本發(fā)明涉及一種熱休克蛋白90抑制劑及其應(yīng)用，具體涉及一種四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑及其制備方法和應(yīng)用，屬于有機化合物合成與醫(yī)藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
熱休克蛋白90(hsp90)是生物進(jìn)化過程中一類結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白質(zhì)。作為分子伴侶，hsp90在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用。近年來的研究證明，hsp90與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)行為及其預(yù)后有密切的關(guān)系，很多癌基因蛋白均為hsp90的作用靶點。而hsp90抑制劑將促使在腫瘤生長信號通路中起重要作用的hsp90效應(yīng)蛋白降解，從而阻斷腫瘤增殖信號通路的多個靶點，有效阻止腫瘤的生長。體內(nèi)外實驗也證實hsp90抑制劑的抗腫瘤活性。同時基于相關(guān)結(jié)構(gòu)的小分子抑制劑的設(shè)計也引起日益廣泛的關(guān)注。
發(fā)明人在前期的研究中，為了發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的強效hsp90抑制劑，通過理性設(shè)計和進(jìn)一步的化合物結(jié)構(gòu)修飾發(fā)現(xiàn)了先導(dǎo)化合物lcp1074具有較強的hsp90抑制活性(chuan-pengliang，europeanjournalofmedicinalchemistry121(2016)272e282)。其中l(wèi)cp1074結(jié)構(gòu)式如下：
基于對該化合物進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾，有望得到了一類hsp90抑制活性和抗細(xì)胞增殖活性都有很大提高的化合物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)，本發(fā)明要解決的問題是提供一種四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明所述的四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑，其特征在于：所述熱休克蛋白90抑制劑是具有通式(ⅰ)的化合物，或其光學(xué)異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體或其消旋體混合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，溶劑合物或前藥；
其中：
r1選自氫基，鹵素，或c1-8烷基；
r2與r3各自獨立選自氫基，氘基，或膦酸基；
ar選自取代的芳香環(huán)；芳香環(huán)選自苯環(huán)、五元芳雜環(huán)、六元芳雜環(huán)、六元并五元雜環(huán)、六元并六元雜環(huán)、五元并五元雜環(huán)、苯并五元雜環(huán)或各種取代的苯并六元雜環(huán)；取代表示單取代、雙取代或三取代；取代基選自氫原子烴基，鹵素，羥基，氨基，二甲氨基，硝基，c1-8烷氧基，c1-8雜烷氧基，三氟甲氧基，氰基，羧基，磺酸基或磷酸基，或者是其酯或鹽；
苯環(huán)a任選被氫基，一個或多個r4x基團取代；
x選自n、o、s原子或酰基；
r4選自氫基，c1-8烷基或5-6個環(huán)成員的環(huán)烷基，取代基選自c1-2烷氧基，單-或二-c1-2烷基氨基，5-6個環(huán)成員的含氮或含氧雜環(huán)基，羥基，氨基，硝基，氰基，酰胺基，甲磺酰氨基，甲基砜基，異羥肟酸基，甲氧羰基，酰肼基，羧基，磺酸基，磷酸基，或者是其酯或鹽；
*是立體構(gòu)型為s或r光學(xué)純度或其消旋體。
進(jìn)一步的，上述熱休克蛋白90抑制劑優(yōu)選是下述化合物之一：
r1選自鹵素；r2與r3均為氫基；苯環(huán)a的7位被r4x基團取代；x選自o原子；*是立體構(gòu)型為r光學(xué)純度。
最優(yōu)選的實施方式是：所述熱休克蛋白90抑制劑是化合物l10、l15、l22或l41，其化學(xué)名稱順序是：
r-2-(5-氯-2，4-二羥基苯甲酰基)-3-(n-對氰基芐基-酰胺基)-1，2，3，4-四氫異喹啉(l10)；
