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以人CYP2C19*2基因681位點(diǎn)AA型為模板的陽(yáng)性參考品的制作方法

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以人CYP2C19*2基因681位點(diǎn)AA型為模板的陽(yáng)性參考品的制造方法與工藝

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種以人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa型為模板的陽(yáng)性參考品,該陽(yáng)性參考品用于驗(yàn)證cyp2c19*2基因型檢測(cè)試劑盒在應(yīng)用于樣本檢測(cè)時(shí)樣本是否為陽(yáng)性的輔助判斷。



背景技術(shù):

質(zhì)控品是指用于體外診斷的質(zhì)量控制物質(zhì),其具有已知濃度含量的目標(biāo)檢測(cè)物,為使人們確信某一產(chǎn)品或服務(wù)質(zhì)量能滿(mǎn)足規(guī)定的質(zhì)量要求所必須的產(chǎn)品。質(zhì)控品的使用目的是為了驗(yàn)證整個(gè)pcr反應(yīng)過(guò)程具有準(zhǔn)確性、有效性和特異性,并監(jiān)控檢測(cè)系統(tǒng)的狀態(tài)。儀器在正式投入使用后,應(yīng)定期對(duì)其校準(zhǔn),避免由于儀器原因?qū)е碌膶?shí)驗(yàn)偏差。再次,在收到每批新試劑后,應(yīng)首先對(duì)其進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),確證新試劑質(zhì)量后,再用于對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)。

但是據(jù)申請(qǐng)人了解,目前在檢測(cè)突變型人cyp2c19*2基因質(zhì)量控制方面沒(méi)有陽(yáng)性參考品。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明旨在提供一種以人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa型為模板的陽(yáng)性參考品,用于驗(yàn)證被檢樣本中人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa型這一檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確,解決了人cyp2c19*2基因的質(zhì)量檢測(cè)問(wèn)題。

為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種以人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa型為模板的陽(yáng)性參考品,該陽(yáng)性參考品是一種以堿基序列為主要成分的試劑,該堿基序列包含人cyp2c19*2基因片段,所述人cyp2c19*2基因片段為5’-ttacaaccagagcttggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccaggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagta-3’,其中,帶有下劃線的堿基位點(diǎn)是人cyp2c19*2基因的681位點(diǎn),所述681位點(diǎn)用于表征人cyp2c19*2基因的gg型可突變?yōu)槿薱yp2c19*2基因的aa型的位置。

上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下:

1、上述方案中,所述陽(yáng)性參考品中還含有緩沖試劑,該緩沖試劑選自ph為7.6的tris-hcl緩沖液或ph為7.6的te緩沖液。

2、上述方案中,所述陽(yáng)性參考品中含有的人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa型的基因序列是構(gòu)建到質(zhì)粒載體上保存,根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)即可得到,質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程如下:

引物設(shè)計(jì)——pcr擴(kuò)增——割膠回收dna片段——構(gòu)建載體——轉(zhuǎn)化培養(yǎng)——陽(yáng)性克隆鑒定——37℃搖床培養(yǎng)——質(zhì)粒抽提——測(cè)序確認(rèn)堿基序列。

抽提后的質(zhì)粒再配制成所述陽(yáng)性參考品,配制方法如下:

(1)配制稀釋液:加入50%配方量的純化水→加入tris-hcl緩沖液(ph7.6)→加入剩余的純化水(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得0.002mol/l的tris-hcl(ph7.6)稀釋液;

(2)人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa純合載體質(zhì)粒預(yù)稀釋?zhuān)杭尤?0%配方量的所述稀釋液→加入人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa純合載體質(zhì)粒溶液→加入剩余的所述稀釋液(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得到x拷貝/微升人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa純合質(zhì)粒溶液(x代表質(zhì)粒濃度的具體數(shù)值);

(3)得到陽(yáng)性參考品:加入50%配方量的稀釋液→加入x拷貝/微升人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa純合質(zhì)粒溶液→加入剩余的稀釋液(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得到陽(yáng)性參考品。

