技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒。

背景技術(shù)：
：

轉(zhuǎn)基因棉花mon88701是孟山都公司開發(fā)的耐受兩種廣譜除草劑麥草畏和草銨膦的轉(zhuǎn)基因品系。mon88701經(jīng)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)pv-ghht6997質(zhì)粒轉(zhuǎn)入coker130棉花而成，其t-dna含有dmo(dicambamono-oxygenase)基因盒和bar(phosphinothricinn-acetyltransferase，pat)基因盒，分別編碼麥草畏單加氧酶和膦絲菌素n-乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)，它們在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)均為1個(gè)拷貝。

目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品多數(shù)國家均采用相應(yīng)的標(biāo)識(shí)管理制度，品系特異性pcr(轉(zhuǎn)化事件特異性)(event-specificpcr)檢測的目標(biāo)序列是外源插入序列與植物基因組間連接區(qū)，相較于篩選pcr(screeningpcr)、基因特異性pcr(gene-specificpcr)、構(gòu)建特異性pcr(construct-specificpcr)具有更加高的具有高特異性，能用于檢測鑒定相同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因具體品系，是目前轉(zhuǎn)基因品系鑒定檢測技術(shù)研究和實(shí)際檢測工作中的重要方法。

為打破其他國家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘，完善和我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測技術(shù)體系，保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)，為進(jìn)出境口岸監(jiān)管部門提供轉(zhuǎn)基因不同品系標(biāo)識(shí)檢測鑒定的方法，建立轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性定量pcr精準(zhǔn)檢測方法十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，快速準(zhǔn)確鑒別轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系的轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

mon88701-f：5’-gaaatgcagagttacaagaacatcc-3’(如seqidno.1所示)；

mon88701-r：5’-tgacgaattctgcagaagcttg-3’(如seqidno.2所示)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示：

mon88701-p：5’-ccaaagcccgggcttaattaaggc-3’(如seqidno.3所示)，探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

所述的熒光報(bào)告基團(tuán)優(yōu)選為fam，所述的熒光淬滅基團(tuán)優(yōu)選為bhq1。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)液、耐熱dna聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

mon88701-f：5’-gaaatgcagagttacaagaacatcc-3’(如seqidno.1所示)；

mon88701-r：5’-tgacgaattctgcagaagcttg-3’(如seqidno.2所示)；

所述的檢測探針如下所示：

mon88701-p：5’-ccaaagcccgggcttaattaaggc-3’(如seqidno.3所示)，探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取樣品的基因組dna作為模板；

(2)加入上述的檢測引物和檢測探針，與實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)液及耐熱dna聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系；

(3)將擴(kuò)增反應(yīng)體系在熒光pcp儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷樣品是否為轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系。

優(yōu)選，所述的步驟(2)的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon88701-f和mon88701-r各0.4μl，10μmol/l檢測探針mon88701-p0.8μl，dna模板2μl和ddh2o8.7μl；所述的步驟(3)的實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)，其反應(yīng)程序?yàn)?5℃30s；95℃5s、58℃34s，40個(gè)循環(huán)，于58℃收集熒光信號(hào)。

優(yōu)選，所述的步驟(3)的根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷樣品是否為轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系的標(biāo)準(zhǔn)為：如果擴(kuò)增曲線有典型熒光擴(kuò)增曲線，則說明樣品為轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系；如果擴(kuò)增曲線無典型熒光擴(kuò)增曲線，則說明樣品不是轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系的基因組dna進(jìn)行梯度稀釋以用作不同起始濃度的模板，分別加入上述的檢測引物和檢測探針，與實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)液及耐熱dna聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系，在熒光pcp儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)；

(2)反應(yīng)后得到各起始濃度模板對(duì)應(yīng)的ct值，該ct值與起始模板量的常用對(duì)數(shù)(lg)呈線性關(guān)系，據(jù)此得到該線性范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)提取待測樣品的基因組dna為模板，加入與步驟(1)中相同體系的上述的檢測引物和檢測探針，與實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)液及耐熱dna聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系，在熒光pcp儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)，反應(yīng)后得到ct值，將其代入步驟(2)獲得的轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待檢樣品中轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系基因組dna的含量(拷貝數(shù)或質(zhì)量)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

1.本發(fā)明打破國外其他國家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘；

2.本發(fā)明彌補(bǔ)和完善了我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測技術(shù)體系。提供的技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測可更加好的保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，滿足國家監(jiān)管部門對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的鑒定和標(biāo)識(shí)需求。

3.本發(fā)明針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性序列設(shè)計(jì)引物和taqman探針，建立轉(zhuǎn)基因棉花mon88701實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)檢測方法。利用該檢測引物和檢測探針及建立的實(shí)時(shí)熒光pcr體系，按照本發(fā)明的方法定量檢測下限為34copies，建立的轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝-3.48x+39.91，r²為0.99，擴(kuò)增效率：94％(介于90％～110％)，表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測方法在模板量34-680000copies重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明的方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)都在可接受范圍內(nèi)，特異性良好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)。