r-2-(5-氯-2，4-二羥基苯甲?；?-3-(n-(吡啶-4-甲基)-酰胺基)-1，2，3，4-四氫異喹啉(l15)；
r-2-(5-氯-2，4-二羥基苯甲酰基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-3-(n-(吡啶-4-甲基)-酰胺基)-1，2，3，4-四氫異喹啉(l22)；
r-2-(5-氯-2，4-二羥基苯甲?；?-7-(2-嗎啉代乙氧基)-3-(n-對氰基芐基-酰胺基)-1，2，3，4-四氫異喹啉(l41)。
上述四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑的制備方法是如下合成路線1或合成路線2，具體的反應(yīng)步驟和反應(yīng)式如下：
合成路線1：
以2，4-二羥基苯甲酸甲酯、光學(xué)純度的四氫異喹琳-3-羧酸為起始原料。2，4-二羥基苯甲酸甲酯經(jīng)3位氯代、芐基保護(hù)后水解，與四氫異喹琳-3-羧酸甲酯成酰胺，再經(jīng)酯水解后與各種胺反應(yīng)，再脫芐基得到目標(biāo)化合物l1-20；反應(yīng)式如下：
其中，ar選自取代的芳香環(huán)；芳香環(huán)選自苯環(huán)、五元芳雜環(huán)、六元芳雜環(huán)、六元并五元雜環(huán)、六元并六元雜環(huán)、五元并五元雜環(huán)、苯并五元雜環(huán)或各種取代的苯并六元雜環(huán)；取代表示單取代、雙取代或三取代；取代基選自氫原子烴基，鹵素，羥基，氨基，二甲氨基，硝基，c1-8烷氧基，c1-8雜烷氧基，三氟甲氧基，氰基，羧基，磺酸基或磷酸基，或者是其酯或鹽；
上述合成路線反應(yīng)式中的試劑：(a)磺酰氯，無水二氯甲烷；(b)芐溴，碳酸鉀，n,n-二甲基甲酰胺；(c)氫氧化鉀水溶液，甲醇；(d)二氯亞砜，甲醇；(e)1-羥基苯并三唑,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽,二氯甲烷；(f)氫氧化鈉水溶液，甲醇；(g)各種芳環(huán)甲基胺類，1-羥基苯并三唑,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽,n,n-二甲基甲酰胺；(h)三氯化硼，無水二氯甲烷。
合成路線1的目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式如下：
合成路線2：
以光學(xué)純的3,5-二碘酪氨酸為原料，經(jīng)pictet-spengler環(huán)合得到化合物10，化合物10相繼經(jīng)boc保護(hù)仲胺基、氫化還原脫碘得到關(guān)鍵中間體12。中間體12與各種芳香甲基胺經(jīng)多肽縮合連接不同的ar基團得到化合物13.13脫boc分別與中間體4縮合得到相應(yīng)的化合物15?；衔?5與各種鹵代物或醇經(jīng)威廉姆森縮合反應(yīng)或光延反應(yīng)成醚，再脫芐基得到目標(biāo)化合物l21-45；反應(yīng)式如下：
其中，ar選自取代的芳香環(huán)；芳香環(huán)選自苯環(huán)、五元芳雜環(huán)、六元芳雜環(huán)、六元并五元雜環(huán)、六元并六元雜環(huán)、五元并五元雜環(huán)、苯并五元雜環(huán)或各種取代的苯并六元雜環(huán)；取代表示單取代、雙取代或三取代；取代基選自氫原子烴基，鹵素，羥基，氨基，二甲氨基，硝基，c1-8烷氧基，c1-8雜烷氧基，三氟甲氧基，氰基，羧基，磺酸基或磷酸基，或者是其酯或鹽；r4選自氫基，c1-8烷基或5-6個環(huán)成員的環(huán)烷基，取代基選自c1-2烷氧基，單-或二-c1-2烷基氨基，5-6個環(huán)成員的含氮或含氧雜環(huán)基，羥基，氨基，硝基，氰基，酰胺基，甲磺酰氨基，甲基砜基，異羥肟酸基，甲氧羰基，酰肼基，羧基，磺酸基，磷酸基，或者是其酯或鹽；
上述合成路線反應(yīng)式中的試劑：(a)多聚甲醛，濃鹽酸，乙二醇二甲醚；(b)lmol/l的氫氧化鈉溶液,碳酸二叔丁酯，四氫呋喃；(c)鈀碳，氫氣，三乙胺，甲醇；(d)各種芳環(huán)甲基胺類，1-羥基苯并三唑,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽,n,n-二甲基甲酰胺；(e)三氟乙酸，三乙胺,二氯甲烷；(f)中間體4，1-羥基苯并三唑,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽,n,n-二甲基甲酰胺；(g)各種鹵代物，碳酸銫,n,n-二甲基甲酰胺；(h)三氯化硼，無水二氯甲烷。
