本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測耳聾易感基因突變的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

耳聾是一種嚴重影響人類生活質(zhì)量的常見疾病，在世界范圍內(nèi)，平均每1000名新生兒中就有1名先天性耳聾患兒。2006年底第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，中國聽力殘疾者共2670萬人，占殘疾人總數(shù)的19.3％；1-7歲聽力障礙兒童為80萬，每年新生聾兒超過3萬。耳聾可由環(huán)境因素(如醫(yī)療因素、環(huán)境暴露、創(chuàng)傷、藥物等)引起，也可以由相關(guān)基因的突變或基因和環(huán)境兩者共同作用而致，其中遺傳因素占60％。在新生兒聽力篩查的基礎(chǔ)上進行耳聾易感基因篩查，可以對攜帶有耳聾基因的潛在聽力損失兒童做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，減少漏診；針對育齡期婦女及普通人群進行耳聾易感基因篩查，可以為其提供生育和遺傳指導。最常見的耳聾易感基因包括gjb2、slc26a4、線粒體12srrna和gjb3。

目前用于耳聾易感基因突變檢測的方法主要有芯片法、arms-pcr法、熒光pcr法。芯片法通量較高，但操作繁瑣(一般包括擴增、雜交、洗片和掃描等步驟)、耗時長，所需設(shè)備較多(pcr儀、雜交儀和掃描儀等多種配套儀器)、芯片成本較高，且易造成污染。arms-pcr法通量低，耗時較長，且存在非特異擴增問題。基于taqman探針的熒光pcr法通量較低，成本較高(針對同一突變位點需要合成兩條探針)。因此，現(xiàn)有技術(shù)很難滿足耳聾易感基因突變檢測的臨床需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基于多重不對稱pcr及熔解曲線分析技術(shù)的耳聾易感基因檢測試劑盒及其應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有耳聾易感基因檢測耗時長、準確率低以及成本高的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供一種檢測耳聾易感基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括pcr反應(yīng)液，所述pcr反應(yīng)液包括：用于擴增12srrna基因中m.1555a>g位點和m.1494c>t位點的第一上游引物和第一下游引物，用于擴增內(nèi)參基因rpp30的第二上游引物和第二下游引物，用于擴增slc26a4基因中c.2168a＞g位點的第三上游引物和第三下游引物，用于擴增gjb3基因中c.538c＞t位點的第四上游引物和第四下游引物，用于擴增slc26a4基因中ivs7-2a>g位點的第五上游引物和第五下游引物，用于擴增gjb2基因中c.176_191del16位點、c.235delc位點的第六上游引物和第六下游引物，用于擴增gjb2基因中c.299_300delat位點的第七上游引物和第七下游引物，用于擴增gjb2基因中c.35delg位點的第八上游引物和第八下游引物，用于不對稱pcr擴增的通用引物即第九引物，以及

檢測所述m.1555a>g位點的第一探針，檢測所述m.1494c>t位點的第二探針，檢測所述內(nèi)參基因rpp30的第三探針，檢測所述c.2168a＞g位點的第四探針，檢測所述c.538c＞t位點的第五探針，檢測所述ivs7-2a>g位點的第六探針，檢測所述c.176_191del16位點的第七和第八探針，檢測所述c.235delc位點的第九探針，檢測所述c.299_300delat位點的第十探針，檢測所述c.35delg位點的第十一探針，

