本發(fā)明涉及植物油生產(chǎn)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種生物酶法生產(chǎn)不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法。

背景技術(shù)：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)，是由禾谷鐮刀菌(fusariumgraminearum)等多種菌種產(chǎn)生的雌激素類有毒次級代謝產(chǎn)物，廣泛污染玉米、麥類等谷物及糧油制品，是世界上污染范圍最廣泛的真菌毒素之一。zen具有很強的生殖毒性、免疫毒性、胚胎毒性及致畸、致癌、致突變作用等，會導(dǎo)致人類和動物的生殖障礙，內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂。

近年來，隨著災(zāi)害性天氣的頻繁出現(xiàn)和耕作制度的改變，致使中國玉米等作物在種植、收獲、儲藏過程中受到真菌毒素污染的情況愈加嚴重，其中zen是污染范圍和危害最為嚴重的真菌毒素之一，直接導(dǎo)致了生產(chǎn)植物油原料受真菌毒素污染的風險增加，加之zen具有不溶于水，易溶于油脂類物質(zhì)的物理特性，常常富集和積累于糧油制品中危害人類健康，由此引起的食品安全問題不容忽視。對此，中國相關(guān)監(jiān)管部門高度重視，2016年對北京地區(qū)市售的30種油樣檢測結(jié)果表明，zen檢出率為100％，最高含量為333μg/kg。中國雖尚未對植物油中zen的限量加以規(guī)定，但該值也明顯高于中國在gb2761-2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》中規(guī)定玉米等制品中zen含量不高于60μg/kg的限量。因此，植物油中zen的有效防控已經(jīng)成為保障糧油食品安全，保障國人身體健康和生命安全的重要議題。

針對zen的物理吸附去除法，具有吸附毒素的同時也吸附大量的營養(yǎng)物質(zhì)，吸附能力有限等缺點，對植物油中的zen去除存在很大的局限性。而化學(xué)去除法是通過添加化學(xué)物質(zhì)而去除zen，易造成植物油的二次污染，也不適用于植物油中zen的去除。

因此，需要尋找處理工藝簡便、快捷、安全、高效、易于規(guī)?；瘧?yīng)用的方法以解決植物油中zen污染及危害人類健康的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種生物酶法生產(chǎn)不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法，該方法可以有效去除植物油產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮(zen)，最大限度的降低玉米赤霉烯酮污染風險，最終確保糧油食品的質(zhì)量安全。

為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種生物酶法生產(chǎn)不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法，所述方法包括生產(chǎn)植物油過程中添加具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶或用具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶處理成品植物油。

在本發(fā)明的具體實施方式中，在生產(chǎn)植物油過程中，所述生物酶在適于其進行酶反應(yīng)的階段被添加。

本發(fā)明在生產(chǎn)植物油的全過程中，只要能滿足生物酶進行酶反應(yīng)的條件均可加入生物酶進行處理，生物酶的添加與生產(chǎn)植物油的過程同步進行，無需額外使用任何設(shè)備，不改變現(xiàn)有生產(chǎn)工藝，也不影響植物油的生產(chǎn)效率，就能達到去除玉米赤霉烯酮的目的。另外，生物酶可高效、專一地靶向與玉米赤霉烯酮結(jié)合，不與植物油中的維生素e、甾醇等營養(yǎng)物質(zhì)反應(yīng)，生產(chǎn)的植物油安全、無殘留、不會造成植物油中營養(yǎng)成分含量和品質(zhì)的破壞和損失。

現(xiàn)階段，工業(yè)上植物油的生產(chǎn)過程主要包括提油、水化脫膠、脫酸、堿煉、水洗、干燥、脫色、脫蠟、脫臭，得到成品植物油(如圖1所示)。本發(fā)明所述生物酶添加的階段包括但不限于在提油、堿煉、脫蠟過程中被添加或在提油、水化脫膠、脫酸、堿煉、水洗、干燥、脫色、脫蠟、脫臭反應(yīng)后得到的中間產(chǎn)物中被添加。例如，可以將生物酶添加到經(jīng)過提油后得到的毛油中。

在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，在生物酶處理成品植物油時，所述生物酶與成品植物油進行酶反應(yīng)。

需要注意的是，本發(fā)明方法還適用于利用植物油生產(chǎn)過程中得到的中間產(chǎn)物或成品植物油為原料生產(chǎn)得到的相關(guān)制品中玉米赤霉烯酮的去除，例如維生素e、甾醇、磷脂、調(diào)和油等。

本發(fā)明酶反應(yīng)的條件根據(jù)不同酶所需條件來確定，優(yōu)選的為：溫度：30-80℃；時間：1min-5h；攪拌速度：80-500rpm。

