本發(fā)明涉及體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別的，涉及一種用于指導鹽酸右美托咪定用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測的引物組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

鹽酸右美托咪定是一種相對選擇性α2受體激動藥，有鎮(zhèn)靜、抗焦慮、催眠、鎮(zhèn)痛和交感神經(jīng)阻滯作用。右美托咪定幾乎完全被生物轉(zhuǎn)化，極少以原形從尿和糞便中排出。生物轉(zhuǎn)化包括直接葡萄苷酸化和細胞色素p450介導的代謝。右美托咪定的主要代謝途徑是：直接n-葡萄苷酸化成非活性代謝產(chǎn)物；脂肪羥基化作用(主要由cyp2a6介導)產(chǎn)生3-羥基右美托咪定、3-羥基右美托咪定葡糖苷酸和3-羧基右美托咪定；右美托咪定n-甲基化產(chǎn)生3-羥基n-甲基右美托咪定、3-羧基n-甲基右美托咪定和n-甲基o-葡糖苷酸右美托咪定。

關(guān)于cyp2a6的研究發(fā)現(xiàn)，cyp2a6基因全長近6kb，包括9個外顯子，位于19q12-19q13.2之間，它和cyp2a7、cyp2a13以及兩個cyp2a7假基因一起位于一個350kb的基因簇內(nèi)。在cyp2a6的多個等位基因中，具有正常酶活性的等位基因是cyp2a6*1，而cyp2a6*4等位基因編碼的酶缺乏活性。cyp2a6*4等位基因是cyp2a6基因的整體缺失，該缺失位點源于高度相似的cyp2a6和cyp2a7基因的3’端區(qū)域的不等交換，造成一個等位基因缺失，其交換區(qū)域位于第8內(nèi)含子或第9外顯子上。

cyp2a6*4基因是高度多態(tài)性的，大約有40個等位基因變體。這些等位基因是純合子的cyp2a6缺乏活性。cyp2a6*4等位基因頻率在中國人群為15％，芬蘭人為1.0％，西班牙為0.5％，cyp2a6*4等位基因是促成亞洲人群pm表型(cyp2a6基因部分缺失或全部缺失促成pm表型)的主要等位基因。因此在給藥時，應給予含有cyp2a6*4等位基因的患者留有足夠的注意力，以防不良反應的發(fā)生。

目前常用的檢測基因多態(tài)性的方法有dna直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性分析法(pcr－pflp)、高分辨率溶解曲線(hrm)、基因芯片、液相芯片法、熒光定量pcr法等。測序技術(shù)是公認的檢測基因突變的金標準，但其設備成本高、檢測周期長、檢測通量低、檢測靈敏度低、對實驗人員的技術(shù)操作要求高、結(jié)果判定步驟繁瑣等原因，較難形成商業(yè)化的診斷產(chǎn)品；限制性片段長度多態(tài)性分析法檢測靈敏度同樣不高、操作步驟繁瑣，檢測的結(jié)果仍需要進行一代測序法的再次驗證，尤其當樣本量多時極易造成pcr產(chǎn)物的交叉污染容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過度而出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，因此也無法應用到臨床上。芯片檢測因其檢測結(jié)果的準確性和重復性較差，實驗周期長等缺點，也不適于開發(fā)臨床檢測試劑盒。熒光定量pcr的檢測方法擁有成本低、靈敏度高、特異性好，結(jié)果的重復性好等優(yōu)點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種指導鹽酸右美托咪定用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測的引物組、試劑盒及方法，具有操作簡單、檢測快速、準確性高及特異性好等優(yōu)點。

本發(fā)明提供一種用于指導鹽酸右美托咪定用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測的引物組，所述引物組包括特異性引物及探針，如下：

cyp2a6*1正向引物：

5’-aaaatgggcatgaacgccc-3’；

cyp2a6*1反向引物：

5’-gaggggcgcagctaagac-3’；

cyp2a6*4反向引物：

5’-cggaagaggcgggtataagaa-3’；

cyp2a6*1檢測探針：

5’fam-ctttccgccatcct-3’；

cyp2a6*4檢測探針：

5’vic-ctttcccgcatctt-3’。

本發(fā)明還提供一種用于指導鹽酸右美托咪定用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測的試劑盒，包括含有如上文所述的特異性引物及探針的pcr反應液，所述pcr反應液包括cyp2a6*1正向引物、cyp2a6*1反向引物、cyp2a6*4反向引物、cyp2a6*1檢測探針、cyp2a6*4檢測探針、10×pcrbuffer，dntps、hs-taq酶及無核酸酶水。