其中，所述第一上游引物的序列如seqidno:1所示，所述第一下游引物的序列如seqidno:2所示，所述第二上游引物的序列如seqidno:3所示，所述第二下游引物的序列如seqidno:4所示，所述第三上游引物的序列如seqidno:5所示，所述第三下游引物的序列如seqidno:6所示，所述第四上游引物的序列如seqidno:7所示，所述第四下游引物的序列如seqidno:8所示，所述第五上游引物的序列如seqidno:9所示，所述第五下游引物的序列如seqidno:10所示，所述第六上游引物的序列如seqidno:11所示，所述第六下游引物的序列如seqidno:12所示，所述第七上游引物的序列如seqidno:13所示，所述第七下游引物的序列如seqidno:14所示，所述第八上游引物的序列如seqidno:15所示，所述第八下游引物的序列如seqidno:16所示，所述第九引物的序列如seqidno:17所示，所述第一探針的序列如seqidno:19所示，所述第二探針的序列如seqidno:20所示，所述第三探針的序列如seqidno:21所示，所述第四探針的序列如seqidno:22所示，所述第五探針的序列如seqidno:23所示，所述第六探針的序列如seqidno:24所示，所述第七探針的序列如seqidno:25所示，所述第八探針的序列如seqidno:26所示，所述第九探針的序列如seqidno:27所示，所述第十探針的序列如seqidno:28所示，所述第十一探針的序列如seqidno:29所示，且十一條所述探針的5’端具有熒光報告基團，3’端具有熒光淬滅基團。

本發(fā)明另一方面提供一種上述的試劑盒的應(yīng)用，所述試劑盒用于檢測耳聾易感基因時，對應(yīng)的熒光pcr熔解曲線檢測程序如下：

50℃3min，95℃3min；

95℃15s，72℃～62℃30s，10個循環(huán)，其中72℃～62℃30s每個循環(huán)下降1℃；

95℃15s，62℃30s，50個循環(huán)，在62℃退火階段采集熒光信號；

95℃1min，70℃3min，35℃3min，35℃～90℃，其中35℃～90℃以0.03℃/s的速率升溫，且在此階段采集熒光信號。

本發(fā)明提供的檢測耳聾易感基因突變的試劑盒，利用熒光pcr熔解曲線分析檢測耳聾易感基因的突變，其根據(jù)常見的4個耳聾易感基因中的9個高頻突變位點，并選擇一種內(nèi)參基因rpp30(重組人核糖核酸酶p蛋白30kd亞基-p30)，設(shè)計了17條引物單鏈和11條探針，在一管pcr體系中同時檢測4個耳聾易感基因的9個突變位點的基因型及1個內(nèi)參基因。

本發(fā)明的基本原理是利用多重不對稱pcr及熔解曲線分析技術(shù)進行基因檢測。本發(fā)明具體內(nèi)容是針對耳聾易感基因的突變位點所在序列設(shè)計擴增引物和熒光探針，在每對擴增引物序列設(shè)計中，除包含突變位點所在常規(guī)序列特異性片段外，特別在其中一條擴增引物5’端含有一段通用引物序列(為20bp左右的一段和人類基因序列相似性低、經(jīng)檢測不能針對人類基因組產(chǎn)生擴增片段的序列)；另一條擴增引物含有一段平衡序列(使正反向引物長度趨于一致),如表1所示。針對每個擴增片段的擴增均有3條引物參與，即正反向擴增引物和通用引物。目的是提高多重不對稱pcr擴增效率，并平衡多重特異擴增引物對之間的競爭關(guān)系，使不對稱擴增所得各目的片段(即可以和探針互補結(jié)合的單鏈)大量均衡積累。

按照所選擇的條件將所有引物、探針、酶和dna模板加入同一pcr擴增反應(yīng)管，進行多重不對稱pcr擴增，隨后進行低溫到高溫的熔解曲線分析，由于熒光探針與匹配程度不同靶形成的異源雙鏈的穩(wěn)定性不同，即tm值不同，熒光探針與完全互補的靶形成的異源雙鏈的熔點最高，與有一個或兩個堿基錯配的靶形成的異源雙鏈的熔點較低，其熔點與錯配堿基的類型、位置均有關(guān)系，故一種特定的基因型對應(yīng)一個特異的tm值，通過不同tm值即可獲知不同基因型。