本發(fā)明中生物酶的加入量根據(jù)樣品中zen含量和生物酶制劑比酶活確定，例如，生物酶的加入量可以為樣品質(zhì)量的0.01％-1％。

在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶為玉米赤霉烯酮降解酶zendease-n1、zendease-n2、zendease-n3；

其中，所述zendease-n1為由序列表sedidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

所述zendease-n2為由序列表sedidno.6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

所述zendease-n3為由序列表sedidno.10所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

進一步，為了達到更優(yōu)的效果，本發(fā)明可在酶反應(yīng)后，進行分離，使玉米赤霉烯酮降解物質(zhì)由油中轉(zhuǎn)移到水中，以達到去除玉米赤霉烯酮的目的。

其中，所述分離采用可實現(xiàn)分離的任何離心機，包括但不限于蝶式離心機、渦旋式離心機；優(yōu)選的，所述離心的轉(zhuǎn)速為1000-10000rpm。

利用本發(fā)明上述生物酶法生產(chǎn)不含玉米赤霉烯酮植物油，不需增加額外設(shè)備和投資，不改變現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上，得到的植物油中玉米赤霉烯酮的殘留量僅為0-20μg/kg。

本發(fā)明所述植物油包括但不限于玉米油、大豆油、花生油、菜籽油。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明利用了現(xiàn)有的植物油工業(yè)化生產(chǎn)工藝，生物酶的添加可在生產(chǎn)植物油的過程中同步進行，例如可以在提油、堿煉脫酸、脫蠟等階段添加，亦或生產(chǎn)過程中得到的中間產(chǎn)物中添加，無需額外購置設(shè)備、不改變生產(chǎn)工藝，具有操作簡單，方便易行，處理成本低廉等優(yōu)點。

(2)本發(fā)明生物酶能夠高效、專一地靶向與玉米赤霉烯酮結(jié)合，并將其分解成無毒產(chǎn)物，隨即轉(zhuǎn)移至水中，通過分離即可將其完全去除，且所用生物酶不與植物油中的維生素e、甾醇等營養(yǎng)物質(zhì)反應(yīng)，可保證生產(chǎn)的植物油安全、無殘留、不造成植物油中營養(yǎng)成分含量和品質(zhì)的破壞和損失。

(3)本發(fā)明適用于任何油料植物生產(chǎn)的植物油中玉米赤霉烯酮的去除。例如，可以為大豆油、玉米油、花生油、菜籽油等植物油等，無需調(diào)整工藝，均能有效地去除，得到不含玉米赤霉烯酮的植物油。

(4)本發(fā)明相比堿煉法去除玉米赤霉烯酮或添加玉米赤霉烯酮吸附劑等方法，無需增加額外的處理環(huán)節(jié)，減少了因增加處理工藝而造成的得油率損失，因此，具有不改變得油率的優(yōu)點。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1植物油的生產(chǎn)過程中可用生物酶處理的階段。

圖2示出重組質(zhì)粒pet30a-zendease-n1的表達產(chǎn)物的sds-page圖；

其中，泳道1表達產(chǎn)物；泳道m(xù)，蛋白分子量標準(97kd，66kd，45kd，31kd，21.5kd，14.4kd，6.5kd)。

圖3示出重組質(zhì)粒pet30a-zendease-n2的表達產(chǎn)物的sds-page圖；

其中，泳道1,2表達產(chǎn)物；泳道m(xù)，蛋白分子量標準(97kd，66kd，45kd，31kd，21.5kd，14.4kd，6.5kd)。

圖4示出重組質(zhì)粒pet30a-zendease-n3的表達產(chǎn)物的sds-page圖；

其中，泳道1表達產(chǎn)物；泳道m(xù)，蛋白分子量標準(97kd，66kd，45kd，31kd，21.5kd，14.4kd，6.5kd)。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明實施例中的實驗方法如無特別說明均為常規(guī)方法；實施例中的所用材料、試劑等如無特別說明均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1玉米赤霉烯酮降解酶zendease-n1的制備

1、玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因序列的獲得

通過化學(xué)合成方法得到zendease-n1全長基因，以此合成的基因為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下進行pcr反應(yīng)，擴增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物1：5'-gaaattcatatgccttcttcactt-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.3所示，劃線部分堿基為ndei識別位點)

引物2：5'-cccgtcgacagccccatcctt-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.4所示，劃線部分堿基為sali識別位點)

