本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及黑曲霉的固定化方法。
背景技術(shù)：
檸檬酸又名枸櫞酸，化學(xué)名稱(chēng)2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸，是一種重要的有機(jī)酸，無(wú)色晶體，常含一分子結(jié)晶水，無(wú)臭，有很強(qiáng)的酸味，易溶于水。檸檬酸的物理性狀一般為無(wú)色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉末，極易溶于水，溶解度隨溫度的升高而增大。檸檬酸是一種三羧酸類(lèi)化合物，并因此而與其他羧酸有相似的性質(zhì)。加熱至175℃時(shí)它會(huì)分解產(chǎn)生二氧化碳和水，剩余一些白色晶體。檸檬酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸，有3個(gè)h+可以電離；加熱可以分解成多種產(chǎn)物，與酸、堿、甘油的等能發(fā)生反應(yīng)。檸檬酸在自然界中分布很廣，主要存在于檸檬、柑橘、菠蘿、梅、李、桃等果實(shí)中。檸檬酸的用途非常廣泛，用于食品工業(yè)占生產(chǎn)量的75％以上，可做為食品的酸味劑，抗氧化劑，ph調(diào)節(jié)劑，用于清涼飲料、果醬、水果和糕點(diǎn)等食品中。用于醫(yī)藥工業(yè)占10％左右，主要用作抗凝血?jiǎng)?、解酸藥、矯味劑、化妝品等。用于化學(xué)工業(yè)等占15％左右，用作緩沖劑、絡(luò)合劑、金屬清洗劑、媒染劑、膠凝劑、調(diào)色劑等。在電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業(yè)領(lǐng)域中都有十分廣闊的應(yīng)用。
黑曲霉(aspergillusniger)屬于半知菌亞門(mén)，絲孢綱，絲孢目，縱梗孢科，曲霉屬真菌中的常見(jiàn)種。黑曲霉廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中。黑曲霉的最適溫度為37℃，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較低，容易培養(yǎng)。黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生長(zhǎng)稍局限，菌絲處為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無(wú)色或中央略帶黃褐色。頂部形成球形頂囊，其上面覆蓋一層?；鸵粚有」＃」ｋp層褐色，?；^短，上面長(zhǎng)有成串黑褐色的球狀分生孢子。黑曲霉的菌落形態(tài)比較特殊，容易分辨和分離。黑曲霉可以生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶等酶制劑和檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等有機(jī)酸，是一種重要的發(fā)酵工業(yè)菌種?，F(xiàn)在工業(yè)上一般采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，但是由于黑曲霉在液體培養(yǎng)時(shí)菌量很大，造成發(fā)酵液過(guò)于粘稠，從而影響了發(fā)酵時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，同時(shí)對(duì)產(chǎn)物與菌體的分離也會(huì)造成不利的影響。
隨著固定化技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物發(fā)酵領(lǐng)域。將絲狀真菌菌絲體固定在谷?；蚱渌恍┒栊圆牧仙?，或者采用海藻酸鈉等載體材料包埋的方法，重復(fù)使用，既降低了發(fā)酵液粘度，利于氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，提高了細(xì)胞利用率和生物反應(yīng)速率，同時(shí)也便于產(chǎn)物的分離提取等后處理加工。近年來(lái)，絲狀真菌的固定化發(fā)酵生產(chǎn)得到了越來(lái)越多的關(guān)注。