本發(fā)明具有如下有益效果：(1)單管檢測位點多：本發(fā)明充分挖掘了多重不對稱pcr和探針熔解曲線技術(shù)的潛力，采用優(yōu)化的八重pcr擴增體系和探針雜交體系、在熒光pcr儀每個檢測通道同時進行2至3個位點的檢測，從而實現(xiàn)了在單管同時檢測10個位點(9個耳聾易感基因突變位點和一個內(nèi)參基因特異片段)，在單管檢測位點數(shù)目上實現(xiàn)了突破，避免了臨床上針對同一樣本進行多管檢測的不便，也可為其它基因檢測產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)方法上的借鑒。(2)突變覆蓋率高：本發(fā)明針對中國人群最常見4個耳聾易感基因9個位點及1個內(nèi)參基因進行檢測，對中國人群的突變覆蓋率高。(3)通量高、成本低：本發(fā)明在一管pcr體系中完成4個基因9個位點的突變檢測，大幅節(jié)約反應(yīng)物料，而且pcr擴增可以在普通pcr儀上運行，一臺熒光pcr儀可配合多臺普通pcr儀完成熔解曲線分析，可以提高熒光pcr儀的利用率，大大提高檢測通量，降低成本。(4)簡便快速、耗時短：本發(fā)明基于熒光pcr熔解曲線分析技術(shù)，pcr擴增結(jié)束后經(jīng)一次熒光pcr熔解曲線分析即可獲知樣本基因型，整個操作可在2～3小時完成。(5)減少污染：本發(fā)明為均相檢測體系，pcr及熔解曲線分析都在同一封閉的反應(yīng)管中完成，無需pcr后處理，減少了pcr產(chǎn)物的污染。(6)檢測特異性高、結(jié)果容易判讀：本發(fā)明是通過熔解峰對應(yīng)的熔點來判定基因型，結(jié)果易于判讀，準確可靠，故檢測特異性高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例3中試劑盒的檢測體系在fam熒光通道的各位點的檢測結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實施例3中試劑盒的檢測體系在hex熒光通道的各位點的檢測結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實施例3中試劑盒的檢測體系在rox熒光通道的各位點的檢測結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實施例3中試劑盒的檢測體系在cy5熒光通道的各位點的檢測結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明對比例中兩種反應(yīng)體系針對相同樣本檢測在fam熒光通道產(chǎn)生的熔解曲線圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實施例提供了一種檢測耳聾易感基因突變的試劑盒，其包括pcr反應(yīng)液，所述pcr反應(yīng)液包括：

用于擴增12srrna基因中m.1555a>g位點和m.1494c>t位點的第一上游引物和第一下游引物，用于擴增內(nèi)參基因rpp30的第二上游引物和第二下游引物，用于擴增slc26a4基因中c.2168a＞g位點的第三上游引物和第三下游引物，用于擴增gjb3基因中c.538c＞t位點的第四上游引物和第四下游引物，用于擴增slc26a4基因中ivs7-2a>g位點的第五上游引物和第五下游引物，用于擴增gjb2基因中c.176_191del16位點、c.235delc位點的第六上游引物和第六下游引物，用于擴增gjb2基因中c.299_300delat位點的第七上游引物和第七下游引物，用于擴增gjb2基因中c.35delg位點的第八上游引物和第八下游引物，用于不對稱pcr擴增的通用引物即第九引物，以及

檢測所述m.1555a>g位點的第一探針，檢測所述m.1494c>t位點的第二探針，檢測所述內(nèi)參基因rpp30的第三探針，檢測所述c.2168a＞g位點的第四探針，檢測所述c.538c＞t位點的第五探針，檢測所述ivs7-2a>g位點的第六探針，檢測所述c.176_191del16位點的第七和第八探針，檢測所述c.235delc位點的第九探針，檢測所述c.299_300delat位點的第十探針，檢測所述c.35delg位點的第十一探針，