在pcr反應(yīng)中，pcr反應(yīng)條件為：94℃，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環(huán)30次：升溫至94℃，保持1分鐘，降溫至54℃，保持1分鐘，升溫至68℃，保持2分鐘；然后于68℃，保持10分鐘，最后于4℃保溫10分鐘，結(jié)束擴增反應(yīng)。通過瓊脂糖電泳分析獲得約0.8kb的單一帶，擴增之后的pcr產(chǎn)物檢測之后將目的帶大小的擴增產(chǎn)物用dna凝膠回收試劑盒進行回收，并檢測其濃度。回收pcr產(chǎn)物連接pet30avector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，獲得重組質(zhì)粒pet30a-zendease-n1測序鑒定。則該玉米赤霉烯酮降解酶基因dna序列如序列表sedidno.1所示，其對應(yīng)的氨基酸序列如序列表sedidno.2所示。

2、含有玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因序列的重組表達載體的構(gòu)建

上述所獲得的pcr產(chǎn)物兩端具有ndei和sali限制性內(nèi)切酶位點，用(ndei)和(sali)限制性內(nèi)切酶對pcr產(chǎn)物和質(zhì)粒pet30a同時進行雙酶切反應(yīng)，酶切體系50μl：目的片段或質(zhì)粒20μl，10×kbuffer5μl，ndei2μl，sali2μl，ddh2o21μl，酶切條件是37℃反應(yīng)3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)柱回收后進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取陽性菌落培養(yǎng)，重組表達載體經(jīng)pcr鑒定、酶切鑒定，測序驗證。經(jīng)瓊脂糖電泳后載體?；厥盏哪康钠魏洼d體片段定量并按摩爾比為3:1的比例用t4dna連接酶進行體外連接，連接反應(yīng)體系10μl：目的片段5μl，pet30a載體2μl10×t4dna連接緩沖液1μl，t4dna連接酶(350u/μl)1μl,ddh2o1μl。16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取菌落37℃振蕩培養(yǎng)6-8h，分別進行pcr鑒定和重組質(zhì)粒的酶切鑒定。獲得的重組表達載體命名為后pet30a-zendease-n1。超聲波破碎，離心收集上清，取15μl上清用sds-page電泳進行檢測。對pet30a-zendease-n1進行測序，證明融合連接入載體pet30a的dna序列與如序列表sedidno.1所示序列相同，構(gòu)建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重組表達載體pet30a-zendease-n1正確。

3、玉米赤霉烯酮降解酶在大腸桿菌中的表達純化

將重組表達載體pet30a-zendease-n1轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布卡那霉素抗性lb平板。挑取平板平板上的單菌落到1llb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細菌生長到od值為1左右時，加入0.5ml濃度為0.6mol/l的iptg誘導(dǎo)表達過夜，次日收菌純化蛋白。將過夜表達的菌體離心收集，棄上清，加入30ml重懸緩沖液，將細菌沉淀懸起后超聲破碎細菌，將破碎的細胞懸液轉(zhuǎn)入高速離心管中，高速離心后把上清加入到ni-nta親和柱中，讓其流過親和介質(zhì)。用10倍柱體積的漂洗緩沖液漂洗親和介質(zhì)，洗掉非特異性結(jié)合的雜蛋白，用5ml洗脫緩沖液將目的蛋白從親和柱上洗脫下來。用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)進行zendease-n1蛋白的表達純化分析。用sds-page電泳進行檢測。結(jié)果如圖1所示：泳道1為表達產(chǎn)物，箭頭表示目的條帶，這表明重組菌株表達的蛋白質(zhì)的分子量約31.5kd，與從氨基酸推段出的理論分子量(31.5kd)大小一致。

實施例2玉米赤霉烯酮降解酶zendease-n2的制備

1、玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因序列的的獲得通過化學(xué)合成方法得到zendease-n2全長基因，以此合成的基因為模板，在引物3和引物4的引導(dǎo)下進行pcr反應(yīng)，擴增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物3：5'-gaaattcatatgcggacaagatcg-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.7所示，劃線部分堿基為ndei識別位點)

和引物4：5'-cccgtcgactagatacctccg-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.8所示，劃線部分堿基為sali識別位點)

在pcr反應(yīng)中，pcr反應(yīng)條件為：94℃，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環(huán)30次：升溫至94℃，保持1分鐘，降溫至54℃，保持1分鐘，升溫至68℃，保持2分鐘；然后于68℃，保持10分鐘，最后于4℃保溫10分鐘，結(jié)束擴增反應(yīng)。通過瓊脂糖電泳分析獲得約0.8kb的單一帶，擴增之后的pcr產(chǎn)物檢測之后將目的帶大小的擴增產(chǎn)物用dna凝膠回收試劑盒進行回收，并檢測其濃度?；厥誴cr產(chǎn)物連接pet30avector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，獲得重組質(zhì)粒pet30a-zendease-n2測序鑒定。則該玉米赤霉烯酮降解酶基因dna序列為如序列表sedidno.5所示，其對應(yīng)的氨基酸序列如序列表sedidno.6所示。