目前應(yīng)用于黑曲霉的固定方法常見(jiàn)的有吸附法和包埋法，但是國(guó)內(nèi)仍然以包埋法為主。王建龍等用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％的海藻酸鈉包埋一定量的孢子，于搖瓶中培養(yǎng)11天后，發(fā)酵液中檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到40g/l，并經(jīng)過(guò)了6批次連續(xù)重復(fù)發(fā)酵產(chǎn)酸穩(wěn)定在較高水平。周劍平等采用聚乙烯醇凝膠載體固定黑曲霉的孢子，以初始糖濃度130g/l的玉米粉水解液為底物進(jìn)行發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵8個(gè)周期后，檸檬酸產(chǎn)量可以保持穩(wěn)定，始終保持在86～92g/l，產(chǎn)率達(dá)到70.7％。但是，包埋法所用到的凝膠顆粒機(jī)械性能很差，在攪拌發(fā)酵的時(shí)候很容易發(fā)生破碎，同時(shí)，包埋法仍然會(huì)對(duì)顆粒中心的菌體的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞造成阻礙，因此對(duì)其檸檬酸的生產(chǎn)效率有了一定的限制。為了更進(jìn)一步提高檸檬酸的生產(chǎn)效率，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，仍需要尋找更加天然、高效的固定化材料。
近年來(lái)，以多孔纖維材料作為固定化介質(zhì)的纖維床生物反應(yīng)器作為一種新型固定化方法受到了廣泛關(guān)注。用多孔纖維材料做固定材料，不僅工藝穩(wěn)定，無(wú)毒，廉價(jià)易得，吸附效果好，重復(fù)使用率高，而且對(duì)細(xì)胞活性具有較好的保護(hù)作用，但是由于黑曲霉的菌絲過(guò)長(zhǎng)，過(guò)多，很容易在纖維床表面長(zhǎng)滿(mǎn)，最后將纖維床包裹在一起，從而嚴(yán)重影響發(fā)酵性能，因此很少有人采用吸附法作為黑曲霉的固定方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種穩(wěn)定高效的黑曲霉的固定化方法。
一種黑曲霉的固定化方法，把經(jīng)過(guò)預(yù)處理的纖維材料作為固定化介質(zhì)，將黑曲霉活化后接入裝有固定化培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中培養(yǎng)，使菌株在培養(yǎng)過(guò)程中吸附于纖維材料上。
優(yōu)選地，所述的纖維材料為棉纖維織物、活性炭纖維、納米纖維、竹纖維、聚醚多元醇泡沫、聚乙烯醇纖維、聚氨酯泡沫、聚乙烯、聚丙烯酰胺、樹(shù)脂、聚酯纖維、絲綢、細(xì)菌纖維素膜、絲瓜瓤和甘蔗渣中的任意一種或幾種。
優(yōu)選地，所述纖維材料以10～50g/l的添加量置于搖瓶容器中。
其中，所述的預(yù)處理具體步驟如下：
(1)將纖維材料置于去離子水中清洗1～3h，再將清洗后的纖維材料置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～50％的naoh溶液中浸泡1～6h，然后將纖維材料置于去離子水中清洗至1～3h，直到naoh被清洗干凈，載體表面呈中性；
(2)將經(jīng)過(guò)步驟(1)處理后的纖維材料置于體積分?jǐn)?shù)為0.1～10％的硅烷偶聯(lián)劑水溶液中，浸泡10～60min，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后置于120℃烘干，保存?zhèn)溆谩?/p>
優(yōu)選地，所述的硅烷偶聯(lián)劑劑為乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、1,2-雙三甲氧基硅基乙烷、甲基苯基二甲氧基硅烷、甲基三乙酰氧基硅烷中的任意一種或幾種。
優(yōu)選地，所述固定化培養(yǎng)基中包括植物浸出液。培養(yǎng)基中添加植物浸出液可以保證黑曲霉可以更好的在纖維材料上固定生長(zhǎng)。
浸出液制作方法為：將1～100g植物放入100～1000ml水中，在90～120℃中放置0.5～3h，再用紗布進(jìn)行過(guò)濾，留下上清液，即植物浸出液。
更優(yōu)選地，所述的植物浸出液為甘蔗渣、玉米芯、玉米秸稈、木薯渣、土豆、麩皮和糠的任意一種或幾種浸出液。
優(yōu)選地，所述的發(fā)酵容器為氣升式發(fā)酵罐，將纖維材料裁剪成長(zhǎng)條狀，沿垂直方向螺旋纏繞在多條不銹鋼絲條上。
優(yōu)選地，所述的發(fā)酵容器為自吸式發(fā)酵罐，將纖維材料平鋪在與其大小形狀相同的鋼絲網(wǎng)上，纖維材料與鋼絲網(wǎng)一起卷成筒狀。
有益效果：相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明優(yōu)勢(shì)如下：
1、本發(fā)明所采用的多孔纖維材料為化學(xué)惰性，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒害作用，機(jī)械強(qiáng)度高，也不會(huì)被細(xì)胞代謝分解，不影響微生物的生長(zhǎng)代謝，黑曲霉不會(huì)在載體表面過(guò)度生長(zhǎng)，而是均勻的吸附在載體中心，同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中，載體上的死細(xì)胞脫落，液體中的新細(xì)胞吸附，從而形成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，減少了對(duì)細(xì)胞的損耗，并且可以重復(fù)多批次發(fā)酵而產(chǎn)量保持穩(wěn)定，減少總的發(fā)酵時(shí)間，節(jié)省成本。