在本發(fā)明提供的所述試劑盒一較佳實施例中，所述pcr反應液的成分終濃度為：1×pcrbuffer，0.1～0.3μmcyp2a6*1正向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*4反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1檢測探針、0.1～0.3μmcyp2a6*4檢測探針，0.2～0.3mm的dntps，1u的hs-taq酶。

在本發(fā)明提供的所述試劑盒一較佳實施例中，還包括陽性對照品一、陽性對照品二及陽性對照品三；

所述陽性對照品一為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點野生型質(zhì)粒；

所述陽性對照品二為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點野生型與突變型按1：1數(shù)量比雜合的質(zhì)粒；

所述陽性對照品三為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點突變型質(zhì)粒。

在本發(fā)明提供的所述試劑盒一較佳實施例中，還包括空白對照品，所述空白對照品為無核酸酶水。

本發(fā)明還提供一種指導鹽酸右美托咪定用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測多態(tài)性的方法，包括如下步驟：

步驟一：取待檢測樣本抽提的dna，作為pcr模板；

步驟二：提供如上文所述的試劑盒，取出適量pcr反應液，將所述pcr反應液與適量所述pcr模板混勻；

步驟三：進行pcr擴增反應：25℃ung酶處理10min；95℃變性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec；

步驟四：pcr結(jié)果判定：在所述試劑盒的陽性對照品和空白對照品符合規(guī)定的情況下，根據(jù)熒光擴增曲線得到ct值進行結(jié)果判定，得到待測樣本的基因型。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的用于指導鹽酸右美托咪定用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測的引物組、試劑盒及方法的有益效果在于：通過設計特異性高的引物及taqman-mgb熒光檢測探針并通過檢測熒光的釋放和強度來檢測基因多態(tài)性，得到cyp2a6*4的基因型，在給藥時，給予含有cyp2a6*4等位基因的患者更多的注意力，以防不良反應的發(fā)生；此外再配置成使用方便且檢測結(jié)果可靠的試劑盒，設計出科學合理的pcr反應體系，使得本發(fā)明具有操作簡單、檢測快速、準確性高及特異性好的特點。

附圖說明

圖1為臨床樣本cyp2a6*4野生型的pcr擴增曲線圖；

圖2為臨床樣本cyp2a6*4雜合型的pcr擴增曲線圖；

圖3為臨床樣本cyp2a6*4突變型的pcr擴增曲線圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1：試劑盒的制備

一、引物和探針的設計與合成

針對人基因組中cyp2a6*4基因位點(序列參見ncbi數(shù)據(jù)庫公開的人類全基因組序列)，使用primerpremier3.0及methylprimerexpressv1.0軟件，分別設計特異性引物及mgb標記的探針。

特異性引物及探針序列，如表一所示：

表一、特異性引物及探針序列

二、對照品選擇

陽性對照品一為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點野生型質(zhì)粒；

陽性對照品二為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點野生型與突變型按1：1數(shù)量比雜合的質(zhì)粒；

陽性對照品三為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點突變型質(zhì)粒；

空白對照品為無核酸酶水。

三、pcr反應液組成

所述pcr反應液包括cyp2a6*1正向引物、cyp2a6*1反向引物、cyp2a6*4反向引物、cyp2a6*1檢測探針、cyp2a6*4檢測探針、10×pcrbuffer，dntps、hs-taq酶及無核酸酶水。

其中，所述10×pcrbuffer、dntp及無核酸酶水均購自大連寶生物(寶生物(大連)工程有限公司)；所述無核酸酶水為(nuclease-freewater)用depc(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水；hs-taq酶(takarataqhotstartversion，購自大連寶生物)是針對普通taqdna聚合酶靈敏度高，易產(chǎn)生非特異性條帶的情況，專門研制的高特異性嗜熱dna聚合酶產(chǎn)品。

所述pcr反應液成分的終濃度為：1×pcrbuffer，0.1～0.3μmcyp2a6*1正向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*4反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1檢測探針、0.1～0.3μmcyp2a6*4檢測探針，0.2～0.3mm的dntps，1u的hs-taq酶，無核酸酶水適量(將體系補充至18.5ul)。

