模式樹(shù)的形式對(duì)這一概念進(jìn)行說(shuō)明。低基因閾值下，很少的TuM被最初鑒定出來(lái)，其中每個(gè)TuM都由大量松散相關(guān)的腫瘤和基因組成。更高的分辨率條件下，表達(dá)數(shù)據(jù)被解析成大量TuM，現(xiàn)在每個(gè)TuM包含較少的一組緊密相關(guān)的胂瘤和基因?；蜷撝禐?.0時(shí)，產(chǎn)生了8個(gè)TuM,其中3個(gè)分解自同一分支。值得注意的是，ISA鑒定的TuM與傳統(tǒng)的等級(jí)聚類(lèi)得到的聚類(lèi)不同-和后者不同，不同的TuM可能具有相同的基因和腫瘤(圖lb的箭頭)。發(fā)明人將8個(gè)TuM的基因內(nèi)容與先前的描述乳腺癌不同的分子標(biāo)志物的報(bào)道進(jìn)行比較。前3個(gè)模塊(TuMl,TuM2和TuM3)共同衍生自一個(gè)更大的模塊，該模塊包含幾個(gè)先前報(bào)道的在ER+腫瘤中高表達(dá)的基因，如ESR1，GATA3和BCL2(1-4)。盡管這個(gè)更大的模塊在先前的其它研究中被當(dāng)作同源的來(lái)處理，但它被成功分解為不同的較小單元，提示更大的模塊實(shí)際上包含多個(gè)不同的，并可能獨(dú)立起作用生物學(xué)程序。特別的是，30個(gè)基因的TuM2和38個(gè)基因的TuM3有大量不同的基因重疊(約50%)，這些基因已知被ER如BCL2和STC2所調(diào)控。相反，在34個(gè)基因的TuMl模塊中，>80%的基因沒(méi)有在TuM2或TuM3中出現(xiàn)(在下面章節(jié)中有對(duì)TuMl更為詳細(xì)的描述)。TuM4-8也與許多先前定義的乳腺癌基因表達(dá)標(biāo)志物有關(guān)TuM4包括大量參與免疫功能的基因，包括免疫球蛋白基因，T細(xì)胞受體亞單位和TNF家族成員(1);而TuM5包含F(xiàn)BLN1、SPARC和不同的膠原異構(gòu)體，可能代表了基質(zhì)細(xì)胞群的貢獻(xiàn)(1)。TuM6包括角蛋白5，角蛋白17和SFRP1，與基質(zhì)/ER-分子亞型的乳腺癌表達(dá)標(biāo)志物相一致(1-4)。并且TuM7包含顯著數(shù)量(p<10—4)的屬于NPI-ES表達(dá)標(biāo)志物的基因，所述標(biāo)志物以前被確定為諾丁漢評(píng)分的分子代表(8)，另外還包括幾個(gè)參與細(xì)胞增殖的基因(如MAD2L1，CDC2)。TuM7包含85個(gè)基因，NPI-ES包含62個(gè)基因。在兩個(gè)基因集中16個(gè)基因是共有的。為評(píng)價(jià)這種重疊的顯著性，發(fā)明人按下列方式進(jìn)行了隨機(jī)排列隨機(jī)選擇85個(gè)基因的基因集和62個(gè)基因的基因集，計(jì)算兩個(gè)基因集中重疊基因的數(shù)目；隨后這個(gè)過(guò)程重復(fù)10000次，圖5顯示隨機(jī)基因集中的最大重疊數(shù)目是4。因此，TuM7和NPI-ES之間重疊的顯著性可估算為小于0.0001。最后，TuM8包含幾個(gè)和17q21基因座位物理連鎖的基因(例如v-erb-b2,GRB7，PNMT)與先前報(bào)道的ERBB2簇相一致(1-4)。這些結(jié)果說(shuō)明，盡管ISA是一種完全無(wú)實(shí)體的分析方法，它在再次發(fā)現(xiàn)許多(如果不是全部)先前報(bào)道的乳腺癌主要基因表達(dá)標(biāo)志物方面具有驚人的效率。TuMl包含ER+腫瘤中與凋亡和低組織學(xué)分級(jí)相關(guān)的新表達(dá)標(biāo)志物除了鑒定出先前報(bào)道的標(biāo)志物外，ISA還在TuMl中發(fā)現(xiàn)了新的基因表達(dá)標(biāo)志物。TuMl明顯的富含在可能與凋亡有關(guān)的基因(P=0.01，超幾何分布)中，包括程序性細(xì)胞死亡4、線粒體核糖體蛋白S30和p-TrCPl,還包括最近報(bào)道的與乳腺癌分級(jí)有關(guān)的基因如PCM1基因(9)，細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)基因如GJA1和IL6ST，和編碼異生物體代謝酶的基因NAT1和FM05。為了研究顯示TuMl標(biāo)志物高表達(dá)的腫瘤的臨床顯著性，發(fā)明人將這些腫瘤與不同的臨床和組織病理參數(shù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。為給比較提供基礎(chǔ)，對(duì)其它TuM也進(jìn)行了相似的分析。如表1A所示，揭示了TuM與多種臨床特征的多個(gè)顯著相關(guān)。研究者關(guān)注TuMl，TuM2和TuM3表現(xiàn)出的相關(guān)性。而關(guān)于其它TuM相關(guān)性的詳細(xì)談?wù)撛诤竺嫣峁?。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TuMl,TuM2和TuM3與ER狀態(tài)明顯正向相關(guān)(P<0.001，表1A)。與這種觀察到的現(xiàn)象相一致的是，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)免疫組化分析，屬于這三種TuM的肺瘤都為ER陽(yáng)性。然而，與TuM2和TuM3不同，僅TuMl表現(xiàn)出與低組織學(xué)分級(jí)的強(qiáng)烈正相關(guān)(p〈0.001;而TuM2為p=0.024;TuM3為p=0.037),提示TuMl表達(dá)標(biāo)志物可能是ER+低分級(jí)肺瘤的特異性分子特征。然而，由于與ER-腫瘤相比，ER+腫瘤通常與更低組織學(xué)分級(jí)相關(guān)(見(jiàn)下)，發(fā)明人也考慮了如下可能性TuMl表達(dá)與低分級(jí)的相關(guān)性可能僅簡(jiǎn)單的歸因于這些模塊中的腫瘤主要是ER+。為了查清這種可能性，與表1A中的使用所有腫瘤的以前分析不同，發(fā)明人僅使用ER+腫瘤作為研究群體來(lái)重復(fù)相關(guān)性研究。如表1B所示，即使除去所有非ER+腫瘤，TuMl仍然與低分級(jí)顯著相關(guān)(P=0.001)，而TuM2和TuM3不顯著相關(guān)(分別為P=0.24,P-O.21)。這些結(jié)果說(shuō)明，TuMl表達(dá)標(biāo)志物與低組織學(xué)分級(jí)明顯相關(guān)，而與ER狀態(tài)無(wú)關(guān)。在兩個(gè)無(wú)關(guān)數(shù)據(jù)集中，TuMl表達(dá)標(biāo)志物與低分級(jí)明顯相關(guān)發(fā)明人通過(guò)將TuMl表達(dá)標(biāo)志物應(yīng)用于兩個(gè)獨(dú)立的可公開(kāi)獲得的乳腺癌數(shù)據(jù)集上，測(cè)試它的一般適用性。