本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

穿心蓮是應(yīng)用廣泛的重要藥用植物，其提取物具有清熱解毒、消炎、消腫止痛作用。其主效成分——穿心蓮內(nèi)酯已被制作為多種非處方藥，而另一種主效成分——新穿心蓮內(nèi)酯單體還未成藥，因此新穿心蓮內(nèi)酯的生物合成途徑的研究將具有重要的醫(yī)學(xué)意義和經(jīng)濟價值。

穿心蓮屬于爵床科，該屬約包括20種，其中藥用的主要是穿心蓮(andrographispaniculata(bm.f)nees)，它被認為是苦味之王，被中國、印度、泰國和馬來西亞等國家廣泛應(yīng)用。穿心蓮提取物在治療咽喉炎、流感和上呼吸道感染效果良好，并且還對瘧疾和hiv具有治療作用。

現(xiàn)在中國食品藥品監(jiān)督管理局(sfda)批準的穿心蓮藥品，常見的有穿王消炎膠囊、穿心蓮內(nèi)酯軟膠囊和穿心蓮內(nèi)酯滴丸，主要利用的為穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)。新穿心蓮內(nèi)酯(neoandrographolide)與穿心蓮內(nèi)酯同為穿心蓮的主效成分，它們具有同樣的二萜骨架結(jié)構(gòu)，但是新穿心蓮內(nèi)酯比穿心蓮內(nèi)酯多了一個葡萄糖基，少了兩個羥基(圖1)。新穿心蓮內(nèi)酯結(jié)構(gòu)上的特征使得它可能具有穿心蓮內(nèi)酯相似或不同的藥理作用。

同穿心蓮內(nèi)酯藥理作用相似，體內(nèi)外實驗表明新穿心蓮內(nèi)酯在抗炎、抗腫瘤、降血壓、治療冠心病等方面具有顯著作用。陳詠梅還發(fā)現(xiàn)新穿心蓮內(nèi)酯在治療肺部腫瘤方面更有效果；新穿心蓮內(nèi)酯可能在治療老年性癡呆(alzhemier氏病)起到重要作用，穿心蓮內(nèi)酯藥理研究中還未有此方面的報到。

因此，新穿心蓮內(nèi)酯成為穿心蓮類新藥的研究熱點，對其生物合成途徑的研究將具有重要的研究意義和潛在的巨大經(jīng)濟價值。

新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶催化了其合成途徑的最后一步反應(yīng)，此酶的鑒定將為新穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑的整體解析起到極大的促進作用，并為其生物合成提供理論基礎(chǔ)。

雖然穿心蓮內(nèi)酯的骨架二萜結(jié)構(gòu)——ent-柯巴基焦磷酸(ent-cpp)的合酶已經(jīng)被鑒定，但是下游途徑都是未知的，包括可能的去磷酸化酶、p450酶和糖基轉(zhuǎn)移酶。這使得生物合成新穿心蓮內(nèi)酯或者穿心蓮內(nèi)酯幾乎不能實現(xiàn)。

值得一提的是，糖基轉(zhuǎn)移酶負責(zé)代謝終端產(chǎn)物的糖基化修飾，且其催化反應(yīng)的底物和產(chǎn)物清晰，它的鑒定將為整個途徑的解析起到重要指引作用。對新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶的鑒定，將為生物合成新穿心蓮內(nèi)酯提供酶學(xué)基礎(chǔ)，并為解析新穿心蓮內(nèi)酯合成途徑起到鋪墊作用。

新穿心蓮內(nèi)酯的生物合成將為其新藥創(chuàng)制提供充足的原料保障，并為其它藥用植物研究提供借鑒。目前人們已通過合成生物學(xué)實現(xiàn)了多種藥用植物主要成分的生物合成。paddon等在酵母里合成高含量的青蒿酸(25g/l)，這為發(fā)展中國家的瘧疾患者用上廉價的青蒿素提供了可能。人參皂苷苷元和稀有人參皂苷compoundk也已實現(xiàn)了生物合成，其中compoundk還被sfda批準了進行實驗。甘草次酸和甘草酸糖基轉(zhuǎn)移酶的鑒定，為生物合成甘草次酸和甘草酸提供了理論基礎(chǔ)。同理，新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶的鑒定也將極大地推進新穿心蓮內(nèi)酯的生物合成，為其成為新藥提供充足的原料，同時，這也將為其它藥用植物的研究提供思路。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補以上領(lǐng)域的不足，本發(fā)明提供了新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白，名稱為apugt73au1，來源于穿心蓮(andrographispaniculata(bm.f)nees)。