2、選用的多孔纖維材料具有較高的孔隙率和比表面積，因此單位體積固定的細(xì)胞數(shù)目多，不僅固定化的細(xì)胞密度大，保證了高密度發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，而且具有良好的傳質(zhì)性能，傳質(zhì)效率高。和游離發(fā)酵相比，固定化發(fā)酵的產(chǎn)量明顯提高，發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵液中的菌體量明顯減少，粘稠度也隨之降低，從而有利于后期的產(chǎn)物和菌體的分離。
3、以聚酯纖維為固定化介質(zhì)的氣升式纖維床反應(yīng)器生產(chǎn)檸檬酸，連續(xù)生產(chǎn)15批，產(chǎn)酸水平?jīng)]有降低，發(fā)酵工藝穩(wěn)定。最終檸檬酸產(chǎn)量88.65g/l,發(fā)酵速率1.06g/l/h，得率(檸檬酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗)93.3％(w/w)。
附圖說(shuō)明
圖1為氣升式發(fā)酵罐中多孔纖維材料的固定方式示意圖；其中，1表示不銹鋼絲條；2表示多孔纖維材料；
圖2為自吸式發(fā)酵罐中多孔纖維材料的固定方式示意圖；其中，1表示不銹鋼絲網(wǎng)；2表示多孔纖維材料；
圖3為采用本發(fā)明的檸檬酸固定化發(fā)酵方法的示意圖；其中，1表示補(bǔ)料瓶；2表示蠕動(dòng)泵；3表示接種口；4表示排氣口；5表示空壓機(jī)；6表示轉(zhuǎn)子流量計(jì)；7表示空氣過(guò)濾器；8表示空氣分布器；
圖4為植物浸出液對(duì)黑曲霉固定化發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響；
圖5為硅烷偶聯(lián)劑對(duì)載體固定化黑曲霉效果的影響。
具體實(shí)施方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
本發(fā)明所述方法可以適用所有黑曲霉菌株，以下實(shí)施例所使用的生產(chǎn)檸檬酸的菌株為黑曲霉atcc12846。
多孔纖維材料由于表面一般帶有一定的親水性，因此在一定程度上阻礙了絲狀真菌孢子吸附到多孔纖維材料表面，所以要對(duì)多孔纖維材料進(jìn)行相關(guān)預(yù)處理，增強(qiáng)載體的表面疏水性，以促進(jìn)孢子吸附到載體表面。上述多孔纖維材料的預(yù)處理方法所確定的一個(gè)具體實(shí)施方案：
(1)將纖維材料置于去離子水中清洗1～3h，再將清洗后的材料置于10～50％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))naoh中浸泡1～6h，之后將材料置于去離子水中清洗至1～3h，直到naoh被清洗干凈，載體表面呈中性；
(2)將經(jīng)過(guò)步驟(1)處理后的多孔纖維材料置于0.1～10％(體積分?jǐn)?shù))的硅烷偶聯(lián)劑水溶液中，浸泡10～60min，再將多孔纖維材料置于去離子水中充分漂洗后置于120℃烘干，保存?zhèn)溆谩?/p>
所述的硅烷偶聯(lián)劑為乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、1,2-雙三甲氧基硅基乙烷、甲基苯基二甲氧基硅烷、甲基三乙酰氧基硅烷中的任意一種或幾種。
實(shí)施例1多孔纖維材料固定化介質(zhì)的制備
(1)將聚酯纖維在去離子水中清洗1h，再將其置于25％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))naoh中浸泡3h，之后將聚酯纖維在去離子水中清洗3h直到naoh被清洗干凈，載體表面呈中性；
(2)將聚酯纖維置于6％(體積分?jǐn)?shù))的乙烯基三乙氧基硅烷水溶液中浸泡30min，再將聚酯纖維置于去離子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2多孔纖維材料固定化介質(zhì)的制備
(1)將聚乙烯載體在去離子水中清洗1.5h，再將其置于25％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))naoh中浸泡2h，之后將聚乙烯在去離子水中清洗2h直到naoh被清洗干凈，載體表面呈中性；
(2)將聚乙烯置于3％(體積分?jǐn)?shù))的乙烯基三甲氧基硅烷水溶液中浸泡20min，再將聚乙烯置于去離子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例3多孔纖維材料固定化介質(zhì)的制備