其中，如表1和表2所示，所述第一上游引物的序列如seqidno:1所示，所述第一下游引物的序列如seqidno:2所示，所述第二上游引物的序列如seqidno:3所示，所述第二下游引物的序列如seqidno:4所示，所述第三上游引物的序列如seqidno:5所示，所述第三下游引物的序列如seqidno:6所示，所述第四上游引物的序列如seqidno:7所示，所述第四下游引物的序列如seqidno:8所示，所述第五上游引物的序列如seqidno:9所示，所述第五下游引物的序列如seqidno:10所示，所述第六上游引物的序列如seqidno:11所示，所述第六下游引物的序列如seqidno:12所示，所述第七上游引物的序列如seqidno:13所示，所述第七下游引物的序列如seqidno:14所示，所述第八上游引物的序列如seqidno:15所示，所述第八下游引物的序列如seqidno:16所示，所述第九引物的序列如seqidno:17所示，所述第一探針的序列如seqidno:19所示，所述第二探針的序列如seqidno:20所示，所述第三探針的序列如seqidno:21所示，所述第四探針的序列如seqidno:22所示，所述第五探針的序列如seqidno:23所示，所述第六探針的序列如seqidno:24所示，所述第七探針的序列如seqidno:25所示，所述第八探針的序列如seqidno:26所示，所述第九探針的序列如seqidno:27所示，所述第十探針的序列如seqidno:28所示，所述第十一探針的序列如seqidno:29所示，且十一條所述探針的5’端具有熒光報告基團，3’端具有熒光淬滅基團。

表1

表2

本發(fā)明實施例提供的檢測耳聾易感基因突變的試劑盒，利用熒光pcr熔解曲線分析檢測耳聾易感基因的突變，其根據(jù)常見的4耳聾易感基因中的9個高頻突變位點，并選擇一種內(nèi)參基因rpp30，設(shè)計了17條引物單鏈和11條探針，可以在一管pcr體系中同時檢測4個耳聾易感基因的9個突變位點的基因型及1個內(nèi)參基因。因此具有簡便快速、耗時短、通量高、成本低等特點。內(nèi)參的選擇，更進一步提高本發(fā)明的檢測準確性。

優(yōu)選地，上述熒光報告基團為alex-350、fam、vic、tet、calfluorgold540、joe、hex、calflourorange560、tamra、calfluorred590、rox、calfluorred610、texasred、calflourred635、quasar670、cy3、cy5、cy5.5和quasar705中的任意一種，熒光淬滅基團為dabcyl、bhq、eclipse和tamra中的任意一種。具體地，在本發(fā)明一實施例中，第一探針的5’端連有fam，3’端連有bhq1；第二探針的5’端連有fam，3’端連有bhq1；第三探針的5’端連有fam，3’端連有bhq1；第四探針的5’端連有hex，3’端連有bhq1；第五探針的5’端連有hex，3’端連有bhq1；第六探針的5’端連有rox，3’端連有bhq2；第七探針的5’端連有rox，3’端連有bhq2；第八探針的5’端連有rox，3’端連有bhq2；第九探針的5’端連有rox，3’端連有bhq2；第十探針的5’端連有cy5，3’端連有bhq2；第十一探針的5’端連有cy5，3’端連有bhq2。

優(yōu)選地，上述pcr反應(yīng)液還包括：pcrbuffer、dntps、mgcl2和pcr反應(yīng)酶；且所述pcrbuffer包括：tris-hcl、kcl和50％甘油；所述pcr反應(yīng)酶包括ung酶和dna聚合酶，且所述ung酶和所述dna聚合酶的濃度比為1:10；所述pcr反應(yīng)液中dntps中dgtp:dctp:datp:dttp:dutp＝4:4:4:3:1。上述試劑盒中的pcr反應(yīng)酶在本說明書中定義為el酶，本發(fā)明實施例提供的pcr反應(yīng)酶使擴增效果達到最佳。在本發(fā)明實施例提供的反應(yīng)液條件下，為樣本檢測提供一個良好的pcr擴增體系。