附圖說明：

圖1是退火溫度為58℃時(shí)擴(kuò)增圖。

圖2是退火溫度為60℃時(shí)擴(kuò)增圖。

圖3是轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性檢測方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；1為adhc-mon88701質(zhì)粒；2～14分別為轉(zhuǎn)基因油菜mon88302、轉(zhuǎn)基因油菜dp-073496-4、轉(zhuǎn)基因棉花mon88913、轉(zhuǎn)基因大豆a2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆gts40-30-2、轉(zhuǎn)基因玉米mon810、轉(zhuǎn)基因玉米bt11、轉(zhuǎn)基因玉米mir162、轉(zhuǎn)基因玉米nk603、轉(zhuǎn)基因甜菜h7-1、非轉(zhuǎn)基因棉花、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

圖4是轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性檢測靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增圖；1～9依次分別為340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μl質(zhì)粒dna，10和11分別為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

圖5是實(shí)時(shí)熒光pcr檢測轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，log(copies)即為log10(copies)。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

主要材料：轉(zhuǎn)基因油菜mon88302、轉(zhuǎn)基因油菜dp-073496-4、轉(zhuǎn)基因棉花mon88913、轉(zhuǎn)基因大豆a2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆gts40-30-2、轉(zhuǎn)基因玉米mon810、轉(zhuǎn)基因玉米bt11、轉(zhuǎn)基因玉米mir162、轉(zhuǎn)基因玉米nk603、轉(zhuǎn)基因甜菜h7-1和非轉(zhuǎn)基因棉花為本實(shí)驗(yàn)室購置及保存，棉花內(nèi)源基因棉花乙醇脫氫酶c基因(alcoholdehydrogenasecgene,adhc,genbank:af036569.1)和轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性片段雙基因陽性質(zhì)粒(雙基因陽性質(zhì)粒為將內(nèi)源基因adhc基因片段140bp序列(如seqidno.4所示)和轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性片段211bp序列(如seqidno.5所示)的共351bp序列(如seqidno.6所示)克隆到ampr抗性的puc57載體上構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌dh5a后-70℃保存。以下稱adhc-mon88701質(zhì)粒，含酶切位點(diǎn)kpnl)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

棉花內(nèi)源基因選用棉花乙醇脫氫酶c基因(alcoholdehydrogenasecgene,adhc，genbank:af036569.1)(參考文獻(xiàn)：mazzaram,graziolie.,savinic,vandeneedeg.event-specificmethodforthequantificationofcottonlinellcotton25usingreal-timepcr-validationreportandprotocol-cottonseedssamplinganddnaextraction,doi10.2788/32755)引物adhc-f/r和探針adhc-p用于檢測棉花樣品基因組dna是否成功提取以及是否適于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增；其序列信息詳見表1。

主要試劑：primexextaq(2×)forqpcr，大連寶生物；dna提取試劑盒，北京天根公司；引物和探針由閃晶生物公司合成，稀釋為終濃度為10μm的工作液使用。

主要儀器與設(shè)備：

abi7500，abi7500fast實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；qx200微滴式數(shù)字pcr系統(tǒng)，美國伯樂公司；nanodrop2000c微量分光光度計(jì)，美國thermo公司；研磨機(jī)，德國ika。

農(nóng)作物材料樣品基因組dna采用常規(guī)方法提取與純化。

實(shí)施例1：實(shí)時(shí)熒光pcr檢測方法的建立與優(yōu)化

根據(jù)轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系轉(zhuǎn)入的基因盒5’端與棉花基因組鄰接區(qū)序列(轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性片段，如seqidno.5所示)，應(yīng)用primerprimer5.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針。將設(shè)計(jì)的引物、探針經(jīng)ncbi網(wǎng)站上使用blast數(shù)據(jù)庫比對(duì)確定引物和探針的理論特異性；棉花內(nèi)源基因adhc用于棉花來源樣品dna的檢測及轉(zhuǎn)基因成分的相對(duì)定量。具體引物探針信息見表1。

表1實(shí)時(shí)熒光pcr的引物、探針

對(duì)退火溫度及引物探針配比進(jìn)行優(yōu)化：

a組的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon88701-f和mon88701-r各0.5μl，10μmol/l檢測探針mon88701-p1μl，34000copies/μldna模板(轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系基因組dna)2μl和ddh2o8.3μl；

b組的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon88701-f和mon88701-r各0.4μl，10μmol/l檢測探針mon88701-p0.8μl，34000copies/μldna模板(轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系基因組dna)2μl和ddh2o8.7μl；

c組的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon88701-f和mon88701-r各0.2μl，10μmol/l檢測探針mon88701-p4μl，34000copies/μldna模板(轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系基因組dna)2μl和ddh2o5.9μl。

退火溫度為58℃時(shí)的反應(yīng)程序?yàn)?5℃30s；95℃5s、58℃34s，40個(gè)循環(huán)，于58℃收集熒光信號(hào)；

退火溫度為60℃時(shí)的反應(yīng)程序?yàn)?5℃30s；95℃5s、60℃34s，40個(gè)循環(huán)，于60℃收集熒光信號(hào)。