(1)將聚醚多元醇泡沫在去離子水中清洗2.5h，再將其置于25％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))naoh中浸泡4h，之后將聚醚多元醇泡沫在去離子水中清洗3h直到naoh被清洗干凈，載體表面呈中性；
(2)將聚醚多元醇泡沫置于2％(體積分?jǐn)?shù))的甲基三乙酰氧基硅烷水溶液中浸泡15min，再將聚醚多元醇泡沫置于去離子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例4多孔纖維材料固定化介質(zhì)的制備
(1)將竹纖維載體在去離子水中清洗1.5h，再將其置于25％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))naoh中浸泡2h，之后將竹纖維在去離子水中清洗2h直到naoh被清洗干凈，載體表面呈中性；
(2)將竹纖維置于5％(體積分?jǐn)?shù))的乙烯基三甲氧基硅烷水溶液中浸泡20min，再將聚乙烯置于去離子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例5多孔纖維材料固定化介質(zhì)的制備
(1)將聚丙烯酰胺在去離子水中清洗3h，再將其置于50％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))naoh中浸泡6h，之后將竹纖維在去離子水中清洗3h直到naoh被清洗干凈，載體表面呈中性；
(2)將聚丙烯酰胺置于10％(體積分?jǐn)?shù))的1,2-雙三甲氧基硅基乙烷水溶液中浸泡60min，再將聚丙烯酰胺置于去離子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例6多孔纖維材料固定化介質(zhì)的制備
(1)將聚氨酯泡沫在去離子水中清洗1h，再將其置于10％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))naoh中浸泡1h，之后將竹纖維在去離子水中清洗1h直到naoh被清洗干凈，載體表面呈中性；
(2)將聚氨酯泡沫置于0.1％(體積分?jǐn)?shù))的甲基苯基二甲氧基硅烷水溶液中浸泡10min，再將聚氨酯泡沫置于去離子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
預(yù)處理后的多孔纖維材料的孔隙率＞90％，比表面積＞30m2/m3，不僅固定化的細(xì)胞密度大，而且具有良好的傳質(zhì)性能。
實(shí)施例7以聚醚多元醇泡沫為固定化介質(zhì)于搖瓶中生產(chǎn)檸檬酸
按照實(shí)施例3的方法將聚醚多元醇泡沫進(jìn)行預(yù)處理，將處理過(guò)的聚醚多元醇泡沫以10g/l的添加量置于搖瓶中，作為搖瓶中固定化發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的固定化介質(zhì)。
固定化培養(yǎng)基成分：葡萄糖50g/l，硫酸銨2g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉1g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，甘蔗渣浸出液10ml/l(甘蔗渣與水以質(zhì)量比為1.5％混合，100℃煮2h后8000rpm離心得到浸出液)；
發(fā)酵換液培養(yǎng)基成分：葡萄糖100g/l，硫酸銨1g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉0.5g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，甘蔗渣浸出液10ml/l，ph4～5。
方法步驟如下：
(1)平板活化：將凍存保藏的黑曲霉孢子接種到平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中35℃靜置培養(yǎng)3～4天活化。
(2)掛膜：用無(wú)菌水充分洗滌黑曲霉平板得到孢子懸液，轉(zhuǎn)接于裝100ml固定化培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，于32～35℃，250rpm搖床中培養(yǎng)24～56h，測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛?。?dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/l，掛膜結(jié)束，將發(fā)酵液全部移出。