2、含有玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因序列的重組表達載體的構(gòu)建

所獲得的pcr產(chǎn)物兩端具有ndei和sali限制性內(nèi)切酶位點，用(ndei)和(sali)限制性內(nèi)切酶對pcr產(chǎn)物和質(zhì)粒pet30a同時進行雙酶切反應(yīng)，酶切體系50μl：目的片段或質(zhì)粒20μl，10×kbuffer5μl，ndei2μl，sali2μl，ddh2o21μl，酶切條件是37℃反應(yīng)3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)柱回收后進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取陽性菌落培養(yǎng)，重組表達載體經(jīng)pcr鑒定、酶切鑒定，測序驗證。經(jīng)瓊脂糖電泳后載體?；厥盏哪康钠魏洼d體片段定量并按摩爾比為3:1的比例用t4dna連接酶進行體外連接，連接反應(yīng)體系10μl：目的片段5μl，pet30a載體2μl10×t4dna連接緩沖液1μl，t4dna連接酶(350u/μl)1μl,ddh2o1μl。16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取菌落37℃振蕩培養(yǎng)6-8h，分別進行pcr鑒定和重組質(zhì)粒的酶切鑒定。獲得的重組表達載體命名為后pet30a-zendease-n2。超聲波破碎，離心收集上清，取15μl上清用sds-page電泳進行檢測。對pet30a-zendease-n2進行測序，證明融合連接入載體pet30a的dna序列與如序列表sedidno.5所示序列相同，構(gòu)建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重組表達載體pet30a-zendease-n2正確。

3、玉米赤霉烯酮降解酶在大腸桿菌中的表達純化

將重組表達載體pet30a-zendease-n2轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布卡那霉素抗性lb平板。挑取平板平板上的單菌落到1llb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細菌生長到od值為1左右時，加入0.5ml濃度為0.6mol/l的iptg誘導(dǎo)表達過夜，次日收菌純化蛋白。將過夜表達的菌體離心收集，棄上清，加入30ml重懸緩沖液，將細菌沉淀懸起后超聲破碎細菌，將破碎的細胞懸液轉(zhuǎn)入高速離心管中，高速離心后把上清加入到ni-nta親和柱中，讓其流過親和介質(zhì)。用10倍柱體積的漂洗緩沖液漂洗親和介質(zhì)，洗掉非特異性結(jié)合的雜蛋白，用5ml洗脫緩沖液將目的蛋白從親和柱上洗脫下來。用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)進行zendease-n2蛋白的表達純化分析。用sds-page電泳進行檢測。結(jié)果如圖2所示：泳道1、2為表達產(chǎn)物，箭頭表示目的條帶，這表明重組菌株表達的蛋白質(zhì)的分子量約29.2kd，與從氨基酸推段出的理論分子量(29.2kd)大小一致。

實施例3玉米赤霉烯酮降解酶zenase-n3的制備

1、玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因序列的獲得

通過化學(xué)合成方法得到zenase-n3全長基因，以此合成的基因為模板，在引物5和引物6的引導(dǎo)下進行pcr反應(yīng)，擴增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物5：5'-gaaattcatatgatgcgcacccaatccaccat-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.11所示，劃線部分堿基為ndei識別位點)

和引物6：5'-cccgtcgactcatagatacttccgcgtcg-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.12所示，劃線部分堿基為sali識別位點)

在pcr反應(yīng)中，pcr反應(yīng)條件為：94℃，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環(huán)30次：升溫至94℃，保持1分鐘，降溫至54℃，保持1分鐘，升溫至68℃，保持2分鐘；然后于68℃，保持10分鐘，最后于4℃保溫10分鐘，結(jié)束擴增反應(yīng)。通過瓊脂糖電泳分析獲得約0.8kb的單一帶，擴增之后的pcr產(chǎn)物檢測之后將目的帶大小的擴增產(chǎn)物用dna凝膠回收試劑盒進行回收，并檢測其濃度?；厥誴cr產(chǎn)物連接pet30avector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，獲得重組質(zhì)粒pet30a-zendease-n3測序鑒定。則該玉米赤霉烯酮降解酶基因dna序列為如序列表sedidno.9所示，其對應(yīng)的氨基酸序列為如序列表sedidno.10所示。