合成路線2的目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式如下：
上述化合物制備的具體操作步驟在實施例中將加以詳細(xì)說明。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對上述步驟進(jìn)行變動以提高收率，他們可據(jù)本領(lǐng)域的基本知識確定合成的路線，如選擇反應(yīng)物，溶劑和溫度，可以通過使用各種常規(guī)保護(hù)基以避免副反應(yīng)的發(fā)生從而提高收率。
本發(fā)明所述四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑在制備預(yù)防或治療與熱休克蛋白90相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
其中：所述與熱休克蛋白90相關(guān)的疾病是：癌癥，神經(jīng)變性疾病，病毒感染，炎癥，白血病，瘧疾或糖尿病。
本發(fā)明還公開了一種適于口服給予哺乳動物的預(yù)防或治療與熱休克蛋白90相關(guān)疾病的藥物組合物，其特征在于：該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明所述四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑和一種或多種藥學(xué)上可接受載體或賦形劑。
本發(fā)明還公開了一種適于胃腸外給予哺乳動物的預(yù)防或治療與熱休克蛋白90相關(guān)疾病的藥物組合物，其特征在于：該藥物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求1、2或3所述四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑和一種或多種藥學(xué)上可接受載體或賦形劑。
上述載體可以是鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇或它們的結(jié)合物；或者是固體載體乳糖，石膏粉，蔗糖，滑石，凝膠，瓊脂，果膠，阿拉伯膠，硬脂酸鎂或硬脂酸等等。
本發(fā)明基于對化合物lcp1074進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾，篩選獲得了一類hsp90抑制活性和抗細(xì)胞增殖活性有顯著提高的化合物，提供了一種四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑，以及適于口服給予哺乳動物的或適于胃腸外給予哺乳動物的預(yù)防或治療與熱休克蛋白90相關(guān)疾病的藥物組合物。實驗證實：本發(fā)明的四氫異喹琳-3-羧酸類熱休克蛋白90抑制劑對多種組織類型包括乳腺，生殖和呼吸系統(tǒng)來源的腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，但對人正常肝細(xì)胞毒性小，具有較好的成藥性。臨床應(yīng)用前景廣闊。
附圖說明
圖1：化合物l15胞內(nèi)抑制hsp90活性評價。
具體實施方式
為使本領(lǐng)域相關(guān)研究人員能夠全面理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例來闡述本發(fā)明的幾種實施方式，盡管相關(guān)描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此來限制本發(fā)明。
實施例1：化合物l1-20的合成，以l1為例。
1)5-氯-2,4-二羥基苯甲酸甲酯2
將化合物1即2,4-二羥基苯甲酸甲酯(8.0g,47.6mmol)溶于無水二氯甲烷中，冷卻至0℃后加入磺酰氯(4.0ml,49.4mmol),室溫攪拌13小時后，再次加入磺酰氯(2ml,24.7mmol)，攪拌6小時后加入飽和nahco3(7.5ml)猝滅反應(yīng)。萃取收集有機相，水相用二氯甲烷萃取三次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑后硅膠柱層析純化得白色固體化合物2共5.78g，收率：60％。1hnmr(600mhz,cdcl3,r.t.)δ10.82(s,1h),7.82(s,1h),6.61(s,1h),5.94(s,1h),3.93(s,3h).