(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：將相同體積的發(fā)酵換液培養(yǎng)基補(bǔ)入搖瓶中，于32～35℃，250rpm搖床中培養(yǎng)64～78h。中途測(cè)定殘?zhí)呛?，?dāng)殘?zhí)呛康陀?g/l時(shí)，將瓶中的發(fā)酵液全部移出，再補(bǔ)入新的發(fā)酵換液培養(yǎng)基進(jìn)行下一批發(fā)酵。連續(xù)生產(chǎn)10批，產(chǎn)酸水平基本沒(méi)有下降。最終檸檬酸產(chǎn)量90.63g/l,發(fā)酵速率1.11g/l/h，得率(檸檬酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗)95.4％(w/w)。
實(shí)施例8以聚酯纖維為固定化介質(zhì)的氣升式纖維床反應(yīng)器生產(chǎn)檸檬酸
按實(shí)施例1的方法將聚酯纖維進(jìn)行預(yù)處理，如圖1所示，將聚酯纖維材料2裁剪成長(zhǎng)條狀，呈螺旋狀纏繞在不銹鋼絲柱1的側(cè)柱上，作為氣升式發(fā)酵罐(如圖3)中發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的固定化介質(zhì)，聚酯纖維的添加量為35g/l。
固定化培養(yǎng)基成分：葡萄糖50g/l，硫酸銨2g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉1g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，木薯渣浸出液10ml/l(木薯渣與水以質(zhì)量比為3％混合，100℃煮1h后8000rpm離心得到浸出液)；
發(fā)酵換液培養(yǎng)基成分：葡萄糖100g/l，硫酸銨1g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉0.5g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，木薯渣浸出液10ml/l，ph4～5。
方法步驟如下：
(1)平板活化：將凍存保藏的黑曲霉孢子接種到平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中35℃靜置培養(yǎng)3～4天活化。
(2)掛膜：用無(wú)菌水充分洗滌黑曲霉平板得到孢子懸液，轉(zhuǎn)接于裝10l固定化培養(yǎng)基的15l內(nèi)循環(huán)氣升式發(fā)酵罐中，溫度32～35℃，罐壓0.8～1.5mpa，通氣量1.6～2.0m3/h，培養(yǎng)24～56h，測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛?。?dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/l，則掛膜結(jié)束，將發(fā)酵液全部移出。
(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：將10l的發(fā)酵換液培養(yǎng)基用蠕動(dòng)泵泵入15l氣升罐中，溫度32～35℃，罐壓0.8～1.5mpa，通氣量1.6～2.0m3/h，培養(yǎng)60～82h。中途測(cè)定殘?zhí)呛浚?dāng)殘?zhí)呛康陀?g/l時(shí)，將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液全部移出，再泵入新的發(fā)酵換液培養(yǎng)基進(jìn)行下一批發(fā)酵。連續(xù)生產(chǎn)10批，發(fā)酵周期穩(wěn)定在同一水平。最終檸檬酸產(chǎn)量91.27g/l,發(fā)酵速率1.15g/l/h，得率(檸檬酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗)96.0％(w/w)。
實(shí)施例9以竹纖維為固定化介質(zhì)的自吸式纖維床反應(yīng)器生產(chǎn)檸檬酸
按實(shí)施例4的方法將竹纖維進(jìn)行預(yù)處理，如圖2，將處理過(guò)的竹纖維材料2以10g/l的添加量平鋪在與之大小形狀均相同的鋼絲網(wǎng)1上，與其卷成筒狀，纖維材料層與層之間保持疏松均勻，填充在自吸式發(fā)酵罐中作為生產(chǎn)檸檬酸的固定化介質(zhì)。
固定化培養(yǎng)基成分：葡萄糖50g/l，硫酸銨2g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉1g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，玉米芯浸出液10ml/l(玉米芯與水以質(zhì)量比為2.5％混合，100℃煮3h后8000rpm離心得到浸出液)；
發(fā)酵換液培養(yǎng)基成分：葡萄糖100g/l，硫酸銨1g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉0.5g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，玉米芯浸出液10ml/l，ph4～5。
發(fā)酵方法步驟如下：