第一個(gè)數(shù)據(jù)集(Rosetta數(shù)據(jù)集)包含117個(gè)使用基于寡核苷酸的微列陣(IO)繪譜的乳腺癌(71ER+腫瘤)；而第二個(gè)數(shù)據(jù)集("Stanford"數(shù)據(jù)集)包含122個(gè)使用cDNA微列陣(3)繪i普的乳腺癌組織樣品(82個(gè)ER+胂瘤)。在本研究鑒定的34個(gè)TuMl基因中(見(jiàn)表2)，Rosetta和Stanford微列陣分別發(fā)現(xiàn)了其中的20和13個(gè)。與發(fā)明人自制系列相一致，他們發(fā)現(xiàn)TuMl標(biāo)志物把RosetU和Stanford數(shù)據(jù)集中的ER+腫瘤分成兩個(gè)不同的表達(dá)高或低水平TuMl標(biāo)志物的亞群；并且在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，高表達(dá)TuMl標(biāo)志物的腫瘤與低組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)(兩者都p<0.001)。這些結(jié)果說(shuō)明，TuMl表達(dá)標(biāo)志物在廣泛種矣的患者群體中與低組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，因此它可能反映了乳腺癌的一種普遍分子特征。有趣的是，在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，大部分，但不是所有，先前界定為"管腔A(LuminalA)，，亞型的腫瘤(3)，表達(dá)高水平的TuMl標(biāo)志物，盡管3卩個(gè)TuMl基因中僅有一個(gè)(NAT1)以前被報(bào)道在這種腫瘤亞型中表達(dá)。由于可以獲得Rosetta和Stanford患者組臨床隨訪數(shù)據(jù)，發(fā)明人測(cè)試了TuMl標(biāo)志物在兩個(gè)患者群體中預(yù)測(cè)臨床結(jié)果的能力。他們發(fā)現(xiàn)，在Stanford系列中，表達(dá)TuMl的ER+腫瘤患者比不表達(dá)TuMl的M+腫瘤患者表現(xiàn)出更好的生存結(jié)果(總體生存率p=0.0001;無(wú)復(fù)發(fā)生存率p-0.0036,圖2a)。相反，在Rosetta系列，表達(dá)TuMl的ER+腫瘤患者并未比不表達(dá)TuMl的ER+腫瘤患者表現(xiàn)出更好的生存結(jié)果(p-0.34)。解釋兩個(gè)群體間這種差異的一個(gè)的可能的原因是兩群體的臨床特征不同Rosetta系列包含早期階段患者(I期)，所述患者一般沒(méi)有接受任何系統(tǒng)性輔助治療，而Stanford系列主要包括帶有局部晚期疾病的在手術(shù)后接受過(guò)輔助內(nèi)分泌治療(如果他們的腫瘤為ER+)的晚期階段患者。因此，TuMl標(biāo)志物的存在有可能反映了腫瘤對(duì)輔助治療的敏感性，而不是腫瘤的內(nèi)在轉(zhuǎn)移傾向(見(jiàn)討論)。不同TuM間的相關(guān)性分析揭示了ERBB2+腫瘤和免疫系統(tǒng)的未預(yù)料到的關(guān)系SA的主要力量是揭示不同模塊間更高階相關(guān)性的能力(5)。在腫瘤生物學(xué)范疇內(nèi)，這對(duì)鑒定不同TuM間的關(guān)系可能非常有用，并對(duì)確定在特定腫瘤中不同分子標(biāo)志物的表達(dá)是獨(dú)立方式還是非獨(dú)立的方式非常有用。發(fā)明人計(jì)算了不同TuM的相關(guān)性值(見(jiàn)下)，并將結(jié)果描繪為熱圖(heat-map)，來(lái)說(shuō)明不同肺瘤間交叉TuM的相互關(guān)系(圖3)。例如TuMl,2和3展示了高度重疊(但并不相同)的"肺瘤標(biāo)志物"(圖3A)，表明表達(dá)TuMl標(biāo)志物的胂瘤，也可能表達(dá)TuM2和TuM3標(biāo)志物。相似的是，TuM7，NPI-ES/細(xì)胞增殖模塊與TuM6模塊("基礎(chǔ)"模塊)正向相關(guān)，但與TuMl負(fù)相關(guān)(圖3B)。這些發(fā)現(xiàn)與先前已知的乳腺癌特征相一致-例如，已知ER-或'基底，亞型的腫瘤典型的具有高組織分級(jí)并且增加的增殖標(biāo)志如Ki67表達(dá)(1-4)。然而，除了這些預(yù)期發(fā)現(xiàn)外，TuM間相關(guān)性分析揭示了一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)-特別的，TuM4"免疫"模塊被發(fā)現(xiàn)與ERBB2+模塊TuM8相關(guān)(圖3C)，其相關(guān)強(qiáng)度和圖3加亮顯示的其它相互關(guān)系相當(dāng)。這種相關(guān)性提示，在ERBB2+分子亞型中存在免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間的實(shí)質(zhì)性的串話，在討論部分對(duì)此進(jìn)一步解決。特別的，展示共同TuM4(+)和TuM8(+)"胂瘤標(biāo)志物，，的腫瘤和增強(qiáng)的淋巴血管侵襲(LVI)之間具有微弱但顯著的相關(guān)性(p=0.03,卡方分析，Chi-squareanalysis)，這與單獨(dú)TuM4(+)或TuM8(+)腫瘤不同。這個(gè)結(jié)果提示，與共同表達(dá)TuM4和TuM8標(biāo)志物的腫瘤相關(guān)的臨床特征與只表達(dá)其中一種標(biāo)志物的腫瘤的臨床特征不同。TuM和臨床參數(shù)間的關(guān)聯(lián)一個(gè)腫瘤模塊與一組腫瘤關(guān)聯(lián)，每個(gè)腫瘤的顯著性用評(píng)分來(lái)表征。正分和負(fù)分表示腫瘤中基因被上調(diào)或下調(diào)。在此，發(fā)明人僅研究了正分的腫瘤，因?yàn)樨?fù)分的腫瘤數(shù)量不足(僅有3個(gè)模塊含負(fù)分的腫瘤；見(jiàn)圖6)。他們發(fā)現(xiàn)某種低腫瘤得分的腫瘤明顯與其它區(qū)分出來(lái)(矩形中的那些)。這些肺瘤被作為"低可信度"樣品，并從后面的相關(guān)性分析中去除(表1A)。隨后采用統(tǒng)計(jì)方法來(lái)尋找這些轉(zhuǎn)錄模塊的臨床顯著性，結(jié)果顯示模塊與臨床特征之間存在許多顯著相關(guān)。總體來(lái)說(shuō)，發(fā)明人的結(jié)果(尤其在嚴(yán)緊顯著性閾值下p<0.01，表1A)提示，僅ER/PR狀態(tài)和腫瘤分級(jí)可能與基因表達(dá)數(shù)據(jù)相關(guān)，這已被參考文獻(xiàn)4所觀察到。TuM4，(免疫群集)與BR狀態(tài)負(fù)相關(guān)，與高分級(jí)輕微正相關(guān)(p-O.02)。