本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對新穿心蓮內(nèi)酯具有催化活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。

所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述蛋白的編碼基因為如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示dna分子；

2)在嚴格條件下與1)限定的dna分子雜交的dna分子；

3)與1)或2)限定的dna分子具有90％以上的同源性的dna分子。

該編碼基因含有1470個核苷酸，編碼489個氨基酸的蛋白。將該基因命名為apugt73au1，將其編碼的蛋白命名為apugt73au1。

含有所述編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。

擴增所述編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍，所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。

所述蛋白在作為新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述的蛋白、所述編碼基因在催化新穿心蓮內(nèi)酯苷元生成新穿心蓮內(nèi)酯中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明基于穿心蓮高通量測序的相關(guān)結(jié)果，用反向遺傳學(xué)的方法找到并鑒定新穿心蓮內(nèi)酯合成的最后一步關(guān)鍵酶apugt73au1，填補新穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑的終端空白，為進一步生物合成新穿心蓮內(nèi)酯提供了新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白及其編碼序列。

附圖說明

圖1為新穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯分子結(jié)構(gòu)式；其中neoandrographolide為新穿心蓮內(nèi)酯；andrographolide為穿心蓮內(nèi)酯；gly為葡萄糖基。

圖2為apugt73au1基因克隆和載體構(gòu)建，其中泳道3號為apugt73au1。

圖3為apugt73au1氨基酸比對圖；紅線標注的為pspgbox；sr：steviarebaudiana；ay345974(srugt76g1)，ay345982(srugt74g1)，ay345978(srugt85c2)。

圖4apugt73au1重組蛋白sds-page膠圖，泳道3號為apugt73au1。

圖5為重組蛋白apugt73au1對脫水穿心蓮內(nèi)酯體外酶活分析uplc圖；nap-a表示新穿心蓮內(nèi)酯苷元；nap表示新穿心蓮內(nèi)酯。

圖6重組蛋白apugt73au1對脫水穿心蓮內(nèi)酯體外酶活分析uplc圖；dp-a，脫水穿心蓮內(nèi)酯；dp-g，脫水穿心蓮內(nèi)酯苷。

圖7為apugt73au1對新穿心蓮內(nèi)酯苷元催化產(chǎn)物ms鑒定圖；nap-a表示新穿心蓮內(nèi)酯苷元；nap表示新穿心蓮內(nèi)酯。

圖8為q-tof-ms鑒定重組蛋白apugt73au1對脫水穿心蓮內(nèi)酯的催化產(chǎn)物；dp-a，脫水穿心蓮內(nèi)酯；dp-g，脫水穿心蓮內(nèi)酯苷。

圖9為apugt73au1重組蛋白酶催化活性。

具體實施方式

實施例1、克隆新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因

一、基因克隆的方法和步驟

收集3月大的穿心蓮(andrographispaniculata(bm.f)nees)(記載過該材料的非專利文獻是：李俊仁,陳秀珍,劉凱頻,等.穿心蓮連作土壤提取物對其種子的化感作用[j].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016,33(3):389-395.)植物莖和葉，分析其中的穿心蓮內(nèi)酯類含量，發(fā)現(xiàn)葉中富含大量的穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯苷和微量的新穿心蓮內(nèi)酯。

因此，利用上面材料，借助illumina平臺進行rnaseq。穿心蓮中組織表達譜rnaseq數(shù)據(jù)表明，獲得31個高表達的apugt73au1序列，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合apugt73au1保守結(jié)構(gòu)域pspgbox，得到31個300aa-500aa的apugt73au1序列，其中3個apugt73au1在葉中表達量非常高。

設(shè)計引物序列(如表1)，以葉的cdna為模板，利用kod高保真酶克隆到8個apugt73au1基因片段(kod高保真酶pcr體系總體積為50μl：5μl10×buffer，3μlmgso4，5μldntp(2mm)，5μl引物(10mm)，1μl模板和8μl水，程序如表2)。借助peasy-blunt載體(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為cb111-01(20rxns))，成功將apugt73au1片段連入載體上(連接體系總體積為3μl：0.5μlmixbufferwithenzyme和2.5μl模板，25℃反應(yīng)30min)。連接體系直接轉(zhuǎn)化transt1感受態(tài)(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，挑選陽性克隆測序(菌落pcr體系總體積為20μl：10μlmixbuffer，1μl模板，1μl引物和8μl水，程序如表3)，與rnaseq序列比對，從而獲得最終序列信息。