本發(fā)明的特點(diǎn)以及有益效果是:所述陽(yáng)性質(zhì)控品實(shí)質(zhì)是事先設(shè)計(jì)好的、當(dāng)做已知濃度及堿基序列的樣本,和其他被檢樣本(即人全血)一起利用相關(guān)的cyp2c19*2基因型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),從而驗(yàn)證被檢樣本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。也就是說(shuō),在利用cyp2c19*2基因型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)被檢樣本時(shí),本發(fā)明的陽(yáng)性參考品相當(dāng)于是一種已知濃度的陽(yáng)性樣本,用于驗(yàn)證cyp2c19*2基因型檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果是否真實(shí)、有效,解決了人cyp2c19*2基因的質(zhì)量檢測(cè)問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

附圖1為人cyp2c19*2基因的681位點(diǎn)為gg型時(shí)的熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線圖,橫坐標(biāo)是溫度,縱坐標(biāo)是熒光微分值;

附圖2為人cyp2c19*2基因的681位點(diǎn)為aa型時(shí)的熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線圖,橫坐標(biāo)是溫度,縱坐標(biāo)是熒光微分值;

附圖3為人cyp2c19*2基因的681位點(diǎn)為ga型時(shí)的熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線圖,橫坐標(biāo)是溫度,縱坐標(biāo)是熒光微分值;

附圖4為空白對(duì)照時(shí)的熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線圖,橫坐標(biāo)是溫度,縱坐標(biāo)是熒光微分值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:

實(shí)施例:一種以人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa型為模板的陽(yáng)性參考品

gg型陽(yáng)性參考品是一種以堿基序列為主要成分的試劑,該堿基序列包含人cyp2c19*2基因片段,所述人cyp2c19*2基因片段為5’-ttacaaccagagcttggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccgggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagta-3’(如seqno:4所示),其中,帶有下劃線的堿基位點(diǎn)是人cyp2c19*2基因的681位點(diǎn),所述681位點(diǎn)用于表征人cyp2c19*2基因的gg型可突變?yōu)槿薱yp2c19*2基因的aa型的位置。所述gg型陽(yáng)性參考品中還含有緩沖試劑,該緩沖試劑為ph為7.6的tris-hcl緩沖液。

aa型陽(yáng)性參考品是一種以堿基序列為主要成分的試劑,該堿基序列包含人cyp2c19*2基因片段,所述人cyp2c19*2基因片段為5’-ttacaaccagagcttggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccaggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagta-3’(如seqno:5所示),其中,帶有下劃線的堿基位點(diǎn)是人cyp2c19*2基因的681位點(diǎn),所述681位點(diǎn)用于表征人cyp2c19*2基因的gg型可突變?yōu)槿薱yp2c19*2基因的aa型的位置。所述aa型陽(yáng)性參考品中還含有緩沖試劑,該緩沖試劑為ph為7.6的tris-hcl緩沖液。

ga型陽(yáng)性參考品是通過(guò)所述gg型陽(yáng)性參考品與aa型陽(yáng)性參考品按等體積混合配制而成。所述gg型陽(yáng)性參考品中含有g(shù)g純合型dna序列的濃度為500拷貝/微升,所述aa型陽(yáng)性參考品中含有aa純合型dna序列的濃度為500拷貝/微升,那么,所述ga型陽(yáng)性參考品中含有g(shù)g純合型dna序列和aa純合型dna序列的濃度均為500拷貝/微升。

所述gg型陽(yáng)性參考品、aa型陽(yáng)性參考品以及ga型陽(yáng)性參考品作為cyp2c19*2基因型檢測(cè)試劑盒中的一部分。

在本實(shí)施例中,cyp2c19*2基因型檢測(cè)試劑盒包括koddna聚合酶、上游引物、下游引物、特異性靶向熒光探針、gg型陽(yáng)性參考品、aa型陽(yáng)性參考品以及ga型陽(yáng)性參考品;

所述上游引物為針對(duì)人cyp2c19*2基因設(shè)計(jì)的上游引物,上游引物的序列為5’-accagagcttggcatattgtatctatacc-3’(如seqno:1所示);

所述下游引物為針對(duì)人cyp2c19*2基因設(shè)計(jì)的下游引物,下游引物的序列為5’-ccaaaatatcactttccataaaagcaag-3’(如seqno:2所示);