這個(gè)結(jié)果與免疫球蛋白基因包括大部分的"ER-"基因(Iwkoetal，2002)這一報(bào)道相一致。TuM5(主要的基質(zhì)細(xì)胞群集)與任何臨床參數(shù)都沒(méi)有相關(guān)性。如所預(yù)期一樣，TuM6和TuM8分別代表了￡11-/基底和ERBB2+，與ER明顯負(fù)相關(guān)(p<0.001)。對(duì)于TuM8(ERBB2+)，已實(shí)施了ERBB2IHC的14個(gè)腫瘤全部通過(guò)IHC而為ERBB2+。TuM7(細(xì)胞增殖蔟)與高組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)，但與ER狀態(tài)無(wú)關(guān)。TuM之間的相關(guān)性按照Bergmann等2004年的說(shuō)明，發(fā)明者計(jì)算TuM之間的相關(guān)性值，與圖3相一致。TuMl的表達(dá)與低組織學(xué)分級(jí)相關(guān)利用多變量分析，我們檢驗(yàn)TuMl表達(dá)和低腫瘤分級(jí)之間的相關(guān)性是否僅僅是他們與ER狀態(tài)相關(guān)的結(jié)果，或TuMl表達(dá)和低腫瘤分級(jí)之間的相關(guān)性是否獨(dú)立于ER。在這個(gè)分析中，TuMl表達(dá)與分級(jí)相關(guān)，獨(dú)立于ER(p<0.001);但TuM2，另一個(gè)腫瘤模塊，與低分級(jí)的相關(guān)并非如此(p=0.9,表5)。體外他莫昔芬處理導(dǎo)致TuMl模塊下調(diào)TuMl在ER+肺瘤子集中表達(dá)，提出一種可能性，這個(gè)模塊的表達(dá)依賴(lài)(至少部分依賴(lài))ER的活性和信號(hào)。為研究TuMl表達(dá)與ER狀態(tài)的相關(guān)性，我們使用體外系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)TuMl對(duì)ER活性的應(yīng)答。首先，通過(guò)研究一組乳腺癌和胃癌細(xì)胞系的表達(dá)諉，我們發(fā)現(xiàn)TuMl才莫塊在ER+乳腺癌細(xì)胞系MCF7中過(guò)表達(dá)(圖11)。其次，我們用他莫昔芬(一種ER抑制劑)處理MCF7細(xì)胞，用基因集富集分析法(GSEA，16)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，TuMl在他莫昔芬處理的MCF7細(xì)胞系中明顯下調(diào)(FDR=0.05)。作為對(duì)照，除了TuM2外，其它TuM都沒(méi)有被他莫昔芬處理所影響，TuM2和他莫昔芬處理輕微相關(guān)(FDR-O.19)。該分析過(guò)程的細(xì)節(jié)在材料和方法中已給出。這個(gè)結(jié)果提示，至少在體外，TuMl的表達(dá)可能依賴(lài)于ER信號(hào)的活性，因此可以表現(xiàn)為ER活性的"分子標(biāo)志物"。TuMl表達(dá)和臨床結(jié)果可能的相關(guān)性我們的發(fā)現(xiàn)，TuMl模塊的表達(dá)依賴(lài)于活性ER信號(hào)，促使我們研究該模塊在原初腫瘤的出現(xiàn)是否可以作為ER活性的分子生物標(biāo)記物，并鑒定可能對(duì)他莫昔芬或其它抗激素治療產(chǎn)生響應(yīng)的腫瘤。我們?cè)谌齻€(gè)數(shù)據(jù)集中檢驗(yàn)TuMl的預(yù)后能力。在來(lái)源于Stanford大學(xué)的第一個(gè)數(shù)據(jù)集中，在TuMl、分級(jí)、年齡、淋巴結(jié)和腫瘤大小的多變量分析中，TuMl表現(xiàn)為一個(gè)獨(dú)立的生存結(jié)果預(yù)測(cè)因子(predictor)，而分級(jí)不是，說(shuō)明和單獨(dú)的分級(jí)狀態(tài)相比TuMl是更為直接的患者生存預(yù)后(圖6)。第二，我們檢驗(yàn)了Ma數(shù)據(jù)集，它包含一組預(yù)選的他莫昔芬響應(yīng)和抗性的ER+肺瘤(28)。再一次，TuMl過(guò)表達(dá)的患者表現(xiàn)出比TuMl低表達(dá)的患者明顯更好的結(jié)果(p-O.048，圖12b)。通過(guò)多變量Cox回歸分析，TuMl是唯一的獨(dú)立預(yù)后因子(p-O.03，表6);因?yàn)榉旨?jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)和年齡在Ma患者組中被控制(28)。還使用基因集富集分析(GSEA)檢驗(yàn)了此觀察，證實(shí)了TuMl表達(dá)與莫昔芬響應(yīng)顯著相關(guān)(P-O.024);第三，在uppsala集中檢驗(yàn)了TuMl的預(yù)后能力，它是67名接受他莫昔芬單一治療的獨(dú)立的ER+患者群(29)。再一次，帶有表達(dá)TuMl的腫瘤的患者比低表達(dá)TuMl的患者表現(xiàn)出顯著更好的總體生存結(jié)果(P-O.025,圖12c)。通過(guò)多變量Cox回歸分析，TuMl仍然與生存率顯著相關(guān)(p=0.024);而分級(jí)、腫瘤大小和淋巴結(jié)狀態(tài)不是(表6)。松弛素2(—個(gè)TuMl模塊基因)的基因抑制降低了MCF7對(duì)他莫昔芬的響應(yīng)為了功能性地對(duì)TuMl標(biāo)志物和腫瘤對(duì)抗激素治療的應(yīng)答之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，對(duì)TuMl基因的代表，松弛素2(RLN2)，在ER+乳腺癌細(xì)胞模型中的角色進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)siRNA介導(dǎo)的基因抑制在MCF-7細(xì)胞系中沉默RLN2。RLN2沉默的和對(duì)照細(xì)胞用luM他莫昔芬處理48小時(shí)，并且72小時(shí)后分析凋亡細(xì)胞的百分率。流式細(xì)胞儀分析顯示在他莫昔芬處理的對(duì)照MCF-7細(xì)胞中73%的細(xì)胞為annexin-V染色陽(yáng)性，而在RLN2沉默的MCF-7細(xì)胞群中23%的細(xì)胞凋亡。這表明，在乳腺癌細(xì)胞系模型中，RLN2沉默的細(xì)胞系對(duì)他莫昔芬敏感性降低，證明了高表達(dá)RLN2不知何故可帶來(lái)對(duì)他莫昔芬的響應(yīng)性。TuMl基因賦予抗激素治療響應(yīng)性的未知分子機(jī)制有益于詳細(xì)的研究。討論發(fā)明人利用一個(gè)最近被描述的分析方法一標(biāo)志物分析法來(lái)表征自制的乳腺癌表達(dá)譜的數(shù)據(jù)集。