表1克隆基因所用引物序列

表2kod高保真酶pcr反應(yīng)程序

表3菌落pcr反應(yīng)程序

二、獲得基因序列以及其編碼的蛋白序列

利用表1引物，按照基因克隆方法，獲得帶有apugt73au1基因片段的克隆，通過pcr鑒定(圖2)，并測序得到其序列，blast比對發(fā)現(xiàn)核苷酸序列與原數(shù)據(jù)99％相似度，以實際測序結(jié)果為準。

獲得的apugt73au1含有1470個核苷酸，編碼489個氨基酸的蛋白，并通過官方命名apugt73au1(ugtnomenclaturecommittee，http://prime.vetmed.wsu.edu/resources/udp-glucuronsyltransferase-homepage)，具體信息如下：apugt73au1基因序列如序列表中序列1所示，其編碼序列表中序列2所示的蛋白，序列2由489個氨基酸組成。將該基因命名為apugt73au1，將其編碼的蛋白命名為apugt73au1。

利用apugt73au1氨基酸序列與已發(fā)表的二萜糖基轉(zhuǎn)移酶比對，發(fā)現(xiàn)雖然它與srugt85c2、srugt74g1和srugt76g1的相似很低，分別為26％、26％和24％，但它具有pspgbox(plantsecondaryproductglycosyltransferase，植物次生代謝產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶)保守結(jié)構(gòu)域(如圖3)。

三、基因功能的驗證

借助原核系統(tǒng)對基因功能進行了驗證，構(gòu)建pmal-c2x-apugt73au1載體，測序確認序列正確后，將載體成功轉(zhuǎn)入表達菌株novablue。

首先，給apugt73au1片段加上酶切位點接頭(起始密碼子atg前加bamhⅰ酶切位點，終止密碼子taa后加入salⅰ酶切位點，體系和程序跟上述基因克隆方法一致，引物信息如表4)；apugt73au1片段(帶有酶切位點)酶切后，利用t4-dna連接酶，將其構(gòu)建到表達載體pmal-c2x(購自newenglandbiolabs.，產(chǎn)品目錄號為e8200s)上(連接體系總體為7μl：3.5μlmixbuffer，2.75μlapugt73au1片段和0.75μlpmal-c2x；16℃反應(yīng)過夜)；其次，連接體系轉(zhuǎn)化transt1(購自peasy-blunt載體時贈送)后，挑選陽性克??；提取質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化到表達菌株novablue(購自merckmillipore，德國達姆施塔特默克集團(merckkgaa)的生命科學(xué)業(yè)務(wù)公司，產(chǎn)品目錄號為69284-3)。

表4構(gòu)建原核表達載體所用引物序列

表注：序列中小寫字母為保護堿基和酶切位點。

重組蛋白的誘導(dǎo)、純化、酶活分析和產(chǎn)物鑒定如下：

1)重組蛋白的誘導(dǎo)

分別挑取pmal-c2x-apugt73au1與pmal-c2x單克隆菌落于2mllb(含carb100mg/l)液體培養(yǎng)基中37℃中振蕩(200rpm)過夜培養(yǎng)。

取1ml過夜培養(yǎng)的菌液加入100ml新鮮的lb培養(yǎng)液(含carb100mg/l，0.2％過膜滅菌的葡萄糖)中，37℃搖床培養(yǎng)至600nmod值為0.5-0.6時，取1ml菌液，收集菌體作為對照。

在100ml菌液中加入30μliptg(1m，異丙基-β-d-硫代半乳苷)，終濃度為0.3mm，于16℃培養(yǎng)24h。

4℃，8,000×g離心3mins，收集菌體。

2)重組蛋白的純化

根據(jù)pmal融合蛋白和純化系統(tǒng)(newenglandbiolabinc.)手冊對重組apugt73au1蛋白進行純化。簡而言之，柱緩沖液重懸上面收集的菌液沉淀，并-20℃過夜。次日樣品融化后，利用超聲破碎儀對細胞破碎，釋放蛋白，高速9,000×g離心30mins后，待上樣；利用柱緩沖液(8倍柱體積)活化親和柱填料(流速為1ml/min)，將樣品5倍稀釋后上樣，待樣品都流過親和柱填料后，用12倍柱體積的柱緩沖液沖洗雜蛋白，最后利用5倍柱體積柱緩沖液(10mm麥芽糖)洗脫目標蛋白。利用millpore(30kda)濃縮并置換成酶活反應(yīng)緩沖液。sds-page電泳后，考馬斯亮藍染色，確認重組蛋白(如圖4)。