優(yōu)選地，上述試劑盒還包括第一陽性對照、第二陽性對照、第三陽性對照、陰性對照，

優(yōu)選地，上述試劑盒中的第一陽性對照(本說明書中定義為el陽性對照1)包括上述八對引物擴增的未突變核苷酸序列，即為9個位點野生型序列及內(nèi)參基因的等量混合物，檢測位點的基因型均為野生型；上述試劑盒中的第二陽性對照(本說明書中定義為el陽性對照2)包含第六上游引物和第六下游引物擴增的c.235delc位點突變型序列及其它七對引物擴增的未突變核苷酸序列，即為c.235delc位點突變型序列、另外七個位點野生型序列及內(nèi)參基因的等量混合物，檢測的基因型除c.235delc為突變型外，其它位點均為野生型；上述試劑盒中的第三陽性對照(本說明書中定義為el陽性對照3)包括所述第一上游引物和第一下游引物擴增的m.1555a＞g位點突變型序列及其它七對引物擴增的未突變核苷酸序列，即為m.1555a＞g位點突變型序列、七個位點野生型序列及內(nèi)參基因的等量混合物，檢測的基因型除m.1555a＞g為突變型外，其它位點均為野生型。陽性對照序列可以人工合成；而陰性對照(本說明書中定義為el陰性對照)包括tris-edta緩沖液。

另一方面，本發(fā)明實施例還提供了上述試劑盒的應(yīng)用，該試劑盒用于檢測耳聾易感基因時，對應(yīng)的熒光pcr熔解曲線檢測程序如下：

50℃3min，95℃3min；

95℃15s，72℃～62℃30s，10個循環(huán)，其中72℃～62℃30s每個循環(huán)下降1℃；

95℃15s，62℃30s，50個循環(huán)，在62℃退火階段采集熒光信號；

95℃1min，70℃3min，35℃3min，35℃～90℃，其中35℃～90℃以0.03℃/s的速率升溫，且在此階段采集熒光信號。

本發(fā)明實施例提供的上述熒光pcr熔解曲線檢測程序所采集到的熒光信號達到最佳。

優(yōu)選地，該試劑盒用于檢測耳聾易感基因前，其中的pcr反應(yīng)液預(yù)分裝于熒光pcr八連管中。如此，只需加入模板dna這一步操作即可上機檢測，省略pcr反應(yīng)液配制等過程，顯著提高了檢測速度，具有檢測流程短的特點。

本發(fā)明先后進行過多次試驗，現(xiàn)列舉一部分試驗結(jié)果作為參考對發(fā)明進行進一步詳細描述，下面結(jié)合具體實施例進行詳細說明。

實施例1

一種檢測耳聾易感基因突變的試劑盒，本試劑盒中的引物和探針根據(jù)genebank中的人gjb2、slc26a4、線粒體12srrna、gjb3和rpp30基因序列設(shè)計。

其中，擴增引物的設(shè)計方法是，從genebank下載得到對應(yīng)序列后，利用primerpremier5軟件設(shè)計各個位點的擴增引物，設(shè)置引物長度為18-30bp，tm值在55-65℃范圍。在反向引物5’端加入通用引物序列(選取一段20bp左右、和人類基因序列相似性低、經(jīng)檢測不能針對人類基因組產(chǎn)生擴增片段的序列)，在正向引物序列5’端加入平衡序列(長度和同用引物接近，和人類基因序列相似性低、經(jīng)檢測不能針對人類基因組產(chǎn)生擴增片段的序列)。遵循雜交探針設(shè)計的一般原則，選擇覆蓋突變位點的適宜長度的序列作為探針(一般為18-30bp)，相同檢測通道不同位點的探針之間的tm值差異一般要求達到10以上。