除了再次發(fā)現(xiàn)許多以前描述的乳腺癌基因表達(dá)標(biāo)志物以外，SA還在三個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中鑒定出一個(gè)新的基因表達(dá)標(biāo)志物(TuMl)，它在凋亡有關(guān)基因中顯著富集，并與低組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。值得注意的是，TuMl標(biāo)志物與低組織學(xué)分級(jí)的相關(guān)性被證實(shí)是獨(dú)立于ER狀態(tài)的。因此，TuMl標(biāo)志物與以前報(bào)道的低分級(jí)標(biāo)志物不同，后者傾向于包含與ER狀態(tài)有關(guān)的基因，如GATA3(4),這可以反映廣為人知的觀察現(xiàn)象ER陰性腫瘤傾向于高分級(jí)。在TuMl中鑒定出的許多共調(diào)控基因與凋亡有關(guān)。其中，程序性細(xì)胞死亡4(PDCD4)已經(jīng)顯示能夠抑制肺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(11)p-TrCPl(BTRC;也;f皮稱(chēng)為Fbwla或FWD1)，是SCF(SKPl-cul1in-F-box)泛素蛋白連接酶復(fù)合物的一個(gè)成份，在多個(gè)轉(zhuǎn)錄程序中通過(guò)激活NF-kappaB(NFkB)通路發(fā)揮作用，隨后抑制細(xì)胞增殖(12)，并且熱休克70KDa蛋白2(HSPA2)可保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗凋亡(13)。有趣的是，在人類(lèi)癌癥中PDCD4失活也被報(bào)導(dǎo)可引起對(duì)格爾德霉素細(xì)胞毒作用的敏感性降低，在體外在乳腺癌中也是如此(14)，而NAT1，另一個(gè)TuMl基因，已被報(bào)道是乳腺癌復(fù)發(fā)的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子和他莫昔芬響應(yīng)的潛在的預(yù)測(cè)因子(15)。這些后面的觀察結(jié)果提示，TuMl標(biāo)志物將作為乳腺癌激素治療響應(yīng)性的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。與這種可能性相一致，TuMl標(biāo)志物在接受輔助治療患者群中與臨床結(jié)果強(qiáng)烈相關(guān)(Stanford組群)，但在未接受這種治療的患者群中(Rosetta組群)與臨床結(jié)果不相關(guān)。值得注意的是，最近有報(bào)道稱(chēng)過(guò)表達(dá)凋亡相關(guān)基因的乳腺癌能表現(xiàn)出對(duì)化療更強(qiáng)的敏感性(16)。除了鑒定出TuMl,SA還使發(fā)明人界定了不同TuM之間的相關(guān)性，來(lái)研究這些共調(diào)節(jié)基因組之間更高階調(diào)控關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)包含免疫相關(guān)基因的TuM4和包含ERBB2有關(guān)基因并因此代表了ERBB2+腫瘤亞群的TuM8之間存在驚人的正向相關(guān)性。這個(gè)結(jié)果提高了ERBB2+腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞之間存在實(shí)質(zhì)性的串話的可能性。目前，發(fā)明人僅能猜測(cè)這一過(guò)程中可能的分子機(jī)制。然而，檢測(cè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)有可能發(fā)現(xiàn)潛在的線索。在TuM4基因中，以前已報(bào)道GBP1和ISG20是NF-KappaB的乾基因(17,18)，NF-KappaB是免疫應(yīng)答通路(19)的關(guān)鍵組分，可調(diào)節(jié)炎癥因子、趨化因子、免疫受體和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)。而且，Biswas等人最近報(bào)道，激活的NFkB主要出現(xiàn)在ER-陰性/ERBB2-陽(yáng)性的乳腺癌亞群中(20)。因此，發(fā)明人認(rèn)為T(mén)uM4(免疫應(yīng)答)和TuM8(ERBB2)的正向關(guān)系可能至少部分由于特異性的在ERBB2+腫瘤中的NFkB激活，這隨后介導(dǎo)了免疫應(yīng)答的激活。有趣的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，表達(dá)TuM4和TuM8標(biāo)志物的腫瘤與LVI顯著相關(guān)。同樣的，腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間的串話可能有助于這些腫瘤展現(xiàn)增強(qiáng)的血管新生和轉(zhuǎn)移趨勢(shì)的能力，這兩者都與NFkB活性有關(guān)(21)?？傊?，發(fā)明人闡述了對(duì)腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行SA的可行性，并顯示SA分析能產(chǎn)生新的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，甚至是對(duì)于先前已經(jīng)接受過(guò)大多數(shù)分析的數(shù)據(jù)集。SA因此提供了一種有力的聚類(lèi)基因和把基因表達(dá)數(shù)據(jù)與外部臨床信息整合起來(lái)的替代方法。進(jìn)一步，SA界定出的TuM加深了我們對(duì)發(fā)生在乳腺癌中的更高水平上的分子間相互關(guān)系的理解，并4吏重要的i貪斷、預(yù)后和治療方案的能被制定。表1A:用卡方分析和超幾何概率密度公式分析研究腫瘤模塊與臨床參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。只有兩種方法均證實(shí)的顯著性P值(<0.05)被加亮顯示。粗體數(shù)值表示最顯著的相關(guān)性(<0.001)。LN:淋巴結(jié)；ER:雌激素受體；PR:黃體酮受體；LVI:淋巴管侵襲。表IA.模塊和臨床特征間的相關(guān)性。~~分級(jí)(^/〉55(V>3(1,2)vs.cm》3IiNERPRTuMl0.0152<0,001<0*001o.men0.0152(低分級(jí))(《3*)(1,2)(+)(+)0.0242<00010，0021(ElW管腔〗(1,2)")"》0.0015TuM3(ER+工工)(1,2)<+)(+)TuM4{免疫)0.0212(3》0.0044(-)TuW5(基質(zhì))0.0236<:0，0010*0098/基底)(+)(-)(-)(細(xì)胞增殖)<0,001<3)<0,001<0,001TuM8(ERBB2+)(-)")中的參數(shù)表明了和TuM相關(guān)的方向，例如TuI^與高分級(jí)(3)和ER陰性(-)相關(guān)；而TuM3與較小的腫瘤大小(<=3),低分級(jí)(1，2),ER陽(yáng)性(+),PR陽(yáng)性(+)和LVI陰性(-)正相關(guān)。