結(jié)果顯示：在退火溫度為58℃時(shí)的擴(kuò)增圖如圖1所示，圖中從左到右分別為b、a和c組的擴(kuò)增曲線，b組ct值最小；

在退火溫度為60℃時(shí)的擴(kuò)增圖如圖2所示，圖中從左到右分別為a、b和c組的擴(kuò)增曲線，a組擴(kuò)增效率稍高，b和c組ct值接近，但三組的ct值均較退火溫度為58℃時(shí)ct值高。

綜合以上考慮，基于經(jīng)濟(jì)性和擴(kuò)增效率，考慮選擇58℃作為退火溫度、b組引物探針配比為本實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增反應(yīng)體系。

實(shí)施例2：實(shí)時(shí)熒光pcr方法特異性測試

提取轉(zhuǎn)基因油菜mon88302、轉(zhuǎn)基因油菜dp-073496-4、轉(zhuǎn)基因棉花mon88913、轉(zhuǎn)基因大豆a2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆gts40-30-2、轉(zhuǎn)基因玉米mon810、轉(zhuǎn)基因玉米bt11、轉(zhuǎn)基因玉米mir162、轉(zhuǎn)基因玉米nk603、轉(zhuǎn)基因甜菜h7-1、非轉(zhuǎn)基因棉花的基因組dna為模板，陽性對(duì)照為adhc-mon88701質(zhì)粒，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因大米dna。對(duì)建立的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測方法的特異性進(jìn)行測試。

擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon88701-f和mon88701-r各0.4μl，10μmol/l檢測探針mon88701-p0.8μl，dna模板2μl和ddh2o8.7μl；反應(yīng)程序?yàn)?5℃30s；95℃5s、58℃34s，40個(gè)循環(huán)，于58℃收集熒光信號(hào)。

結(jié)果顯示(圖3)，采用轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性引物mon88701-f/r和探針mon88701-p進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr時(shí)，只有陽性樣品adhc-mon88701質(zhì)粒的dna模板有典型熒光擴(kuò)增曲線，以其他農(nóng)作物材料dna為模板的反應(yīng)均無典型熒光擴(kuò)增曲線。表明本發(fā)明的檢測方法特異性良好。

實(shí)施例3：靈敏度測試、可重復(fù)性測試及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將提取的adhc-mon88701質(zhì)粒dna溶液加te緩沖液分別稀釋至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μl作為dna模板進(jìn)行轉(zhuǎn)基因棉花mon88701實(shí)時(shí)熒光pcr檢測，實(shí)時(shí)熒光pcr檢測反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例2，進(jìn)行靈敏度測試：

測試結(jié)果顯示(圖4)，340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μl范圍內(nèi)9個(gè)濃度梯度均能有典型擴(kuò)增曲線，其最低檢測濃度為17copies/μl。擴(kuò)增圖從左至右分別為te緩沖液稀釋至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μl擴(kuò)增曲線。

將提取的adhc-mon88701質(zhì)粒dna溶液加te緩沖液分別稀釋至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μl作為dna模板，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系實(shí)時(shí)熒光pcr檢測，進(jìn)行線性范圍測試及可重復(fù)性測試，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，水為空白對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光pcr檢測反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例2：

測試結(jié)果的ct值如表2所示；根據(jù)表2中ct值數(shù)據(jù)與在34-680000copies范圍內(nèi)9個(gè)濃度的對(duì)數(shù)值與所得ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，線性回歸方程為：y＝-3.48x+39.91，r²＝0.99，擴(kuò)增效率：94％(介于90％～110％)，表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測方法在模板量34-680000copies范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，擴(kuò)增效率高，符合engl相關(guān)要求[definitionofminimumperformancerequirementsforanalyticalmethodsofgmotesting]；且在模板量為34-680000copies的線性范圍內(nèi)，其ct值的sd介于0.22-0.62，rsd介于0.78％-2.90％，表明在線性范圍內(nèi)最低模板量34copies時(shí)，其sd和rsd均小于25％，所以本發(fā)明的定量檢測下限為34copies。

表2實(shí)時(shí)熒光pcr方法的靈敏度及可重復(fù)性測試

本發(fā)明針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系轉(zhuǎn)入的基因盒5’端與棉花基因組鄰接區(qū)序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立的轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測方法，可對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花mon88701進(jìn)行品系特異性快速、高通量的定性及精準(zhǔn)定量檢測，滿足檢測、監(jiān)管部門對(duì)其進(jìn)行標(biāo)識(shí)的需求。

序列表

<110>中華人民共和國黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局

<120>轉(zhuǎn)基因棉花mon88701品系特異性實(shí)時(shí)熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒

<160>6

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaaatgcagagttacaagaacatcc25

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgacgaattctgcagaagcttg22

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ccaaagcccgggcttaattaaggc24

<210>4

<211>140

<212>dna

<213>棉花

<400>4

aaactttacttttttctccattttggatatatataaacacatgacttagcccatctttgc60

ttgcaggttttggtgccactgtgaatgttgctaaaccaaaaaagggtgggtttgttgcag120

tttttggacttggtgctgta140

<210>5

<211>211

<212>dna

<213>轉(zhuǎn)基因棉花mon88701

<400>5

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