2)2,4-二芐氧基-5-氯-苯甲酸甲酯3
將化合物2(5.78g,28.56mmol)和碳酸鉀(8.68g,62.83mmol)溶于50ml的dmf,攪拌5分鐘后加入8.20ml芐溴。60℃下反應(yīng)6小時,冷卻至室溫后，加入水和乙酸乙酯，萃取分層，有機相用飽和食鹽水洗,無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑后硅膠柱層析純化得9.43g白色固體3。收率:86.2％。1hnmr(600mhz,cdcl3,r.t.)δ7.94(s,1h),7.44-7.31(m,10h),6.56(s,1h),5.12(s,2h),5.10(s,2h),3.87(s,3h).hresims:m/z405.0869[m+na]+(calcd.405.0870).
3)2,4-二芐氧基-5-氯-苯甲酸4
將化合物3(9.43g，24.62mmol)加到50ml的甲醇后，加入20ml氫氧化鉀(7.06g)的水溶液,回流攪拌24小時。反應(yīng)液冷卻至室溫后，加入5％的鹽酸液至酸性后，乙酸乙酯萃取，有機相用飽和食鹽水處理，無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑得白色固體4共8.8g,收率：97％。1hnmr(600mhz,cdcl3,r.t.)δ8.19(s,1h),7.41-7.36(m,10h),6.61(s,1h),5.19(s,2h),5.18(s,2h).hresims:m/z367.0739[m-h]-(calcd.367.0737).
4)1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸甲酯鹽酸鹽6
將化合物5(4.27g,20mmol)加到20ml甲醇中，冷卻至0℃后滴入5.2ml二氯亞砜,室溫攪拌100小時后，減壓旋干，殘留物用乙醚洗滌，干燥后得到4.3g淡黃色固體化合物6，收率：94.4％。1hnmr(300mhz,d2o,r.t.)δ7.45-7.24(m,4h),4.60(d,j＝5.5hz,1h),4.56(d,j＝5.4hz,1h),4.53(brs,1h),3.93(s,3h),3.53(dd,j＝17.4,5.5hz,1h),3.53(dd,j＝17.4,5.5hz,1h),3.32(dd,j＝17.3,10.9hz,1h),3.32(dd,j＝17.3,10.9hz,1h).hresims:m/z192.1028[m+h]+(calcd.192.1025).
5)2-(2,4-二芐氧基-5-氯-苯甲酰基)-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸甲酯7
化合物4(2.213g,6mmol)與化合物6(1.639g,7.2mmol)溶于30ml無水二氯甲烷中，依次加入1-羥基苯并三唑(hobt,0.973g,7.2mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edci,1.38g,7.2mmol)、n-甲基嗎啉(nmm,2.012ml,18mmol),室溫攪拌12小時。反應(yīng)液依次用水、5％的鹽酸溶液、飽和nahco3、飽和食鹽水處理，分離有機相，無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑后硅膠柱層析純化得2.89g化合物7,收率：81％.1hnmr(300mhz,cdcl3,r.t)δ7.52–7.05(m,16h),5.30–5.12(m,4h),4.41(s,1h),3.59–3.45(m,2h),3.30(s,3h),3.14–3.00(m,2h).hresims:m/z542.1731[m+h]+(calcd.542.1734).
6)r-2-(2,4-二芐氧基-5-氯-苯甲?；?-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸8
將化合物7(2.89g,5.338mmol)溶于16ml的甲醇中，加入0.62ml2mol/l的氫氧化鈉水溶液。室溫攪拌12h。反應(yīng)完畢后加酸液調(diào)ph值到弱酸，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥后蒸干得2.68g化合物8,收率：95％.1hnmr(300mhz,cdcl3,r.t)δ12.85(s,1h),7.52–7.05(m,16h),5.30–5.12(m,4h),4.41(s,1h),3.59–3.45(m,2h),3.14–3.00(m,2h).hresims:m/z526.1418[m-h]-(calcd.526.1421).