表1B:TuMl，2，3與僅為ER+的腫瘤組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系。每個(gè)才莫塊有兩欄，第l欄是屬于肺瘤模塊的胂瘤，第2欄表示所有剩余的ER+腫瘤。表IB.TuMl，2，3和ER+肺瘤中胂瘤分級(jí)的關(guān)系。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>卿"370903"/15990115382839/10990123545537/"990134434030/19990148604026/19990174554523/2499022352531/2t990262684034/14990299585537/17990375381510/10200010459200017150252o/92000209585030/72000210504033/62000215501521/2120002205260330/3420002374347323/402000272493031^1620002744035310/232000287534030/820003206720320/2120003766538/232000399444020/82000401515032廠62000422516333〃2000500447536/62000593604130i/152000597574020/1220006096270217/M72000638604010》1520006414760316/242000651454123/52000652562536/2120006757855316廠162000683723520'/172000709453030》162000731685131/2920007595730〉122000768394030/172000775512520/122000779485530/14200078757603o/92000804394035/2120008136023316/172000818521020/"20008295145210/102000880551520/262000948563534/2242陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陰陽(yáng)陽(yáng)3+陽(yáng)中間的陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陰陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)2+陰陰陽(yáng)3+陰陽(yáng)陽(yáng)2+陽(yáng):的的，的否是否否是是否否能否否否是否是是是是能是是否否否是否能是l是是否是否否否否否否否是是是否是否是可可陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)，陰陰陰陰陰陰陰陰陰陰陰陽(yáng)陰陽(yáng)陰陽(yáng)陰陰陰陰陽(yáng)陽(yáng)陰陰陰陽(yáng)陰陰陽(yáng)陰陰陽(yáng)陰陰陰陽(yáng)陰陰陽(yáng)陽(yáng)陰陰陰陰陰陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陰陽(yáng)陰陽(yáng)陰陰陽(yáng)陽(yáng)陰陽(yáng)陰陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陰陰陰陰陰陽(yáng)陰陰陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陰陽(yáng)陰陰陽(yáng)陰.陽(yáng)陰陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陽(yáng)陰陽(yáng)陰陰陽(yáng)襲,LN:淋巴結(jié)，ER:雌激素受體，PR:黃體酮受體，LVI:淋巴管侵:表4:圖3的相關(guān)性值。最大相關(guān)值用粗體字突出<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表6:死亡風(fēng)險(xiǎn)因子(Uppsala或Stanford)的多變量分析或轉(zhuǎn)移(Ma)作為第一事件的多變量分析。在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型(coxproportionalhazardmodel)中被發(fā)現(xiàn)顯著性的參數(shù)(P<0.05)用粗體字顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>參考文獻(xiàn)1.Perou,C.M.,T.Sorlie,M,B，Eisen,v.d.R，M,,S,S.Jeffrey,C,A，Rees,J.R.Pollack,D,T，Ross,H,Johnsen,L，A.Akslen,O，F(xiàn)luge,A.Pergamenschikov,C.Williams,S,X.Zhu,P，E,IiOnning,A,L，Borresen-Dale,P.0-Brown,andD,Botstein.MolecularPortraitsofHumanBreastTumors，Nature,406:747-752,2000,2.Sorlie,T.,C.M,Perou,R.Tibshirani,T,Aas,S，Geisler,H，Johnsen,T,Hastie,M.B，Eisen,M,vandeRijn,S,S，Jeffrey,T,Thorsen,H,Quist,J,C,Matese,P.0.Brown,D,Botstein,P.E,Ijo皿irig,andA.L,Borresen-Dale,GeneExpressionPatternsofBreastCarcinomasDistinguishTumorSubclasseswithClinicalImplications.ProcNatlAcadSciUSA.,98:10879-10874,2001.3.SorlieT,Tibsh丄raniR,ParkerJ,HastieT,MarronJS,NobelA,DengS,JohnsenH,PesichR,GeislerS,DemeterJ,PerouCM,:LormingPE,BrownPO,Borresen-DaleAL,BotsteinD.RepeatedobservationofbreasttumorsubtypesinindependentgeneexpressiondatasetsProcNatlAcadSciUSA,100(14):8418-23,2003，4.Sotiriouc,NeoSY,McShaneIjM,KornELj,LongPM,JazaeriA,MartiatP,FoxSB,HarrisAL,LiuET,Breastcancer*classificationamiprognosisbasedongeneexpressionprofilesfromapopulation-basedstudy,ProcNatlAcadSciUSA，，100(18):10393-8,2003.5YuK,LeeCH,TanPH,TanPConservationofBreastCancerMolecularSubtypesandTranscriptionalPatternsofTumorProgressionAcrossDistinctEthnicPopulations,ClinCancerRes.10:5508-5517,2004，6'IhmelsJ,FriedllanderG,BergmannS,Sarig0,2ivY,BarkaiN.Revealingmodularorganizationintheyeasttranscriptionalnetwork,NatGenet-31(4):370-7,2002，7,工hmelsJ,BergmannS,BarkaiN.Definingtranscriptionmodulesusinglarge-scalegeneexpressiondata.Bioinformatics.2004Mar258,YuK,LeeCH,TanPH,HongGS,WeeSB,WongCY,TanP.AmolecularsignatureoftheNottinghamprognosticindexinbreastcancer.CancerRes.64(9〉2962-8,2004,9,ArmesJE,Ha難etF,DeSilvaM,CiciullaJ,RamusSJ,SooWK,MahoneyA,YarovayaN,HendersonMA,GishK,HutchinsAM,PriceGR,VenterDJ.Candidatetumor-suppressorgenesonchromosomearm8pinearly-onsetandhigh-gradebreastcancersOncogene23(33):5697-702,2004.10，van'tVeer,L.J，，H，Dai,M.J.vandeVijver,Y.D,He,A.A.M.Hart,M，Mao,H.L.Peterse,K.vanderKooy,M,J.Marton,A，T.Witteveen,G，J.Schreiber,R.M,Kerkhoven,C.Roberts,P.SLinsley,R，Bernards,andS,H,Friend,Geneexpressionprofilingpredictsclinicaloutcomeofbreastcancer.Nature415,530-536,2002.11,Lankat-ButtgereitB,GokeR.Programmedcelldeathprotein4(pdcd4):anoveltargetforantineoplastictherapyBiolCell，95(8):515-9,2003,12.NakayamaK,HatakeyamaS,MaruyamaS,KikuchiA,OnoeK,GoodRA,NakayamaKI,ImpaireddegradationofinhibitorysubunitofNF-kappaB(IkappaB)andbeta-cateninasaresultoftargeteddisruptionofthebeta-TrCPlgene.ProcNatlAcadSciUSA，100(15》8752-7,2003.13.CayliS,SakkasD,VigueLj,DemirR,HuszarG，Cellularmaturityandapoptosisinhumansperm:creatinekinase,caspase-3andBel-XLlevelsinmatureanddiminishedmaturitysperm,MolHumReproci，10(5》365-72,2D04.14，JansenAP,CamalierCE,StarkC,ColburnNH.Characterizationofprogrammedcelldeath4inmultiplehumancancersrevealsanovelenhancerofdrugsensitivity-MolCancerTher.3(2):103-10,2004.15BiecheI,GiraultI,UrbainE,TozluS,LidereauR，Relationshipbetweenintratumoralexpressionofgenescodingforxenobiotic-metabolizingenzymesandbenefitfromadjuvanttamoxifeninestrogenreceptoralpha-positivepostmenopausalbreastcarcinoma'BreastCancerRes,6(3):R252-63,2004.16ChangJC,WootenEC,TsimelzonA,HilsenbeckSG,GutierrezMC,ElledgeR,MohsinS,OsborneCK,ChamnessGC,AllredDC,O，ConnellP,Geneexpressionprofilingforthepredictionoftherapeuticresponsetodocetaxelinpatientswithbreastcancer，Lancet.362(9381》362-9,200317,NaschbergerE,WernerT,VicenteAB,GuenziEfTopoltK,LeubertR,Iiubeseder-MartellatoC,NelsonPJ,SturzlM.Nuclearfactor-kappaBmotifandinterferon-alpha-stimulatedresponseelementco-operateintheactivationofguanylate-bindingprotein-1expressionbyinflammatorycytokinesinendothelialcells.BiochemJ，373(Pt2):409-20,2004.18,EspertReyC,GonzalezDegolsG,Chelbi-AlixMK,MechtiN,GongoraC.TheexonucleaseISG20isdirectlyinducedbysyntheticdsRNAviaNF-kappaBand工RFlactivation.Oncogene，23(26):4636-40,2004，19,PahlHL.ActivatorsandtargetgenesofRel/NF*-Btranscriptionfactors.Oncogene.18:6853—6866,1999.20,BiswasDK,ShiQ,BailyS,StricklandI,GhoshS,PardeeAB,工glehartJD.NF-kappaBactivationinhumanbreastcancerspecimensanditsroleincellproliferationandapoptosis.ProcNatlAcadSciUSA.101(27):10137-42,20CH21,KarinM,CaoY,GretenFR,LiZW,NF-kappaBincancer:frominnocentbystandertomajorculprit.NatRevCancer:2(4):301-10,2002,權(quán)利要求1.