所述特異性靶向熒光探針是帶有人cyp2c19*2基因的特異性配對(duì)序列的探針,其堿基序列為5’-ttgattatttcccaggaacc-3’(如seqno:3所示),熒光染料為氟硼二吡咯。

所述cyp2c19*2基因型檢測(cè)試劑盒還包括陽(yáng)性質(zhì)控品,陽(yáng)性質(zhì)控品是一種以堿基序列為主要成分的試劑,陽(yáng)性質(zhì)控品是通過(guò)所述gg型陽(yáng)性參考品與aa型陽(yáng)性參考品按等體積混合配制而成,所述陽(yáng)性質(zhì)控品含有g(shù)g純合型dna序列和aa純合型dna序列的濃度均為1000拷貝/微升。

所述陽(yáng)性質(zhì)控品是事先設(shè)計(jì)好的、當(dāng)做已知濃度及堿基序列的樣本,和其他被檢樣本一起進(jìn)行檢測(cè),它作為試劑盒的一部分,與其他試劑配套使用,用于用戶(hù)驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在實(shí)際生產(chǎn)中,所述cyp2c19*2基因型檢測(cè)試劑盒可以做成包含下列組分的試劑盒:

(1)聚合酶試劑[kodmix]:由koddna聚合酶、dntp等組成,規(guī)格為140μl×2支、140μl×4支或140μl×6支;

(2)引物?探針試劑[cyp2c19*2mix]:即由上游引物、下游引物以及特異性靶向熒光探針組成的混合試劑,規(guī)格為140μl×1支、140μl×2支或140μl×3支;

(3)gg型陽(yáng)性參考品、aa型陽(yáng)性參考品以及ga型陽(yáng)性參考品,規(guī)格均為100μl×1支;

(4)陽(yáng)性質(zhì)控品,規(guī)格為150μl×1支。

其中,gg型陽(yáng)性參考品、aa型陽(yáng)性參考品以及ga型陽(yáng)性參考品中的dna序列均是構(gòu)建到載體質(zhì)粒上保存,原始質(zhì)粒購(gòu)置于生工生物工程(上海)股份有限公司,載體質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程屬于現(xiàn)有技術(shù),具體過(guò)程如下:

引物設(shè)計(jì)——pcr擴(kuò)增——割膠回收dna片段——構(gòu)建載體——轉(zhuǎn)化培養(yǎng)——陽(yáng)性克隆鑒定——37℃搖床培養(yǎng)——質(zhì)粒抽提——測(cè)序確認(rèn)堿基序列。

抽提后的質(zhì)粒再配制成所述gg型陽(yáng)性參考品,配制方法如下:

(1)配制稀釋液:加入50%配方量的純化水→加入tris-hcl緩沖液(ph7.6)→加入剩余的純化水(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得0.002mol/l的tris-hcl(ph7.6)稀釋液;

(2)人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)gg純合載體質(zhì)粒預(yù)稀釋?zhuān)杭尤?0%配方量的所述稀釋液→加入人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)gg純合載體質(zhì)粒溶液→加入剩余的所述稀釋液(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得到x拷貝/微升人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)gg純合質(zhì)粒溶液(x代表質(zhì)粒濃度的具體數(shù)值);

(3)得到gg型陽(yáng)性參考品:加入50%配方量的稀釋液→加入x拷貝/微升人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)gg純合質(zhì)粒溶液→加入剩余的稀釋液(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得到gg型陽(yáng)性參考品。

抽提后的質(zhì)粒再配制成所述aa型陽(yáng)性參考品,配制方法如下:

(1)配制稀釋液:加入50%配方量的純化水→加入tris-hcl緩沖液(ph7.6)→加入剩余的純化水(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得0.002mol/l的tris-hcl(ph7.6)稀釋液;

(2)人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa純合載體質(zhì)粒預(yù)稀釋?zhuān)杭尤?0%配方量的所述稀釋液→加入人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa純合載體質(zhì)粒溶液→加入剩余的所述稀釋液(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得到x拷貝/微升人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa純合質(zhì)粒溶液(x代表質(zhì)粒濃度的具體數(shù)值);