2、含有玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因序列的重組表達載體的構(gòu)建

所獲得的pcr產(chǎn)物兩端具有ndei和sali限制性內(nèi)切酶位點，用(ndei)和(sali)限制性內(nèi)切酶對pcr產(chǎn)物和質(zhì)粒pet30a同時進行雙酶切反應(yīng)，酶切體系50μl：目的片段或質(zhì)粒20μl，10×kbuffer5μl，ndei2μl，sali2μl，ddh2o21μl，酶切條件是37℃反應(yīng)3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)柱回收后進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取陽性菌落培養(yǎng)，重組表達載體經(jīng)pcr鑒定、酶切鑒定，測序驗證。經(jīng)瓊脂糖電泳后載體?；厥盏哪康钠魏洼d體片段定量并按摩爾比為3:1的比例用t4dna連接酶進行體外連接，連接反應(yīng)體系10μl：目的片段5μl，pet30a載體2μl10×t4dna連接緩沖液1μl，t4dnaδ連接酶(350u/μl)1μl,ddh2o1μl。16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取菌落37℃振蕩培養(yǎng)6-8h，分別進行pcr鑒定和重組質(zhì)粒的酶切鑒定。獲得的重組表達載體命名為后pet30a-zendease-n3。超聲波破碎，離心收集上清，取15μl上清用sds-page電泳進行檢測。對pet30a-zendease-n3進行測序，證明融合連接入載體pet30a的dna序列與如序列表sedidno.9所示相同，構(gòu)建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重組表達載體pet30a-zendease-n3正確。

3、玉米赤霉烯酮降解酶在大腸桿菌中的表達純化

將重組表達載體pet30a-zendease-n3轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布卡那霉素抗性lb平板。挑取平板平板上的單菌落到1llb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細菌生長到od值為1左右時，加入0.5ml濃度為0.6mol/l的iptg誘導(dǎo)表達過夜，次日收菌純化蛋白。將過夜表達的菌體離心收集，棄上清，加入30ml重懸緩沖液，將細菌沉淀懸起后超聲破碎細菌，將破碎的細胞懸液轉(zhuǎn)入高速離心管中，高速離心后把上清加入到ni-nta親和柱中，讓其流過親和介質(zhì)。用10倍柱體積的漂洗緩沖液漂洗親和介質(zhì)，洗掉非特異性結(jié)合的雜蛋白，用5ml洗脫緩沖液將目的蛋白從親和柱上洗脫下來。用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)進行zendease-n3蛋白的表達純化分析。用sds-page電泳進行檢測。結(jié)果如圖3所示：重組菌株表達的蛋白質(zhì)的分子量約31.0kd，與從氨基酸推段出的理論分子量(31.0kd)大小一致。

實施例4生物酶法在玉米油精煉過程及玉米毛油中的應(yīng)用

1、生物酶法在玉米油精煉過程中的應(yīng)用

生物酶法生產(chǎn)不含玉米赤霉烯酮的玉米油具體工藝為：

(1)水化脫膠：通常采用高溫水化工藝，油溫為70℃-80℃，水溫為80℃左右，在20min內(nèi)一次加完，沉降3h-4h，然后將油腳分離出來。

(2)堿煉脫酸-生酶法去除zen工藝：加入堿液，調(diào)節(jié)ph值為7-8，控制溫度在40-60℃，加入zen降解酶(根據(jù)zen含量確定加入量)，100-300rpm攪拌30min，調(diào)節(jié)溫度進行堿煉，當皂粒明顯析出后靜置沉降6h-8h，然后將皂角分離出去。

(3)水洗干燥：水洗時將油溫調(diào)整到85℃左右，加入與油同溫的水進行水洗，靜置1h左右，放掉廢水。進行真空溫度為90℃-105℃脫水干燥處理。

(4)脫色：脫色時將油溫升至90℃左右，加入活性白土(加入量為油重的3％-5％)與油充分混合，脫色時間為20min-30min，脫色完畢后將油冷卻至70℃以下。

(5)脫臭：將脫色油吸入脫臭鍋中，脫臭溫度170℃-180℃，脫臭時間3h-8h。脫臭完畢，將油冷卻至70℃以下泵出過濾，即為成品油。

2、生物酶法在玉米毛油中的應(yīng)用

(1)生物酶法生產(chǎn)不含玉米赤霉烯酮的玉米毛油中工藝

準確稱量適量zen降解酶用水溶解(酶制劑含量根據(jù)zen含量調(diào)整)，加入毛油中，37℃，100-300rpm攪拌處理15-30min，利用蝶式離心機以轉(zhuǎn)速為10000rpm離心，分離。