預(yù)測(cè)乳腺癌患者對(duì)治療的響應(yīng)的方法，該方法包括基于來(lái)自所述患者的乳腺腫瘤樣品中的基因集的表達(dá)水平為患者給出預(yù)測(cè)，其中所述基因集包含選自表2的至少10個(gè)基因。2.權(quán)利要求1的方法，其中，該基因集包含表2中的至少20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)或所有基因。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中，該基因集包含表2a中列出的至少前5個(gè)基因。4.基因集在用于基于獲自所述患者的乳腺腫瘤樣品中的所述基因集的表達(dá)鐠來(lái)預(yù)測(cè)乳腺癌患者對(duì)治療的響應(yīng)中的應(yīng)用，所述基因集包含選自表2的至少10個(gè)基因。5.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中，該基因集包含表2中的至少20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)或所有基因。6.權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中，該基因集包含表2a中列出的至少前5個(gè)基因。7.權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的方法，其包括下述步驟提供代表腫瘤中所述基因集的表達(dá)水平的表達(dá)譜；基于表達(dá)語(yǔ)給出患者的預(yù)后和/或治療方案。8.確定乳腺癌患者的預(yù)后和/或治療方案的方法，所述方法包括下述步驟(a)測(cè)定基因集在獲自所述患者的乳腺腫瘤樣品中的表達(dá)水平，所述的基因集包含選自表2的至少I(mǎi)O個(gè)基因；(b)提供代表腫瘤中所述基因集的表達(dá)水平的表達(dá)譜；(c)基于表達(dá)語(yǔ)，給出患者預(yù)后和/或治療方案。9.權(quán)利要求8的方法，其中，步驟(b)包括使獲自樣品的表達(dá)產(chǎn)物與可與所述表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合的結(jié)合成員接觸，所迷結(jié)合成員指示所述基因集的表達(dá)水平，其中，這樣的結(jié)合可被檢測(cè)。10.權(quán)利要求9的方法，其中，表達(dá)產(chǎn)物選自MRNA、cDNA、cRNA或表達(dá)的多肽。11.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的方法，其中，結(jié)合成員是互補(bǔ)的核酸序列或特異性抗體。12.權(quán)利要求9-11中任何一項(xiàng)的方法，其中，表達(dá)產(chǎn)物^f皮標(biāo)記用以檢測(cè)。13.權(quán)利要求9-11中任何一項(xiàng)的方法，其中，結(jié)合成員^C標(biāo)記用以檢測(cè)。14.權(quán)利要求7-11中任何一項(xiàng)的方法，其中，步驟(c)包括把來(lái)自患者的乳腺胂瘤樣品的表達(dá)譜與先前獲得的表達(dá)譜和/或先前確定的標(biāo)準(zhǔn)譜進(jìn)行比較，標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)i瞽對(duì)特定的預(yù)后是特征性的，和/或?qū)︻A(yù)測(cè)治療響應(yīng)是特征性的。15.權(quán)利要求14的方法，其中，以前獲得的謙作為鐠數(shù)據(jù)庫(kù)被儲(chǔ)存。16.權(quán)利要求7-13中任何一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括比較治療前后乳腺腫瘤樣品中的基因集的表達(dá)水平，以檢測(cè)表達(dá)謙中任何指示改善的預(yù)后或惡化的預(yù)后的改變。17.權(quán)利要求7-14中任何一項(xiàng)的方法，其中，乳腺腫瘤樣品的表達(dá)鐠已確定該腫瘤為ER+腫瘤亞群。18.權(quán)利要求l的方法，其中，治療為激素治療和/或化療。19.用于預(yù)測(cè)乳腺腫瘤樣品治療響應(yīng)的裝置，該裝置包括向其上附著了多個(gè)結(jié)合成員的固相支持物，每個(gè)結(jié)合成員能夠特異并獨(dú)立地與基因集的一種表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合，其中，該基因集包含來(lái)自表2的至少10個(gè)基因。20.權(quán)利要求19的裝置，其中，該基因集包含表2的至少20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)或所有基因。21.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的裝置，其中，該基因集包含列于表2a中的至少前5個(gè)基因。22.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的裝置，其中，固相支持物僅附著能夠特異并獨(dú)立地與標(biāo)識(shí)在表2的基因的表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合的結(jié)合成員。23.權(quán)利要求17-22中任何一項(xiàng)的裝置，包含核酸微列陣，其中，結(jié)合成員是核酸序列。24.權(quán)利要求19-23中任何一項(xiàng)的裝置，其中，治療為激素治療和/或化療。25.權(quán)利要求24的裝置，其中，激素治療為他莫昔芬。26.用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者的治療響應(yīng)的試劑盒，所述試劑盒包含多種能與基因集的表達(dá)產(chǎn)物特異性地結(jié)合的結(jié)合成員和檢測(cè)試劑，其中，該基因集包含選自表2的至少I(mǎi)O個(gè)基因。27.權(quán)利要求26的試劑盒，進(jìn)一步包含用于標(biāo)記所述多個(gè)結(jié)合成員的標(biāo)i己工具。28.權(quán)利要求26或權(quán)利要求27的試劑盒，其中，該基因集包含表2的至少20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)或所有基因。