具體序列如表1和表2所示。探針在設(shè)計完成后需要加上熒光基團和淬滅基團，其中第一探針的5’端連有fam，3’端連有bhq1；第二探針的5’端連有fam，3’端連有bhq1；第三探針的5’端連有fam，3’端連有bhq1；第四探針的5’端連有hex，3’端連有bhq1；第五探針的5’端連有hex，3’端連有bhq1；第六探針的5’端連有rox，3’端連有bhq2；第七探針的5’端連有rox，3’端連有bhq2；第八探針的5’端連有rox，3’端連有bhq2；第九探針的5’端連有rox，3’端連有bhq2；第十探針的5’端連有cy5，3’端連有bhq2；第十一探針的5’端連有cy5，3’端連有bhq2。

實施例2

一種檢測耳聾易感基因突變的試劑盒，本試劑盒包含pcr反應(yīng)液(用熒光pcr八連管預(yù)分裝，每管含pcr反應(yīng)液35μl，包含實施例1中的引物和探針)、el陽性對照1(為9個位點野生型序列及內(nèi)參基因的等量混合物)、el陽性對照2(為235delc位點突變型序列、7個位點野生型序列及內(nèi)參基因的等量混合物)、el陽性對照3(為1555a＞g位點突變型序列、7個位點野生型序列及內(nèi)參基因的等量混合物)、el陰性對照(tris-edta緩沖液)。其中，pcr反應(yīng)液包括：1×pcrbuffer(包括tris-hcl、kcl和體積比為50％甘油)、dntp0.25mm、mgcl21.5mm、el酶0.2u/μl，上述前八對引物濃度均為0.1μm、第九引物的濃度為2μm，11條探針濃度均為0.25μm。

本試劑盒對應(yīng)的熒光pcr熔解曲線檢測程序如下：

50℃3min，95℃3min；

95℃15s，72℃～62℃30s，10個循環(huán)，其中72℃～62℃30s每個循環(huán)下降1℃；

95℃15s，62℃30s，50個循環(huán)，在62℃退火階段采集fam、hex、rox、cy5通道的熒光信號；

95℃1min，70℃3min，35℃3min，35℃～90℃，其中35℃～90℃以0.03℃/s的速率升溫，且在此階段采集fam、hex、rox、cy5通道的熒光信號。

實施例3

用實施例2的試劑盒進行檢測分析，使用的儀器為slan96s實時熒光pcr儀(上海宏時醫(yī)療科技有限公司)，具體步驟如下：

(1)利用核酸提取試劑盒(深圳聯(lián)合醫(yī)學科技有限公司，備案號：粵深械備20160073號)提取4個人的全血樣本(edta抗凝血)的基因組dna；通過微量紫外分光光度計(德國implennanophotometer^tmp-clas微量分光光度計)測定dna的od260、od280和濃度得：od260/od280值在1.5～2.0之間，dna濃度范圍為10ng/μl～100ng/μl；以此獲得的dna樣本可用于突變檢測。

(2)從試劑盒中取一條預(yù)分裝pcr反應(yīng)液的八連管，前四管中依次加入5μl步驟(1)中提取的dna，另四個管中分別加入試劑盒中配備的el陽性對照1、el陽性對照2、el陽性對照3和el陰性對照各5μl，并按實施例2中的熒光pcr熔解曲線檢測程序進行檢測。

(3)結(jié)果判讀：本發(fā)明的試劑盒對9種突變類型及內(nèi)參基因都可檢測出特異的熔解曲線信號，各位點相應(yīng)基因型所對應(yīng)熔解峰如圖1至圖4所示。計算各位點熔解峰與el陽性對照1對應(yīng)熔解峰的tm值差異，即δtm＝tm(陽性對照1)-tm(待測樣本)，各檢測通道的突變位點、野生型tm參考值、野生型及突變型對應(yīng)δtm值歸納如下表3所示。

表3

實驗結(jié)果顯示el陰性對照無熔解峰、el陽性對照1在各通道熔解峰tm均符合野生型范圍，el陽性對照2和3分別為c.235delc突變型和m.1555a>g突變型，所以判定此次檢測有效。依據(jù)所得δtm值判別4個樣本對應(yīng)位點的基因型，同時針對各樣本的9個位點所在序列進行測序，將本試劑盒檢測結(jié)果和測序所得結(jié)果進行比較，結(jié)果如下表4所示。從表4中的結(jié)果可知，采用本實施例的試劑盒針對4個樣本的檢測結(jié)果和測序結(jié)果完全一致。