(2)毛油精煉，制備玉米油

a水化脫膠：通常采用高溫水化工藝，油溫為70℃-80℃，水溫為80℃左右，在20min內(nèi)一次加完，沉降3h-4h，然后將油腳分離出來。

b堿煉脫酸：加入堿液，最終使得毛油的ph值為7-8，全部堿液應(yīng)在10min內(nèi)一次加完。當皂粒明顯析出后靜置沉降6h-8h，然后將皂角分離出去。

c水洗干燥：水洗時將油溫調(diào)整到85℃左右，加入與油同溫的水進行水洗，靜置1h左右，放掉廢水，進行真空溫度為90℃-105℃脫水干燥處理。

d脫色：脫色時將油溫升至90℃左右，加入活性白土(加入量為油重的3％-5％)與油充分混合，脫色時間為20min-30min，脫色完畢后將油冷卻至70℃以下。

e脫臭：將脫色油吸入脫臭鍋中，脫臭溫度170℃-180℃，脫臭時間3h-8h。脫臭完畢，將油冷卻至70℃以下泵出過濾，即為成品油。

3、吸附法去除玉米油中玉米赤霉烯酮生產(chǎn)工藝

作為對比，本實施例中使用了常規(guī)生產(chǎn)中用到的物理吸附法去除玉米油中zen的工藝，在此過程中，毛油不經(jīng)過脫毒，脫色、脫臭步驟不同，其他步驟同玉米油制備工藝，脫色和脫臭步驟具體為：

脫色：脫色時將油溫升至90℃左右，加入活性炭(加入量為油重的2％-3％)與油充分混合，脫色時間為20min-30min，脫色完畢后將油冷卻至70℃以下。

脫臭：將脫色油吸入脫臭鍋中，脫臭溫度250℃，脫臭時間3h-8h。脫臭完畢，將油冷卻至70℃以下泵出過濾，即為成品玉米油。

以不添加吸附劑及生物酶生產(chǎn)的玉米油為對照，檢測經(jīng)上述生物酶法生產(chǎn)的玉米油、玉米毛油及吸附法生產(chǎn)的玉米油各指標，結(jié)果如下：

4、生物酶法在玉米成品油中的應(yīng)用

準確稱量適量zen降解酶用水溶解(酶制劑含量根據(jù)zen含量調(diào)整)，加入玉米成品油中，37℃，300-500rpm攪拌處理1-15min，利用渦旋式離心機以轉(zhuǎn)速為1000rpm離心，分離。

表1玉米油中各指標含量

以不去除zen法制得的玉米油得率為100％計算相對得率

由表1可以看出，不去除zen法為毛油不經(jīng)過物理吸附和生物脫除等工藝制備的玉米油中zen殘留量為508μg/kg，超過國家食品限量標準；采取物理吸附法工藝制備的玉米油中zen殘留量265μg/kg，超過國家食品限量標準，且維生素e和甾醇含量有明顯下降；分別使用3種生物酶法工藝制備的玉米油中zen殘留量均低于20μg/kg，且ve、甾醇和不去除zen法制得的玉米油在得油率上均無顯著差異(p＜0.05)。

表2玉米毛油中各指標含量

以不去除zen法制得的玉米油得率為100％計算相對得率

如表2所示，玉米毛油分別使用3種zen降解酶采過生物酶法處理后，zen殘留量均低于20μg/kg，制得的玉米油中zen和酶解產(chǎn)物菌為未檢出，且其中維生素e、甾醇和玉米油得油率均無顯著差異(p＜0.05)。

表3玉米成品油中各指標含量

以不去除zen法制得的玉米油得率為100％計算相對得率

由表3可以看出，不經(jīng)過生物酶法處理的成品油中zen殘留量為324μg/kg，采取三種生物酶分別處理后，均未檢出zen，且維生素e和甾醇含量基本無降低(p＜0.05)。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。