29.權(quán)利要求26-28中任何一項(xiàng)的試劑盒，其中，該基因集包含列于表2a中的至少前5個(gè)基因。30.權(quán)利要求26-29中任何一項(xiàng)的試劑盒，進(jìn)一步包含數(shù)據(jù)分析工具，其中數(shù)據(jù)分析工具為計(jì)算機(jī)程序。31.權(quán)利要求30的試劑盒，其中，數(shù)據(jù)分析工具包含適于區(qū)別預(yù)測(cè)的響應(yīng)與腫瘤表達(dá)譜的算法。32.權(quán)利要求26-31中任何一項(xiàng)的試劑盒，包含已知治療響應(yīng)的來(lái)自乳腺腫瘤樣品的表達(dá)謙和/或特定治療響應(yīng)的特征性表達(dá)謙。33.權(quán)利要求26-32中任何一項(xiàng)的試劑盒，包含權(quán)利要求19-25中任何一項(xiàng)的裝置。34.權(quán)利要求26-33中任何一項(xiàng)的試劑盒，其中，治療為激素治療和/或化療。35.權(quán)利要求34的試劑盒，其中，激素治療為他莫昔芬。36.制備乳腺胂瘤樣品的核酸表達(dá)i普的方法，包括下列步驟(a)從所述乳腺腫瘤樣品中分離表達(dá)產(chǎn)物；(b)鑒定基因集的表達(dá)水平，所述基因集包含選自表2的至少10個(gè)基因；(c)從表達(dá)水平制備所述乳腺腫瘤樣品的表達(dá)傳。37.權(quán)利要求36的方法，其中，該基因集包含表2中的至少20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)或所有基因。38.權(quán)利要求36或權(quán)利要求37的方法，其中，該基因集包含列于表2a中的至少前5個(gè)基因。39.權(quán)利要求36或權(quán)利要求38的方法，包括添加表達(dá)譜到基因表達(dá)鐠數(shù)據(jù)庫(kù)中。40.權(quán)利要求36-39中任何一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括把表達(dá)鐠與第二表達(dá)諳或與以特定治療響應(yīng)為特征的多個(gè)表達(dá)語(yǔ)相比較。41.權(quán)利要求40的方法，進(jìn)一步包括制備標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)鐠的步驟，所述標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)譜代表第一和第二和/或以特定治療響應(yīng)為特征性多個(gè)表達(dá)語(yǔ)。42.權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的方法，包括下述步驟(a)從第一乳腺腫瘤樣品中分離表達(dá)產(chǎn)物；把所述表達(dá)產(chǎn)物和多個(gè)能夠特異并獨(dú)立地結(jié)合基因集的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員相接觸；由腫瘤樣品中的基因集的表達(dá)水平產(chǎn)生第一表達(dá)鐠；(b)從已知預(yù)后的第二乳腺腫瘤樣品中分離表達(dá)產(chǎn)物；把所述表達(dá)產(chǎn)物和多個(gè)能夠特異并獨(dú)立地結(jié)合步驟(a)的基因集的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員相接觸，以產(chǎn)生可比較的第二乳腺腫瘤樣品表達(dá)鐠；和(c)比較第一和第二表達(dá)譜以確定第一乳腺肺瘤樣品的治療響應(yīng)。43.表達(dá)謙數(shù)據(jù)庫(kù)，包含多個(gè)乳腺肺瘤樣品的基因表達(dá)鐠，其中，基因表達(dá)譜得自于基因集的表達(dá)水平，其中該基因集包含選自表2的至少10個(gè)基因，數(shù)據(jù)庫(kù)可讀取地保存于數(shù)據(jù)栽體上。44.權(quán)利要求43的表達(dá)i瞽數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，該數(shù)據(jù)集包含表2中的至少20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)或所有基因。45.權(quán)利要求43或權(quán)利要求44的表達(dá)誥數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，該基因集包含列于表2a的至少前5個(gè)基因。46.權(quán)利要求43-45中任何一項(xiàng)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，表達(dá)鐠是核酸表達(dá)譜。47.確定腫瘤的分子亞型的方法，所述方法包括下述步驟(a)從多個(gè)腫瘤樣品獲得基因表達(dá)產(chǎn)物；(b)對(duì)于高于預(yù)定義閾值的預(yù)選的多個(gè)基因基于表達(dá)產(chǎn)物的量將所述的腫瘤樣品分成組；和(c)根據(jù)基因表達(dá)譜，將分子亞型指定到所述的腫瘤組。48.權(quán)利要求47的方法，進(jìn)一步包括使用更高的預(yù)選閾值通過(guò)重復(fù)步驟(b)對(duì)所述腫瘤樣品進(jìn)行亞分組。49.診斷工具，其包含多種能夠特異和獨(dú)立地結(jié)合選自表2的至少10個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員，所述的多種結(jié)合成員被固定在固相支持物上。50.權(quán)利要求49的診斷工具，其中，至少20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)或所有基因選自表2。51.權(quán)利要求49或權(quán)利要求50的診斷工具，其中，該基因集包含表2a中列出的至少前5個(gè)基因。52.權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)的診斷工具，其中，該結(jié)合成員是核酸序列。全文摘要本發(fā)明提供了用于對(duì)患者的乳腺癌進(jìn)行分類(lèi)的材料和方法。特別是提供了新的基因表達(dá)標(biāo)志物，該標(biāo)記物可用作預(yù)測(cè)包括激素治療(如，他莫西芬)和化學(xué)治療的治療響應(yīng)的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101171344SQ200680014852公開(kāi)日2008年4月30日申請(qǐng)日期2006年3月30日優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日發(fā)明者P·譚,Y·昆申請(qǐng)人:Ncc技術(shù)投資私人有限公司