7)r-2-(5-氯-2，4-二羥基苯甲酰基)-3-(n-對氯芐基-酰胺基)-1，2，3，4-四氫異喹啉l1
化合物8(100mg,0.19mmol)、1-羥基苯并三唑(hobt,30.8mg,0.228mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edci,43.7mg,0.228mmol)溶于3mldmf中,攪拌3分鐘后加入115μl的對氯芐胺，室溫攪拌12小時。反應(yīng)液依次用水、飽和nahco3、5％的鹽酸溶液、飽和食鹽水處理，分離有機相，無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑,所得化合物不經(jīng)純化直接用于下一步。所得化合物溶于無水二氯甲烷中，n2保護(hù)下冷卻至0℃后加入0.57ml三氯化硼溶液(3eq)，20min后室溫攪拌2小時，冰浴下加入飽和碳酸氫鈉溶液至弱堿，猝滅反應(yīng)，移走二氯甲烷層,乙酸乙酯萃取水相，鹽水洗，無水na2so4干燥，蒸干溶劑后硅膠柱層析純化得81.3mg白色固體a1.產(chǎn)率：76％。1hnmr(400mhz,acetone)δ7.70(brs,1h),7.36(s,1h),7.27–7.20(m,3h),7.19(brs,1h),7.10(s,1h),7.09(s,1h),7.04-7.00(m,1h),6.88(brs,1h),6.61(s,1h),5.14(brs,1h),4.80-4.70(m,2h),4.37(dd,j＝15.2,5.7hz,1h),4.28(dd,j＝15.3,5.3hz,1h),3.37(dd,j＝15.4,4.9hz,1h),3.27(dd,j＝15.5,6.0hz,1h).hresims:m/zfor471.0846[m+h]+,(calcd.471.0878)。
實施例2：化合物l21-45的合成，以l21為例。
1)r-7-羥基-6,8-二碘-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸鹽酸鹽10
向8ml濃鹽酸中加入3,5-二碘-d-酪氨酸(1.0g,2.31mmol),乙二醇二甲醚(0.7ml)和多聚甲醛(0.26g,8.67mmol),并逐漸升溫至72℃。0.5小時后,再加入濃鹽酸(1.7ml),乙二醇二甲醚(0.33ml)和多聚甲酸(0.17g,5.78mmol),油浴控溫在72-75℃繼續(xù)反應(yīng)18小時。反應(yīng)混懸液冰浴冷卻并過濾,濾餅用乙二醇二甲醚充分洗漆,干燥后得0.53g淡黃色粉末。1hnmr(300mhz,dmso-d6,r.t)δ3.07(dd,j＝16.8hz,10.8hz,1h),3.22(dd,j＝16.8hz,4.8hz,1h),4.02(d,j＝16.2hz,1h),4.15(d,j＝16.2hz,1h),4.32(dd,j＝4.8hz,10.8hz,1h),7.73(s,1h),9.68(s,1h),10.00(brs,2h),14.17(brs,1h),esi-msm/z:446.2[m+h]+
2)r-2-叔丁氧羰基7-羥基-6,8-二碘-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸鹽酸鹽11