sequencelisting

<110>國家糧食局科學(xué)研究院

<120>一種生物酶法生產(chǎn)不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法

<130>jlc17i0310e

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>861

<212>dna

<213>zendease-n1核苷酸序列

<400>1

atgccttcttcactttctcccacggtagatgtgtacagcaaggtcatgttggaattaccc60

ccgaaaatcaaatcactgccgacgccgacggtccggaaggtcaacaccaacgatgggatg120

tcatggcacgtgaaacagacgggcatgggacgagatcttattctgatacctgcctgcgaa180

ggcgacagctctacctatgatcacctcggcgatctcctctcctcctcattcagaataacc240

acattcgacatgcctggcttctccaggacgatcgcgccgcccttctcgatggaagacctc300

acggtacagattttggcgactcaggtcgtcacgttgatggacgaacttgcgataccgaca360

gcgaccttcttctcagtcgccgccgggagcttagtggcgatgggcttggtaacatactac420

ccggaccgggtcgagcgaatcatcatccacgaggcccctctccacgttccccaaggattc480

agactcttgaagctcaaggacgacgctcatgtgatgcaccaatgtcgcgaaatgtttccc540

gcactcctgatggagagtagaacggcgtgggaagctatgggagccgagtaccatgctcgg600

atggagaagaactatgtcacctggctcaggaagtacatcggccagctggaatgtcaccat660

tgggacgagggattgctgcagagacctgtgtattggagcgttggatcgttgaatgtgatg720

ggaggcttctacgacaacattattttggcgacgaaattaggcctcgaggtcgagatactt780

ccgtgcaagcactatccacagctaacgataccggaaatactcgcggcacatattcgatgt840

tgtgtgaaggatggggcttga861

<210>2

<211>286

<212>prt

<213>zendease-n1氨基酸序列

<400>2

metproserserleuserprothrvalaspvaltyrserlysvalmet

151015

leugluleuproprolysilelysserleuprothrprothrvalarg

202530

lysvalasnthrasnaspglymetsertrphisvallysglnthrgly

354045

metglyargaspleuileleuileproalacysgluglyaspserser

505560

thrtyrasphisleuglyaspleuleuserserserpheargilethr

65707580

thrpheaspmetproglypheserargthrilealapropropheser

859095

metgluaspleuthrvalglnileleualathrglnvalvalthrleu

100105110

metaspgluleualaileprothralathrphepheservalalaala

115120125

glyserleuvalalametglyleuvalthrtyrtyrproaspargval

130135140

gluargileileilehisglualaproleuhisvalproglnglyphe

145150155160

argleuleulysleulysaspaspalahisvalmethisglncysarg

165170175

glumetpheproalaleuleumetgluserargthralatrpgluala

180185190

metglyalaglutyrhisalaargmetglulysasntyrvalthrtrp

195200205

leuarglystyrileglyglnleuglucyshishistrpaspglugly

210215220

leuleuglnargprovaltyrtrpservalglyserleuasnvalmet

225230235240

glyglyphetyraspasnileileleualathrlysleuglyleuglu

245250255

valgluileleuprocyslyshistyrproglnleuthrileproglu

260265270

ileleualaalahisileargcyscysvallysaspglyala

275280285

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工合成引物1

<400>3

gaaattcatatgccttcttcactt24

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工合成引物2

<400>4

cccgtcgacagccccatcctt21

<210>5

<211>801

<212>dna

<213>zendease-n2核苷酸序列

<400>5

atgcggacaagatcgactctcaaagacaagaatgggatcaactggtactacgaacaagaa60

gggtctggcccccacgtggttcttatccccgatgggtggggagagtgccaaatgatggac120

aagcccatgtctctaattgccgcccaggggtttacggtcaccacattcgacatgccggga180

ttctcgaggtcttcagatgccccgccggagacttaccaggacgtcacagcccagaagctg240

gccagctacgtcatcagcatcctagatgagctgcacgtcgattacgctacgttctggggc300

tgcgccgccggcggtgcgaccgtgcttgcattggcggctgactaccccgagcgcatgcgc360

aacgggctgccgcatgaagttccgacggctgctaatcccaaggaaaacctcaacgctttg420

gctaagatggaagacgaggctatcgtgaagatcatggaaggggacatgctcaagcacatc480

ttcggtcccgatttgacggcgtggcatgcgctgggcgaggaggcccacgccaggttgcgg540

aaagcctatccccgctgggcccgcggctacccccttactctaccgtcgtctgcgcccact600

ggagaagaggacttgaagaagcgaccgctggattggactgttggtggggatacggcgaca660

cagtcgttcatcgataacattatcactgctgcgaaggccggaatcccgatcgggacgatc720

ccgggcatgcactttccgtatgtctcgcatccggaggctctggtgaaacatattgtggat780

actactcggaggtatctatga801

<210>6

<211>266

<212>prt

<213>zendease-n2氨基酸序列

<400>6