3)酶活性的測定

一般酶活反應(yīng)體系為50μl，如表5。37℃，反應(yīng)1h后，用等體積甲醇中止反應(yīng)，13,000rpm離心10mins。取20μl上樣。

表5重組蛋白酶活反應(yīng)體系

4)酶活產(chǎn)物分析與鑒定

利用原核表達系統(tǒng)，成功表達了apugt73au1的重組蛋白，進一步酶活分析來鑒定了它們的功能。酶活反應(yīng)的供體包括udp-葡萄糖，受體為新穿心蓮內(nèi)酯苷元和脫水穿心蓮內(nèi)酯。分析酶活產(chǎn)物uplc圖譜(圖5和圖6)，發(fā)現(xiàn)apugt73au1對新穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯具有活性。

uplc條件：

uplc型號：agilent1290infinityⅱ

流動相：a相：0.1％甲酸水溶液；b相：乙腈。

洗脫梯度：0-2min，74％a；2-4min，68％a；4-12min，62％a；12-20min，55％a；20-22min，95％b；22-24min，95％a平衡。

dad檢測波長：203nm。

利用質(zhì)譜鑒定酶活產(chǎn)物(圖7和圖8)，發(fā)現(xiàn)apugt73au1對于受體為新穿心蓮內(nèi)酯苷元和脫水穿心蓮內(nèi)酯的酶活反應(yīng)產(chǎn)物峰只有一個，其質(zhì)荷比均比底物質(zhì)荷比多出162(一個葡萄糖和底物羥基脫去一分子水后，產(chǎn)物增加的分子量)，表明其產(chǎn)物為新穿心蓮內(nèi)酯苷元和脫水穿心蓮內(nèi)酯的單葡萄糖苷。將產(chǎn)物峰與標準品的保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行比對(圖5-圖8)，發(fā)現(xiàn)它們分別為新穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯苷。綜上所述，體外酶活證據(jù)顯示apugt73au1編碼了糖基化新穿心蓮內(nèi)酯苷元和脫水穿心蓮內(nèi)酯的糖基轉(zhuǎn)移酶。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜前的樣品準備，2.5倍體積乙酸乙酯抽提酶活反應(yīng)液中的tris-hcl，n2吹干乙酸乙酯后，50μl甲醇溶解，1μl上樣。

利用6545q-toflc/ms對樣品進行分離，柱子為，eclipseplusc18rrhd(1.8μm，2.1×50mmi.d.；agilent)，流動相與uplc相同，洗脫梯度為0min，95％a；5mins，5％a，最后95％a平衡(5-7mins)，檢測波長同上。

toflc/ms質(zhì)譜條件，電噴霧離子化，全離子掃描，正離子模式positive-ion(pi)質(zhì)譜分析。dualajsesi(seg)：gastemp，325℃；dryinggas，5l/min；nebulizer，35psig；shealthgastemp，350℃；sheathgasflow，11l/min。dualajsesi(expt)：vcap，3500v；nozzlevoltage(expt)，500v。mstof(expt)：fragmentor，130v；skimmer，65v；oct1rfvpp，750v；采集質(zhì)譜范圍m/z：100-1000。

5)apugt73au1的催化活性

為進一步了解apugt73au1重組蛋白的催化特性，我們檢測了它對于新穿心蓮內(nèi)酯苷元(np-a)和脫水穿心蓮內(nèi)酯(dp)的催化活性。酶活反應(yīng)體系，總體積為50μl，其中包括：3.5μgapugt73au1重組蛋白與200μmudp-葡萄糖和50μmnp-a或者dp。37℃反應(yīng)1h后，等體積甲醇終止反應(yīng)后，14000rpm高速離心后，取2μluplc檢測。實驗發(fā)現(xiàn)，apugt73au1重組蛋白對于np-a和dp的催化活性分別為1.0nkat/mg和0.35nkat/mg(圖9)，表明apugt73au1重組蛋白對于dp具有更特異的催化活性。