實施例2：利用上述試劑盒檢測cyp2a6*4基因多態(tài)性的方法

一、生物樣本

本發(fā)明所采用的生物材料均來自湘雅醫(yī)學檢驗所。為2016年6-12月期間在湘雅醫(yī)學檢驗所檢測的500例剩余人群抗凝血。

二、取待檢測樣本抽提的dna，作為pcr模板：

dna提取試劑盒為自主研發(fā)的提取試劑盒《核酸提取或純化試劑》進行提取(備案號：湘長械備20150166)。

1)取無菌的1.5mlep管，加入250ul全血；

2)加750ul細胞裂解液，顛倒混勻5-6次，室溫靜置10min；

3)12000rpm離心1.5min；倒掉上部廢液，收集管底沉淀；

4)依次加入20ul蛋白酶k、250ul裂解液abl，渦旋振蕩10s，65℃水浴15min，期間振蕩混勻2-3次；

5)取出，加入250ul無水乙醇，渦旋振蕩10s，短暫離心5s；

6)將吸附柱插入收集管中，將上一步所得混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中；10,000rpm離心1min；

7)棄收集管中廢液，將吸附柱重新放入收集管；加入500ul洗液i，10,000rpm，1min離心；

8)棄收集管中廢液，加入700ul洗液ii，10,000rpm，1min，離心。棄廢液；(洗液ii使用前需加入無水乙醇至80％)

9)重復步驟8一次；

10)棄流出液，將吸附柱插回收集管，空轉(zhuǎn)離心，13,000rpm，2min；

11)將吸附柱插入到新的ep管中；加入30-100uldna溶解液(65℃預熱可提高dna獲得率)，室溫靜置5min；

12)10,000rpm，1min，離心，棄吸附柱，ep管內(nèi)液體即為dna溶液。2-8℃保存，若需長期保存請置于-20℃或更低溫度。

三、提供所述試劑盒，取出適量pcr反應液，將所述pcr反應液與適量所述pcr模板混勻：

從試劑盒中取出所需數(shù)量pcr反應液連管(每檢測位點的pcr管數(shù)＝樣本數(shù)+1個空白對照+3個陽性對照)；

pcr反應液室溫融解后，瞬時離心，揭開管蓋；

從待檢樣本dna(或?qū)φ掌?中取1.5μl加至pcr反應液中；

振蕩混勻后，瞬時離心10s，將其移至擴增區(qū)。

四、進行pcr擴增反應：25℃ung酶處理10min；95℃變性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec。

使用的pcr儀器為abi7500或杭州博日fqd-96a熒光定量聚合酶鏈式反應(pcr)檢測系統(tǒng)，反應體系為20ul；

pcr反應條件如表二所示：

表二、pcr擴增反應條件

五、pcr結(jié)果判定：在所述試劑盒的陽性對照品和空白對照品符合規(guī)定的情況下，根據(jù)熒光擴增曲線得到ct值進行結(jié)果判定，得到cyp2a6*4的基因型。

結(jié)果有效性判定，如表三所示：

表三

空白對照結(jié)果為陰性(noct或ct值≥38)。

pcr結(jié)果判定，如表四所示：

表四

基于本發(fā)明的臨床樣本各基因位點檢測結(jié)果，參見圖1-圖3，其中圖1為臨床樣本cyp2a6*4野生型的pcr擴增曲線圖，圖2為臨床樣本cyp2a6*4雜合型的pcr擴增曲線圖，圖3為臨床樣本cyp2a6*4突變型的pcr擴增曲線圖。

實施例3：cyp2a6*4的基因型用藥指導

cyp2a6*4通過影響cyp2a6酶含量的表達而改變酶活性或直接導致酶活性的喪失。因此在給藥時，應結(jié)合臨床給予含有cyp2a6*4等位基因的患者留有足夠的注意力，以防不良反應的發(fā)生。由熒光定量pcr中的結(jié)果判定(表四)得出cyp2a6*4的基因型。醫(yī)生根據(jù)cyp2a6基因型和表型對應得的關(guān)系，詳見表五，結(jié)合患者的病理生理特征、合并用藥、臨床表現(xiàn)等其他因素進行綜合判斷以確定最終用藥方案。

表五

本發(fā)明提供的用于指導鹽酸右美托咪定用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測的引物組、試劑盒及方法的有益效果在于：通過設計特異性高的引物及taqman-mgb熒光檢測探針并通過檢測熒光的釋放和強度來檢測基因多態(tài)性，得到cyp2a6*4的基因型，在給藥時，給予含有cyp2a6*4等位基因的患者更多的注意力，以防不良反應的發(fā)生；此外再配置成使用方便且檢測結(jié)果可靠的試劑盒，設計出科學合理的pcr反應體系，使得本發(fā)明具有操作簡單、檢測快速、準確性高及特異性好的特點。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>韓林志

<120>用于指導鹽酸右美托咪定用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測的引物組、試劑盒及方法

<130>2017

<160>5

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

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aaaatgggcatgaacgccc19

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

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gaggggcgcagctaagac18

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<213>人工序列（artificialsequence）

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