表4

對比例

本發(fā)明的試劑盒所用引物和普通引物的對比實驗：合成一組不帶有通用序列與平衡序列的引物(即為普通引物，其核苷酸序列為：從相應(yīng)的seqidno:1-16所示的八對引物中，每一對引物剔除通用序列和平衡序列所剩余的序列)。本發(fā)明的引物組(定義為實驗組1)采用實施例3的方法配制反應(yīng)體系；普通引物組(定義為實驗組2)則用8對普通引物充當擴增引物，且各上游引物的濃度為0.03μm，各下游引物的濃度為0.15μm，不加通用引物，其它物料和實驗組1相同。選取4個合格的dna樣本，利用實驗組1和實驗組2分別進行檢測。

比較兩組實驗的結(jié)果，部分熔解曲線圖見圖5，結(jié)果顯示，兩種反應(yīng)體系針對同一位點檢測所得tm值基本一致，實驗組1的峰高明顯高于實驗組2，且實驗組1不同位點的峰高更加均衡，更易于判斷結(jié)果。說明采用包含通用序列的引物組合在優(yōu)化的反應(yīng)條件下能夠獲得更多的目的序列單鏈，從而產(chǎn)生更高的熔解曲線峰；通用引物有效平衡了不同引物擴增效率的差異，減弱了多重體系中各引物之間的競爭和相互作用，使得不同序列的擴增速度更加均衡，從而不同位點的峰高趨于平衡，特異性更高，結(jié)果更準確且方便讀取。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳聯(lián)合醫(yī)學科技有限公司

<120>檢測耳聾易感基因突變的試劑盒及其應(yīng)用

<160>29

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gctgcaatcgagcatgacacccccagaaaactacgatagccc42

<210>2

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctagcgactggcattagcgctagctcagagcggtcaagtta41

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gctgcaatcgagcatgacactctttgattctttccatttag41

<210>4

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctagcgactggcattagcgcctaaatggaaagaatcaaaga41

<210>5

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gctgcaatcgagcatgacacacaaaaatttcttttcctag40

<210>6

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctagcgactggcattagcgctggaaccttgaccctcttga40

<210>7

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gctgcaatcgagcatgacactctacctgctgcacactctct41

<210>8

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ctagcgactggcattagcgcgggtcctgcgaggcctgcaca41

<210>9

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gctgcaatcgagcatgacaccgtctgtatggcagttaag39

<210>10

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

ctagcgactggcattagcgcattagtactaagaggaacac40

<210>11

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gctgcaatcgagcatgacacggaggtgtggggagatgagc40

<210>12

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

ctagcgactggcattagcgcagcgctggcgtggacacgaag41

<210>13

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gctgcaatcgagcatgacacctagtggccatgcacgtggc40

<210>14

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ctagcgactggcattagcgcgatctcctcgatgtccttaa40

<210>15

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

gctgcaatcgagcatgacacatggattggggcacgctgca40

<210>16

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ctagcgactggcattagcgctgttgcagacaaagtcggcct41

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ctagcgactggcattagcgc20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gctgcaatcgagcatgacac20

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

tatagaggagacaagtcgtaaca23

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

cccgtcaccctcctcaagtata22

<210>21

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

aaaatcagacaacagctacatc22

<210>22

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

ttgacggtccgtgatgctatac22

<210>23

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

actgctacattgcccgacc19

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

ttttatttcggacgataattg21

<210>25

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

cagccagctacgatcactact21

<210>26

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

caggctgcaagaacgtgtgcta22

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

ctatgggccctgcagctgat20

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

ctaccggagacatgagaagaag22

<210>29

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

acgatcctggggggtgtgaacaa23