化合物10(0.53g)溶于2.5mllmol/l的氧氧化鈉溶液中,并加入0.6ml碳酸二叔丁酯(0.27g)的四氫呋喃溶液。反應(yīng)過程中用1mol/l的氫氧化鈉溶液控制反應(yīng)液ph在9-11。室溫反應(yīng)6小時后,蒸除反應(yīng)液中的四氫呋喃,再用石油酸將反應(yīng)液萃取3次,并用1mol/l的檸檬酸溶液酸化至ph4-5,然后用乙酸乙酯萃取三次,有機相合并后用飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑得0.8g黃色粉末11。產(chǎn)率:92％,1hnmr(300mhz,dmso-d6,r.t)δ1.34+1.40(s,9h),2.87-3.00(m,2h),4.13-4.41(m,2h),4.61-4.75(m,1h),7.57(s,1h),9.41(brs,1h),12.71(brs,1h)。
3)r-2-叔丁氧羰基7-羥基-1,2,3,4-四氧異喹啉-3-羧酸鹽酸鹽12
化合物11(0.8g)溶于10ml無水甲醇中,并向其中加入三乙胺(480μl)和10％鈀碳(0.08g)。通入氫氣反應(yīng)5小時后,用硅藻土濾除催化劑,蒸除甲醇,加入1mol/l的檸檬酸溶液至ph4-5,然后用乙酸乙酯萃取三次,合并乙酸乙酯層后用飽和食鹽水洗漆,無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑得0.36g黃色粉末12。產(chǎn)率:75％,1hnmr(300mhz,dmso-d6,r.t)δ1.39+1.45(s,9h),2.92-3.04(m,2h),4.26-4.51(m,2h),4.57-4.82(m,1h),6.52(s,1h),6.57(d,j＝8.4hz,1h),6.97(d,j＝8.4hz,1h),9.28(s,1h),12.60(s,1h)。
4)r-2-叔丁氧羰基-7-羥基-3-(n-(吡啶-4-甲基)-酰胺基)-1,2,3,4-四氫異喹啉13
化合物12(0.36g)、4-甲氨基吡啶(500μl)溶于10ml的dmf中，依次加入1-羥基苯并三唑(hobt,0.2g)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edci,0.28g),室溫攪拌12小時。反應(yīng)液依次用水、飽和nahco3、10％的擰檬酸溶液、飽和食鹽水處理，分離有機相，無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑后硅膠柱層析的白色固體0.26g.產(chǎn)率:75％,1hnmr(300mhz,acetone-d6,r.t)δ1.39+1.45(s,9h),2.92-3.04(m,2h),3.57-3.82(m,2h),4.26-4.51(m,2h),4.57-4.82(m,1h),6.72-6.80(m,4h),7.02(d,j＝8.1hz,1h),7.68(s,1h),8.31-8.37(m,2h).
5)r-2-(2,4-二芐氧基-5-氯-苯甲酰基)-7-羥基-3-(n-(吡啶-4-甲基)-酰胺基)-1，2，3，4-四氫異喹啉14
向化合物13(410mg)的3ml二氯甲燒溶液中加入1ml三氟乙酸,反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入過量三乙胺至堿性待用。向溶有中間體4(413mg,1eq)的3ml無水四氧呋喃溶液中,加入三乙胺,1-羥基苯并三唑(hobt,182mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edci258mg),室溫攪拌15分鐘后,將此反應(yīng)液倒入上述二氯甲院溶液中。反應(yīng)過夜后蒸除溶劑,加入乙酸乙酯,依次用水、飽和nahco3、飽和食鹽水處理，分離有機相，無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑后硅膠柱層析的白色固體600mg.