(3)得到aa型陽(yáng)性參考品:加入50%配方量的稀釋液→加入x拷貝/微升人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa純合質(zhì)粒溶液→加入剩余的稀釋液(渦旋震蕩3次,每次5秒)→得到aa型陽(yáng)性參考品。

檢測(cè)方法包括以下步驟:

第一步,準(zhǔn)備被檢樣本,以被檢樣本作為檢測(cè)的對(duì)象,被檢樣本為人全血;用樣本溶解液把采集的人全血稀釋25倍后,作為所述被檢樣本;其中,所述樣本溶解液是由緩沖液和純化水組成,緩沖液與純化水的體積比為1:99,緩沖液為ph為7.6的tris-hcl緩沖液;

第二步,以所述被檢樣本為模板基因鏈,利用所述試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng),熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為:

上游引物0.1μmol/l,1.4μl;

下游引物0.1μmol/l,1.4μl;

特異性靶向熒光探針0.1μmol/l,1.0μl;

mgcl2*6h2o0.35g/l,1.4μl;

dntps0.02mm,0.4μl;

koddna聚合酶0.02u/μl,0.4μl;

kodbuffer3.2μl;

模板4μl;

在上述熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中,在各組分的使用濃度不變的前提下,各組分的體積用量最多可為上述數(shù)值的2倍,即上游引物的所用體積為2.8μl,下游引物的所用體積為2.8μl,特異性靶向熒光探針的所用體積為2.0μl,mgcl2*6h2o的所用體積為2.8μl,dntps的所用體積為0.8μl,koddna聚合酶的所用體積為0.8μl,kodbuffer的所用體積為6.4μl,模板的所用體積為8μl;

所述熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)過(guò)程如下:

(1)94.0℃預(yù)變性30.0秒,

(2)97.0℃變性1.0秒,

(3)60.0℃退火3.0秒,

(4)63.0℃延伸5.0秒,其中,步驟(2)~(4)循環(huán)50次;

第三步,用高分辨率熔解曲線法進(jìn)行檢出,檢出條件依次為:

(1)94.0℃,30.0秒,

(2)39.0℃,30.0秒,

(3)40.0~75.0℃,0.09℃/秒;

直接在全自動(dòng)基因分析儀genecube(生產(chǎn)商為toyobo)上進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)和檢測(cè)。具體步驟為:將被檢樣本4μl、聚合酶試劑[kodmix]4μl、引物?探針試劑[hpcmix]5.2μl混合后,調(diào)制成反應(yīng)液。專(zhuān)用吸管吸取反應(yīng)液到專(zhuān)用塑料毛細(xì)管中。進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。進(jìn)行檢出,測(cè)定波長(zhǎng)為510nm~550nm的熒光值。測(cè)定的熒光值由專(zhuān)用分析軟件解析,轉(zhuǎn)換成表示熒光變化量的熒光微分值。解析熒光微分值,在顯示屏上顯示測(cè)定結(jié)果。

第四步,檢出結(jié)果通過(guò)陽(yáng)性判斷值來(lái)判斷,陽(yáng)性判斷值的三種結(jié)果的判斷依據(jù)為:

(1)cyp2c19*2基因的681位點(diǎn)為gg純合子:熒光微分值≥7,并且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在48.7℃~54.1℃之間,參見(jiàn)附圖1所示;

(2)cyp2c19*2基因的681位點(diǎn)為aa純合子:熒光微分值≥5,并且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在56.3℃~60.7℃之間,參見(jiàn)附圖2所示;

(3)cyp2c19*2基因的681位點(diǎn)為ga雜合子:熒光微分值≥7,并且熔解曲線峰值所在的溶解溫度在48.7℃~54.1℃之間;同時(shí),熒光微分值≥5,且熔解曲線峰值所在的溶解溫度在56.3℃~60.7℃之間,參見(jiàn)附圖3所示。

所述熒光微分值是指對(duì)檢測(cè)到的目標(biāo)物的熒光強(qiáng)度隨溫度變化的值做微分求導(dǎo),得到熒光微分值。

上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn),其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施,并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>踏石生物科技(蘇州)有限公司

<120>以人cyp2c19*2基因681位點(diǎn)aa型為模板的陽(yáng)性參考品

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