metargthrargserthrleulysasplysasnglyileasntrptyr

151015

tyrgluglngluglyserglyprohisvalvalleuileproaspgly

202530

trpglyglucysglnmetmetasplysprometserleuilealaala

354045

glnglyphethrvalthrthrpheaspmetproglypheserargser

505560

seraspalaproprogluthrtyrglnaspvalthralaglnlysleu

65707580

alasertyrvalileserileleuaspgluleuhisvalasptyrala

859095

thrphetrpglycysalaalaglyglyalathrvalleualaleuala

100105110

alaasptyrprogluargmetargasnglyleuprohisgluvalpro

115120125

thralaalaasnprolysgluasnleuasnalaleualalysmetglu

130135140

aspglualailevallysilemetgluglyaspmetleulyshisile

145150155160

pheglyproaspleuthralatrphisalaleuglygluglualahis

165170175

alaargleuarglysalatyrproargtrpalaargglytyrproleu

180185190

thrleuproserseralaprothrglyglugluaspleulyslysarg

195200205

proleuasptrpthrvalglyglyaspthralathrglnserpheile

210215220

aspasnileilethralaalalysalaglyileproileglythrile

225230235240

proglymethispheprotyrvalserhisproglualaleuvallys

245250255

hisilevalaspthrthrargargtyrleu

260265

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工合成引物3

<400>7

gaaattcatatgcggacaagatcg24

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工合成引物4

<400>8

cccgtcgactagatacctccg21

<210>9

<211>870

<212>dna

<213>zendease-n3核苷酸序列

<400>9

atgcgcacccaatccaccatcacgaccccagacgggataacctggtactacgagcaagaa60

ggcaccggtccgcacatagtcctaatcccagacggcatcggcgactgcgcgctattctcg120

aagcctgtatcgctcatagccgccgccggctttactgtcaccacgttcgatatgccgggc180

atgtcgcggtccgctcacggggccaacacgcccccggaaagctaccaggacatcacggcg240

cccaagctagcgcgctacgtgatcagcctgctcgacgccctgcacatcgacgacgacgcc300

gccaccttctggggcagcagctcgggcggcgccaccgtcctcgcgctcgcggccggatac360

cccgatcgcgtgcggaatggaatcgtgcacgaggtgccgaccacccagcacgatttcttc420

gaggagctgctccagaacgatgacgagagcatcgccaagacgctggcggcgcagatgccc480

gccctgttcgtgggagacgctgcggcctgggacgcgctgggcgatgacgtccatgctagg540

ctttggaggaactatagccgctgggctagggggtacccgcggacgctgccccagtcggtg600

cctactgttcctgttggtggtagtggtggtggtggtggtggtggtgatcaggagcaggag660

gaggaggaggaaaatgaggatcgggtgaggcggccgctagactggacggttggcgctggc720

acgccgatggggatgttctttgataatgtcgtcacggccgcaaaggccggggtcagtatt780

gggctgttacctgggatgcatctcccttatgtttcgcatccagaggccttcgcgagacat840

gtcgttgatacgacgcggaagtatctatga870

<210>10

<211>289

<212>prt

<213>zendease-n3氨基酸序列

<400>10

metargthrglnserthrilethrthrproaspglyilethrtrptyr

151015

tyrgluglngluglythrglyprohisilevalleuileproaspgly

202530

ileglyaspcysalaleupheserlysprovalserleuilealaala

354045

alaglyphethrvalthrthrpheaspmetproglymetserargser

505560

alahisglyalaasnthrproproglusertyrglnaspilethrala

65707580

prolysleualaargtyrvalileserleuleuaspalaleuhisile

859095

aspaspaspalaalathrphetrpglyserserserglyglyalathr

100105110

valleualaleualaalaglytyrproaspargvalargasnglyile

115120125

valhisgluvalprothrthrglnhisaspphepheglugluleuleu

130135140

glnasnaspaspgluserilealalysthrleualaalaglnmetpro

145150155160

alaleuphevalglyaspalaalaalatrpaspalaleuglyaspasp

165170175

valhisalaargleutrpargasntyrserargtrpalaargglytyr

180185190

proargthrleuproglnservalprothrvalprovalglyglyser

195200205

glyglyglyglyglyglyglyaspglngluglnglugluglugluglu

210215220

asngluaspargvalargargproleuasptrpthrvalglyalagly

225230235240

thrprometglymetphepheaspasnvalvalthralaalalysala

245250255

glyvalserileglyleuleuproglymethisleuprotyrvalser

260265270

hisproglualaphealaarghisvalvalaspthrthrarglystyr

275280285

leu

<210>11

<211>32

<212>dna

<213>人工合成引物5

<400>11

gaaattcatatgatgcgcacccaatccaccat32

<210>12

<211>29

<212>dna

<213>人工合成引物6

<400>12

cccgtcgactcatagatacttccgcgtcg29