本發(fā)明主要是通過rnaseq分析，獲得新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶序列，并通過原核表達重組蛋白，確認apugt73au1可以催化新穿心蓮內(nèi)酯的產(chǎn)生。

<110>中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所

江西青峰藥業(yè)有限公司

<120>新穿心蓮內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

<130>p170103-zyy

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1470

<212>dna

<213>穿心蓮（andrographispaniculata(bm.f)nees）

<400>1

atggctctaagtgtaggcgacgacgcgcaggcgccacctcacttcgtcctgttcccgtac60

atggcgcaaggccacatacttcccattgtcgacatcgcacgcctcctcgccgcccgtggc120

gtcgccgccaccatactcttaactccaatcaacagccggcggatcagcccgctgatcgac180

cgcgccgccgcctcagggctgccgattcgcgtcgccttagtcaagttcccttgcgccaaa240

gtcgggctgcccgaaggctgcgagaacttcgacatgctcccttcgacccacgacgccatt300

aaattaacgaccggcgccgccttgatgaaggacgacgtcgaaaacttgctgaaagaccgc360

ctccacccccgcccaacctgcctgatttccgacatgcttcttccatggacgaccaatctg420

gccctcaatttgggcattcctcgcatcgttttccacgggacctcctgtttcgctcacgcc480

atgtggaatgttctagaagcttccgaatccgtcaaggctgtcgcgtcggatacggaatac540

ttcacggtgcccgatttaccggatacagttcagattaccaaagctcagattcgagggacg600

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aaatcgttcggggcagtgttcaacacgttcgaagatctcgagctgaaatacgttgaacac720

tataggaagatacgttgcgaaagggcttggtgcatcgccccggtgtcgatgtgcaataag780

gatgaggtagacaaggctgagaggggcaacagggctgccattgacgagcacaaatgcttg840

acgtggctcgattcgcgcgatcacggttctgttatgttcgtctgccttggaagcttgtcg900

cggatggatgccgggcagatgatcaagctagggttagctttggaggcatcgggacgatct960

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gaaggaatctcggccgggttgcctatggctacgtggccatttttcggcgagcagtttatc1200

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ctcggggaaatggcgagaagggcgacggcggaagacgggttgtcgtacgtggatatgacg1440

aggctcattcaagacgtgcaaaatttttaa1470

<210>2

<211>489

<212>prt

<213>穿心蓮（andrographispaniculata(bm.f)nees）

<400>2

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151015

leupheprotyrmetalaglnglyhisileleuproilevalaspile

202530

alaargleuleualaalaargglyvalalaalathrileleuleuthr

354045

proileasnserargargileserproleuileaspargalaalaala

505560

serglyleuproileargvalalaleuvallyspheprocysalalys

65707580

valglyleuprogluglycysgluasnpheaspmetleuproserthr

859095

hisaspalailelysleuthrthrglyalaalaleumetlysaspasp

100105110

valgluasnleuleulysaspargleuhisproargprothrcysleu

115120125

ileseraspmetleuleuprotrpthrthrasnleualaleuasnleu

130135140

glyileproargilevalphehisglythrsercysphealahisala

145150155160

mettrpasnvalleuglualasergluservallysalavalalaser

165170175

aspthrglutyrphethrvalproaspleuproaspthrvalglnile

180185190

thrlysalaglnileargglythrthrthrglnilethrproasptrp

195200205

tyrvalvalglnglnaspphepheglualagluarglysserphegly

210215220

alavalpheasnthrphegluaspleugluleulystyrvalgluhis

225230235240

tyrarglysileargcysgluargalatrpcysilealaprovalser

245250255

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260265270

alaileaspgluhislyscysleuthrtrpleuaspserargasphis

275280285

glyservalmetphevalcysleuglyserleuserargmetaspala

290295300

glyglnmetilelysleuglyleualaleuglualaserglyargser

305310315320

phevaltrpalavallyslysserthrasngluphelysalatrpleu

325330335

serlysgluasntyrglugluargvallysglyargglyleuleuile

340345350

hisglytrpalaproglnleuleuileleuserhisalaserilegly

355360365

glypheleuthrhiscysglytrpasnserilemetgluglyileser

370375380

alaglyleuprometalathrtrpprophepheglygluglnpheile

385390395400

asnglulyspheleuvalaspvalmetlysthralavalserilegly

405410415

valmetprovalleupheglygluglutyrthrvalglyalahisval

420425430

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