(1)平板活化：將凍存保藏的黑曲霉孢子接種到平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中35℃靜置培養(yǎng)3～4天活化。
(2)掛膜：用無(wú)菌水充分洗滌黑曲霉平板得到孢子懸液，轉(zhuǎn)接于裝有6l固定化培養(yǎng)基的自吸式纖維床反應(yīng)器中，溫度32～35℃，罐壓0.5～1.2mpa，通氣量0.6～1.2m3/h，培養(yǎng)24～56h，測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛?。?dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/l，則掛膜結(jié)束，將發(fā)酵液全部移出。
(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：將6l的發(fā)酵換液培養(yǎng)基用蠕動(dòng)泵泵入自吸式纖維床反應(yīng)器中，溫度32～35℃，罐壓0.5～1.2mpa，通氣量0.6～1.2m3/h，培養(yǎng)64～88h。中途測(cè)定殘?zhí)呛?，?dāng)殘?zhí)呛康陀?g/l時(shí)，將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液全部移出，再泵入新的發(fā)酵換液培養(yǎng)基進(jìn)行下一批發(fā)酵。連續(xù)生產(chǎn)15批，產(chǎn)酸水平?jīng)]有降低，發(fā)酵工藝穩(wěn)定。最終檸檬酸產(chǎn)量88.65g/l,發(fā)酵速率1.06g/l/h，得率(檸檬酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗)93.3％(w/w)。
實(shí)施例10以聚醚多元醇泡沫為固定化介質(zhì)于搖瓶中生產(chǎn)檸檬酸
同實(shí)施例7，不同的是聚醚多元醇泡沫以50g/l的添加量置于搖瓶中。
實(shí)施例11添加和不添加植物浸出液對(duì)黑曲霉固定化發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響
本實(shí)施例說(shuō)明植物浸出液對(duì)固定化黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的影響，為探討是否添加植物浸出液對(duì)黑曲霉固定化的影響，對(duì)比了添加與未添加植物浸出液時(shí)固定化黑曲霉的發(fā)酵數(shù)據(jù)。
設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn)，第一組實(shí)驗(yàn)的固定化培養(yǎng)基和發(fā)酵換液培養(yǎng)基中均包括甘蔗渣浸出液，第二組實(shí)驗(yàn)的固定化培養(yǎng)基和發(fā)酵換液培養(yǎng)基中沒(méi)有甘蔗渣浸出液，其他成分與第一組實(shí)驗(yàn)相同。除培養(yǎng)基成分不同外，兩組實(shí)驗(yàn)的其他步驟相同。
按實(shí)施例4的方法將竹纖維進(jìn)行預(yù)處理，將處理過(guò)的竹纖維材料以10g/l的添加量放入500ml錐形瓶中，作為生產(chǎn)檸檬酸的固定化介質(zhì)。
固定化培養(yǎng)基成分：葡萄糖50g/l，硫酸銨2g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉1g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，甘蔗渣浸出液10ml/l(甘蔗渣與水以質(zhì)量比為1.5％混合，100℃煮2h后8000rpm離心得到浸出液)；
發(fā)酵換液培養(yǎng)基成分：葡萄糖100g/l，硫酸銨1g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉0.5g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，甘蔗渣浸出液10ml/l，ph4～5。
發(fā)酵方法步驟如下：
(1)平板活化：將凍存保藏的黑曲霉孢子接種到平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中35℃靜置培養(yǎng)3～4天活化。
(2)掛膜：用無(wú)菌水充分洗滌黑曲霉平板得到孢子懸液，轉(zhuǎn)接于裝有100ml固定化培養(yǎng)基的錐形瓶中，溫度32～35℃，轉(zhuǎn)速250～300rpm，培養(yǎng)24～56h，測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛取．?dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/l，則掛膜結(jié)束，將發(fā)酵液全部移出。