7)r-2-(5-氯-2，4-二羥基苯甲?；?-7-甲氧基-3-(n-對氯芐基-酰胺基)-1，2，3，4-四氫異喹啉l21
化合物14(50mg,)的4mldmf溶液中加入碳酸銫粉末(150mg,)和n-(2-氯乙基)嗎啉鹽酸鹽(37mg),室溫攪拌過夜后乙酸乙酯萃取三次,合并乙酸乙酯層后用飽和食鹽水洗漆,無水硫酸鎂干燥,蒸干溶劑得產(chǎn)物粗品。所得化合物不經(jīng)純化直接用于下一步。所得化合物溶于無水二氯甲烷中，n2保護(hù)下冷卻至0℃后加入0.57ml三氯化硼溶液，20min后室溫攪拌2小時，冰浴下加入飽和碳酸氫鈉溶液至弱堿，猝滅反應(yīng)，移走二氯甲烷層,乙酸乙酯萃取水相，鹽水洗，無水na2so4干燥，蒸干溶劑后硅膠柱層析純化得81.3mg白色固體a1.產(chǎn)率：76％。1hnmr(400mhz,acetone-d6,r.t)δ7.70(brs,1h),7.36(s,1h),7.27–7.20(m,3h),7.19(brs,1h),7.10(s,1h),7.09(s,1h),7.04-7.00(m,1h),6.61(s,1h),5.14(brs,1h),4.80-4.70(m,2h),4.37(dd,j＝15.2,5.7hz,1h),4.28(dd,j＝15.3,5.3hz,1h),3.76(s,3h),3.37(dd,j＝15.4,4.9hz,1h),3.27(dd,j＝15.5,6.0hz,1h)。
實施例3：四氫異喹琳-3-羧酸類衍生物體外抗腫瘤細(xì)胞活性篩選試驗
測試方法：
用srb法對各種化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行評價。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2000-8000cells/well的密度接種于96孔板中，12h細(xì)胞貼壁后加藥(化合物l1-l45)，繼續(xù)培養(yǎng)72h。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后每孔加100μl10％三氯醋酸(tca)固定，靜置5min轉(zhuǎn)至4℃放置1h。細(xì)胞固定完畢，棄tca，用蒸餾水洗5遍，甩干并在空氣中靜止5min干燥。每孔加入50μl4mg/mlsrb溶液，室溫條件下靜置染色10分鐘，用1％冰乙酸洗去未與蛋白結(jié)合的srb，洗5遍后甩干并置于空氣中干燥。與蛋白結(jié)合的srb，每孔加入200μl10mmtris非緩沖溶液，用手輕拍1min充分溶解。最后用分光光度計測定od值，測定波長為570nm。
對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率按下式計算：
ic50表示樣品對腫瘤細(xì)胞的抑制率為50％時的濃度。
測試材料：
人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231、mda-mb-453；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞shsy5y；人膠質(zhì)瘤細(xì)胞u251；人結(jié)腸癌細(xì)胞hct116、sw480；人肺癌細(xì)胞h1299、a549；人宮頸癌細(xì)胞hela、人前列腺癌pc3；人肝癌細(xì)胞hepg2；人正常肝細(xì)胞hl7702。購于atcc。
測試結(jié)果：見表1。
表1：部分四氫異喹琳-3-羧酸類衍生物對12株細(xì)胞的活性
綜上所述，化合物l10、l15、l22和l41對多種組織類型包括乳腺，生殖和呼吸系統(tǒng)來源的腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，但對人正常肝細(xì)胞毒性小，具有較好的成藥性。
實施例4：hsp90抑制活性評價
選取代表性化合物l15，檢測其在細(xì)胞水平對hsp90相關(guān)蛋白的影響。hsp90客戶蛋白水平的下調(diào)和hsp70的回補上調(diào)是兩個最常見的衡量化合物抑制hsp90的生物指標(biāo)。westernblot結(jié)果表明，化合物l15胞內(nèi)作用于hsp90。
測試方法：
取處于對數(shù)生長的mda-mb231細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至70％密度時，加藥處理相應(yīng)時間，吸棄培養(yǎng)基，用冰上預(yù)冷的pbs洗滌一次，加入細(xì)胞裂解液處理。溶解產(chǎn)物加入等體積2×sds樣品緩沖液，加熱煮沸5min使蛋白徹底變性。變性的樣品首先經(jīng)過8％-12％sds-page，然后電轉(zhuǎn)至甲醇活化的聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。將電轉(zhuǎn)移后的pvdf膜置于封閉液(5％bsa)中，脫色搖床室溫封閉1h。隨后，加入用5％bsa按相應(yīng)比例稀釋的一抗溶液，4℃封閉過夜，tbst洗3次，每次10min。再加入對應(yīng)的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗溶液，置于脫色搖床振搖1h，tbst洗3次，每次10min。將洗后的pvdf膜用新配的增強型化學(xué)發(fā)光劑溶液浸潤，置于chemdocxrs+凝膠成像儀中拍照觀察。
測試結(jié)果：見圖1。