(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：將100ml的發(fā)酵換液培養(yǎng)基換入錐形瓶中，溫度32～35℃，轉(zhuǎn)速250～300rpm，培養(yǎng)72～96h。中途測(cè)定殘?zhí)呛浚?dāng)殘?zhí)呛康陀?g/l時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。
發(fā)酵結(jié)果由圖4所示，當(dāng)培養(yǎng)基中未添加植物浸出液時(shí)，由于缺乏黑曲霉固定化時(shí)所需的一些微量營(yíng)養(yǎng)因子，造成耗糖緩慢，檸檬酸產(chǎn)量很低。當(dāng)培養(yǎng)基中添加了植物浸出液之后，耗糖速率明顯上升，同時(shí)，檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到了81.4g/l，因此在固定化黑曲霉發(fā)酵時(shí)需要添加植物浸出液以保證足夠的營(yíng)養(yǎng)因子。
實(shí)施例12硅烷偶聯(lián)劑對(duì)載體固定化黑曲霉效果的影響
本實(shí)施例說(shuō)明硅烷偶聯(lián)劑對(duì)固定化黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的影響，為探討偶聯(lián)劑處理和未處理的纖維材料對(duì)黑曲霉固定化的影響，對(duì)比了添加未處理的載體和處理后的載體時(shí)固定化黑曲霉的發(fā)酵數(shù)據(jù)。
按實(shí)施例3的方法將聚醚多元醇進(jìn)行預(yù)處理，將處理過(guò)的聚醚多元醇材料以10g/l的添加量放入500ml錐形瓶中，作為生產(chǎn)檸檬酸的固定化介質(zhì)。同時(shí)，將未經(jīng)過(guò)處理的聚醚多元醇材料以10g/l的添加量放入500ml錐形瓶中，同樣作為生產(chǎn)檸檬酸的固定化介質(zhì)。
固定化培養(yǎng)基成分：葡萄糖50g/l，硫酸銨2g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉1g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，麩皮浸出液10ml/l(麩皮與水以質(zhì)量比為1.0％混合，100℃煮2h后8000rpm離心得到浸出液)；
發(fā)酵換液培養(yǎng)基成分：葡萄糖100g/l，硫酸銨1g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，硝酸鈉0.5g/l，硫酸鎂0.3g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，硫酸鋅0.05g/l，麩皮浸出液10ml/l，ph4～5。
發(fā)酵方法步驟如下：
(1)平板活化：將凍存保藏的黑曲霉孢子接種到平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中35℃靜置培養(yǎng)3～4天活化。
(2)掛膜：用無(wú)菌水充分洗滌黑曲霉平板得到孢子懸液，轉(zhuǎn)接于裝有100ml固定化培養(yǎng)基的錐形瓶中，溫度32～35℃，轉(zhuǎn)速250～300rpm，培養(yǎng)24～56h，測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛?。?dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/l，則掛膜結(jié)束，將發(fā)酵液全部移出。
(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：將100ml的發(fā)酵換液培養(yǎng)基換入錐形瓶中，溫度32～35℃，轉(zhuǎn)速250～300rpm，培養(yǎng)72～96h。中途測(cè)定殘?zhí)呛?，?dāng)殘?zhí)呛康陀?g/l時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。
發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，當(dāng)載體未經(jīng)過(guò)偶聯(lián)劑處理時(shí)，載體表面的疏水基團(tuán)較少，疏水力較弱，無(wú)法吸附黑曲霉孢子，大部分孢子仍然進(jìn)行游離培養(yǎng)，造成固定化效果較差，耗糖速度較慢，檸檬酸產(chǎn)量較低。當(dāng)添加了處理過(guò)的載體之后，84h糖已經(jīng)基本耗完，同時(shí)，檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到了85.2g/l，因此對(duì)固定化載體進(jìn)行硅烷偶聯(lián)劑預(yù)處理對(duì)固定化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸有著重要的作用。